王 柳, 董 伊, 曹 雷, 孫玉明, 李悅青, 趙偉杰,3*

(1. 大連理工大學化工與環(huán)境生命學部化工學院, 遼寧 大連 116024; 2. 大連理工大學化學分析測試中心, 遼寧 大連 116024; 3. 大連理工大學精細化工國家重點實驗室, 遼寧 大連 116024)

光動力療法(PDT)是一種基于光敏劑的非侵入性腫瘤治療方法[1]。PDT可以有效地和選擇性地破壞腫瘤組織而不損傷周圍健康組織,因此獲得了越來越多的關注[2,3]。二氫卟吩類光敏劑是目前研究較多的腫瘤光動力治療藥物,主要包括二氫卟吩e6(chlorin e6)及其衍生物[4-6]。此類光敏劑具有組分單一、結(jié)構明確、腫瘤攝入率高、光動力作用強和毒性低等優(yōu)點[7]。

本課題組前期[8]成功從云南程海湖螺旋藻粉中提取并制備了程海二氫卟吩(Chenghai chlorin, CHC,結(jié)構同二氫卟吩e6)，同時對CHC進行結(jié)構修飾,通過烯烴復分解反應引入甲氧基苯基[9],使用碳二亞胺類縮合劑(EDCI)區(qū)域選擇性地引入天冬氨酸側(cè)鏈,合成了具有兩親性的二氫卟吩衍生物32-(4-甲氧基苯基)-152-天冬氨酸-二氫卟吩e6,編號為DYSP-C34(結(jié)構見圖1)。除上述二氫卟吩類光敏劑的優(yōu)點外,DYSP-C34還彌補了大多數(shù)光敏劑水溶性較差的缺陷,適合研制應用于臨床注射的水針劑。另外,光敏劑在腫瘤組織蓄積和滯留的能力直接影響光動力療法殺傷腫瘤的效果。因此,DYSP-C34的藥代動力學及腫瘤組織分布特性研究對其臨床合理用藥和藥效學方面具有重要的指導意義。

圖 1 DYSP-C34的結(jié)構式Fig. 1 Structures of 32-(4-methoxyphenyl)-152- aspartyl-chlorin e6 (DYSP-C34)

本實驗將采用HPLC-UV方法定量測定大鼠血漿中的DYSP-C34,并評價方法的特異性、準確性、精密度和穩(wěn)定性,探究DYSP-C34在大鼠體內(nèi)的藥代動力學及荷瘤小鼠組織中的分布情況。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀、2489UV/Vis紫外檢測器(美國Waters公司); BT224S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司); MG-2200氮氣吹掃儀(東京理化株式會社); D1008小型離心機(大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司); FSH-2A高速可調(diào)均質(zhì)機(常州金壇良友儀器有限公司); Milli-Q型超純水機(美國Millipore公司)。

光敏劑DYSP-C34為實驗室自合成,純度為98.48%。內(nèi)標二氫卟吩e6三甲酯(CHCTME)為實驗室自合成,結(jié)構見附圖1(詳見http://www.chrom-China.com),純度為96.64%。甲醇(美國Fisher Scientific公司)為色譜純;二氯甲烷(天津市進豐化工有限公司);四丁基磷酸氫銨(純度98%,安耐吉化學股份有限公司,批號:DX5REU4Q)為分析純;二甲基亞砜(DMSO,美國Amresco公司)為生物純;0.9%氯化鈉注射液(遼寧民康制藥有限公司,批號:A190510B-2);肝素鈉(大連美侖生物技術有限公司)。

Sprague Dawley(SD)大鼠,雄性,無特定病原體(SPF),體重220～250 g; Institute of Cancer Research(ICR)小鼠,雄性,周齡為6～8周,SPF級,體重18～25 g,由本溪長生生物股份有限公司提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)2015-0001。

本實驗采用小鼠肝癌細胞(hepatoma-22, H22,由國家實驗細胞資源共享平臺提供)構建小鼠皮下異位移植瘤模型。使用含有10%血清(PANTMSERATECH No. ST30-3302)、含1%青霉素的鏈霉素溶液(HyClone, No. SV30010)的RPMI 1640(Gibco, No. C11875500BT)培養(yǎng)基將細胞在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。

1.2 標準溶液配制

DYSP-C34標準溶液:稱取DYSP-C34 40.0 mg,加入適量生理鹽水溶解,在25 mL棕色容量瓶中用生理鹽水定容,制得1.6 mg/mL標準儲備液,置于-20 ℃冰箱避光保存,備用。

