何小姣，黃 崧

(1.武警重慶總隊醫(yī)院藥劑科，重慶 400061；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院急救創(chuàng)傷中心，重慶 400038)

藥物性肝損傷在臨床實踐中常常發(fā)生，其中以非甾體類抗炎藥物濫用最為常見[1-2]。對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)又名撲熱息痛，在臨床上主要用來解熱鎮(zhèn)痛、抗炎，然而因患者不遵醫(yī)囑、誤服或過量使用等，可引起肝小葉中央型細(xì)胞壞死，進(jìn)而引發(fā)一系列病理生理學(xué)改變，甚至肝衰竭死亡，是引起肝毒性的常見藥物之一[3-5]。研究新的肝保護(hù)藥物對APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷具有重要的臨床意義。

脂聯(lián)素是機(jī)體含量豐富的脂肪因子，在維持內(nèi)環(huán)境能量平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其可通過抑制糖異生而提高胰島素的敏感性，被認(rèn)為是治療糖尿病的有效靶點[6-7]。多項國內(nèi)外研究顯示，脂聯(lián)素在肥胖、代謝綜合征、非酒精性脂肪肝和動脈粥樣硬化的治療中均有良好的效果，能夠延緩疾病的發(fā)展進(jìn)程[7-11]。脂聯(lián)素除了具有代謝調(diào)節(jié)功能外，在炎癥的調(diào)節(jié)中也起著重要的作用。在肥胖患者中，脂聯(lián)素的下調(diào)與各種炎癥標(biāo)志物的升高有關(guān)[12]；在膿毒癥引起的急性肺損傷、急性缺血性腎損傷以及急性胰腺炎動物模型中，采用脂聯(lián)素干預(yù)均可抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而減輕炎癥損傷[13-15]；另外在體外細(xì)胞實驗中，脂聯(lián)素對體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均具有抗炎作用[16-17]。然而，因脂聯(lián)素半衰期短，限制了其在臨床上的開發(fā)應(yīng)用。AdipoRon是一種合成且半衰期長的小分子脂聯(lián)素受體激動劑，其藥物作用與脂聯(lián)素在治療糖尿病和動脈粥樣硬化中的有益作用相似，并且也能減輕脊髓損傷動物的炎癥反應(yīng)[18-20]。而其在APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制未見報道。因此，本研究探討AdipoRon對APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷、炎癥反應(yīng)、肝細(xì)胞凋亡和動物生存率的影響，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

APAP和AdipoRon購自Sigma公司(美國)；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司；內(nèi)參β-actin、Cleaved-Caspase-3一抗及二抗均購自Cell Signaling公司；凋亡原位檢測試劑盒購自美國羅氏公司；BCA蛋白定量分析試劑盒購自美國Thermo公司；化學(xué)發(fā)光ECL試劑盒購自美國Advantsta公司。

1.2 實驗動物與分組

雄性C57BL/6小鼠128只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購于陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2017-0002。在IVC動物房內(nèi)給予水、食物1周，12 h晝夜交替，環(huán)境溫度控制在(24±2)℃，待小鼠適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行實驗。所有動物實驗操作均嚴(yán)格按照大學(xué)動物實驗中心動物倫理規(guī)范進(jìn)行，并經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

動物實驗分組：48只C57BL/6小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、AdipoRon組、APAP模型組、AdipoRon低劑量(50 mg/kg)+APAP模型組、AdipoRon中劑量(100 mg/kg)+APAP模型組和AdipoRon高劑量(200 mg/kg)+APAP模型組，每組8只。AdipoRon低劑量+APAP模型組、AdipoRon中劑量+APAP模型組和AdipoRon高劑量+APAP模型組小鼠分別每天固定時間給予50、100和200 mg/kg DSMO∶食用玉米油(1∶9)溶劑灌胃，AdipoRon組給予200 mg/kg DSMO∶食用玉米油溶劑灌胃，對照組和APAP模型組給予等量DSMO∶食用玉米油溶劑灌胃，連續(xù)3 d后，參考文獻(xiàn)[2]建立急性肝損傷模型，禁食水后腹腔注射APAP(400 mg/kg)，6 h后麻醉處死小鼠，收集血清和肝組織備用。

1.3 生存實驗

80只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組20只：正常對照組(給予等量DSMO∶食用玉米油溶劑)、AdipoRon組(200 mg/kg)、APAP模型組(400 mg/kg)、AdipoRon(200 mg/kg)+APAP模型組，觀察并記錄各組小鼠72 h生存率，采用Kaplan-Meier法繪制小鼠生存率曲線圖。

1.4 肝損傷相關(guān)指標(biāo)檢測

按照試劑盒說明書操作要求，首先制備上樣樣本(根據(jù)實際情況稀釋相應(yīng)倍數(shù))，依次加樣與相應(yīng)試劑，直至最后一步顯色，酶標(biāo)儀下相應(yīng)波長得到OD值，根據(jù)換算公式得出ALT、AST、LDH、TBIL和MPO的含量。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清TNF-α含量

按酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒說明書提前制作加樣樣本，根據(jù)操作步驟，依次完成各種試劑與上樣樣本的加樣，直至最后一步顯色，記錄酶標(biāo)儀450 nm波長下各樣本OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算各樣本實際含量。

1.6 HE染色觀察肝組織結(jié)構(gòu)

在4%多聚甲醛中固定肝組織，依序脫水、包埋、切片、HE染色、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)并記錄保存。

1.7 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡

按照產(chǎn)品說明及操作步驟，逐步完成每一項操作，直至末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)最終產(chǎn)生深棕色沉淀物(即凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核染成棕黃色)，然后切片用蘇木精輕度復(fù)染，光學(xué)顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)并記錄保存。

1.8 Western blot法檢測Caspase-3蛋白水平

根據(jù)蛋白提取試劑盒說明書，稱取相同質(zhì)量于-80 ℃儲存的肝組織，冰上超聲勻漿，以低溫高速12 000 g離心10 min后，取上清液制作蛋白上樣樣本，制備12.5%濃度的SDS-PAGE膠，恒壓80 V電泳，250 mA電流電轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃冰箱孵育一抗(1∶1 000或1∶4 000)過夜，第2天室溫下與相應(yīng)二抗(1∶2 000)孵育，ECL發(fā)光，U盤保存圖片，后期根據(jù)圖片中條帶灰度值檢測目的蛋白相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 AdipoRon改善APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷

與對照組相比，AdipoRon組小鼠血清各生化指標(biāo)均無明顯變化(P>0.05)，APAP模型組ALT、AST、TBIL和LDH水平明顯升高(P<0.05)；與APAP模型組相比，AdipoRon高劑量+APAP模型組的ALT、AST、TBIL和LDH水平均下降，AdipoRon中劑量+APAP模型組的ALT、AST水平下降，AdipoRon低劑量+APAP模型組僅AST水平下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。HE染色結(jié)果顯示，對照組肝細(xì)胞形態(tài)正常，無變性壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝索、肝竇分界明顯；APAP模型組肝組織局部肝細(xì)胞腫脹、變性壞死，小葉結(jié)構(gòu)遭到明顯破壞，肝條索結(jié)構(gòu)模糊甚至消失，中央靜脈或其周圍存在大量紅細(xì)胞及相應(yīng)壞死病灶，并伴隨炎性細(xì)胞浸潤；AdipoRon低、中、高劑量處理后各組肝組織充血腫脹減輕，肝條索走向變清晰，細(xì)胞壞死面積明顯減少，表明APAP可使肝組織產(chǎn)生嚴(yán)重的組織病理學(xué)變化，而AdipoRon干預(yù)后可改善組織病理學(xué)表現(xiàn)(圖1)。在動物生存率分析實驗中，因AdipoRon(200 mg/kg)+APAP模型組生化指標(biāo)均顯著降低，故采用高劑量AdipoRon干預(yù)做生存率分析，結(jié)果顯示AdipoRon(200 mg/kg)+APAP模型組72 h的生存率高于APAP模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 各組小鼠肝組織HE染色結(jié)果(×200)

表1 各組小鼠血清ALT、AST、TBIL、LDH含量比較

*:與APAP模型組比較，P<0.05

2.2 AdipoRon減輕APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷炎癥反應(yīng)

與對照組相比，APAP模型組小鼠血清TNF-α水平明顯升高(P<0.05)；與APAP模型組相比，AdipoRon高劑量+APAP模型組血清TNF-α水平明顯降低(P<0.05)，而AdipoRon中、低劑量處理組血清TNF-α水平無明顯變化(P>0.05)。與對照組相比，APAP模型組肝組織中MPO水平明顯升高；與APAP模型組相比，AdipoRon高劑量+APAP模型組肝組織中MPO水平降低，而AdipoRon中、低劑量處理組MPO水平無明顯變化(P>0.05)，見表2。

表2 各組小鼠TNF-α、MPO含量比較

2.3 AdipoRon通過抑制Caspases-3蛋白激活減輕肝細(xì)胞凋亡

APAP模型組肝組織中可見大量TUNEL陽性的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核呈褐色；AdipoRon高劑量+APAP模型組細(xì)胞核中TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量減少(圖3)。Western blot結(jié)果表明，APAP模型組Cleaved-Caspase-3含量高于對照組，而AdipoRon高劑量+APAP模型組Cleaved-Caspase-3含量低于APAP模型組(P<0.05)，見圖4。

圖3 各組小鼠肝組織TUNEL染色結(jié)果比較(×200)

*:與對照組比較，P<0.05；#:與APAP模型組比較，P<0.05

3 討論

肝是人體最大的代謝與免疫器官，在維護(hù)機(jī)體健康中發(fā)揮著重要作用[21]。藥物性肝損傷在臨床上時有發(fā)生，而APAP作為解熱鎮(zhèn)痛藥物，在臨床實踐中被廣泛使用，若使用不當(dāng)，可能會引發(fā)急性肝細(xì)胞損傷，甚至導(dǎo)致不可逆性肝衰竭而死亡[22]。因此，研究藥物性肝損傷的發(fā)病機(jī)理及新型保肝藥物對于制定臨床治療策略尤為重要。

脂聯(lián)素是一種重要的脂肪因子，在代謝和炎癥中發(fā)揮著多種調(diào)節(jié)作用[7-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖患者中脂聯(lián)素不僅可以調(diào)節(jié)糖脂代謝，而且可以抑制各種炎癥標(biāo)志物的升高[12]。還有研究顯示，脂聯(lián)素可以在體內(nèi)外發(fā)揮抗炎作用[13-17]。然而脂聯(lián)素半衰期短，導(dǎo)致其臨床開發(fā)應(yīng)用受到限制。AdipoRon是一種小分子脂聯(lián)素受體激動劑，可在糖尿病等多種代謝性疾病中發(fā)揮改善作用[18]。多項研究顯示AdipoRon可減輕炎癥損傷，抑制促炎細(xì)胞因子的分泌[12-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，AdipoRon能抑制APAP誘導(dǎo)的小鼠ALT、AST、TBIL和LDH升高，減輕肝細(xì)胞損傷，減少炎癥因子分泌，同時提高小鼠生存率。因此，AdipoRon可能在APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，這對于臨床肝保護(hù)藥物研發(fā)具有潛在的應(yīng)用價值。

在APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中，促炎細(xì)胞因子TNF-α的誘導(dǎo)在肝損傷的病理發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用[23]。而體內(nèi)外的多項研究均顯示AdipoRon具有抗炎作用[13-17]，且AdipoRon對腎小管上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞中TNF-α的產(chǎn)生均具有抑制作用[17，24-25]。在本研究中，AdipoRon可抑制APAP誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α，其結(jié)果與MPO的結(jié)果相一致，MPO活性的增加被認(rèn)為是炎癥損傷中中性粒細(xì)胞活化和積聚的代表性指標(biāo)，AdipoRon高劑量+APAP模型組MPO的含量顯著低于APAP模型組，表明AdipoRon的抗炎作用能夠減輕APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷。

脂聯(lián)素不僅具有抗炎作用，而且在多種疾病中發(fā)揮著抗凋亡作用。多項研究表明，脂聯(lián)素可以減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[26-28]。而在動物實驗中也表現(xiàn)出相同的作用，其可抑制缺血后心肌細(xì)胞凋亡和糖尿病誘導(dǎo)的腎細(xì)胞凋亡[29-30]。本研究采用AdipoRon預(yù)處理后，Western blot結(jié)果顯示AdipoRon可抑制肝Caspases凋亡蛋白的激活，抑制Caspase-3的裂解，并減少TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量。因此，AdipoRon對APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷的保護(hù)作用可能與其抗炎和抗凋亡有關(guān)。

綜上所述，AdipoRon可降低APAP誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡，從而減輕肝損傷，提高生存率。AdipoRon可能成為一種治療急性肝炎的潛在藥物，但其在急性肝炎中起保護(hù)作用的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。