CHCTME標準溶液:稱取CHCTME 10.0 mg,加入適量DMSO溶解,在10 mL棕色容量瓶中用DMSO定容,制得1.0 mg/mL標準儲備液,置于-20 ℃冰箱避光保存,備用。

1.3 色譜條件

色譜柱:Unitary C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,華普科儀(大連)科技有限公司);柱溫:40 ℃;流動相:(A)甲醇和(B)5 mmol/L四丁基磷酸氫銨緩沖鹽溶液;流速:1 mL/min。梯度洗脫程序:0～10 min, 70%A～95%A; 10～15 min, 95%A～100%A; 15～20 min, 100%A。進樣量:20 μL;檢測波長:400 nm。

1.4 造模及給藥

1.4.1大鼠給藥

選取6只健康雄性SD大鼠,稱重,按照16 mg/kg的給藥劑量尾靜脈注射DYSP-C34標準溶液,大鼠在給藥前禁食12 h,自由飲水。

1.4.2荷瘤小鼠造模及給藥

將H22小鼠肝癌細胞(3×105個/只)接種于ICR小鼠右側(cè)背部皮下,正常飼養(yǎng)并密切觀察ICR小鼠的健康狀況。待腫瘤體積生長到100～150 mm3(一般情況下為接種后8 d左右),可用作組織分布研究。荷瘤小鼠稱重后,按照16 mg/kg的給藥劑量尾靜脈注射DYSP-C34標準溶液,給藥前禁食12 h,自由飲水。

1.5 生物樣品收集與處理

1.5.1血漿樣品

大鼠給藥后,分別于5、15、30 min以及1、1.5、2、4、6、12、24 h自大鼠眼后靜脈叢取血0.2 mL,置于含有肝素鈉的離心管內(nèi),以8 000 r/min離心5 min后取上層血漿,于-80 ℃冰箱冷凍保存,分析前,于室溫下解凍。

取0.1 mL解凍后的血漿,置于2 mL離心管中,依次加入0.1 mL生理鹽水、5 μL CHCTME標準溶液、200 μL 0.1 mol/L磷酸、0.5 mL甲醇和1 mL二氯甲烷溶液,充分振蕩,以8 000 r/min離心5 min,取下層清液于2 mL離心管中,氮氣吹掃(50 ℃)至無液體剩余,加入1 mL初始流動相(甲醇-四丁基磷酸氫銨(7∶3, v/v))溶液復溶,0.45 μm濾膜過濾,然后進行HPLC分析。

1.5.2組織樣品

在給藥后1、2、4、6、8、12 h脫頸處死小鼠,取心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟以及腫瘤組織,置于生理鹽水中清洗,濾紙擦干后稱重。加入4倍體積的生理鹽水,剪碎組織勻漿后取100 μL勻漿液,置于2 mL離心管中。按1.5.1節(jié)方法沉淀蛋白質(zhì)及提取藥物。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

二氫卟吩衍生物是一類強熒光物質(zhì),已有許多報道采用熒光分析方法檢測生物樣品中的二氫卟吩類光敏劑[10,11]。但環(huán)境因素可能會對其熒光光譜的位置和強度產(chǎn)生強烈影響,熒光效率也易受溫度、溶劑和酸度影響[12]。DYSP-C34是由3個吡咯環(huán)和1個還原的吡咯環(huán)組成的具有共軛π鍵體系的大雜環(huán)分子,這些吡咯環(huán)通過4個亞甲基鍵連接。由于強共軛體系,DYSP-C34在400 nm和660 nm的波長處具有很強的紫外吸收,使得直接的紫外檢測法具有足夠的敏感性[12,13]。與660 nm相比,DYSP-C34在400 nm的吸收更強,故將檢測波長設置為400 nm。

二氫卟吩類光敏劑DYSP-C34的合成路線見附圖1,核磁、質(zhì)譜數(shù)據(jù)見附圖2～4。由附圖1可以發(fā)現(xiàn),通過結(jié)構修飾后的DYSP-C34含有多個羧基,極性較大,并具有一定酸性。選擇常規(guī)流動相體系甲醇-水或乙腈-水時,DYSP-C34在C18柱上沒有保留。為了獲得適當?shù)谋Ａ魰r間,將離子對試劑(四丁基磷酸氫銨)加入到流動相中,DYSP-C34的羧基離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物,在非極性固定相中溶解度增大,從而使其分離效果改善,并確定最優(yōu)色譜條件(見1.3節(jié))。在此條件下,空白和加標大鼠血漿樣品的色譜圖見圖2。可以看出,樣品和內(nèi)標經(jīng)色譜分離后,DYSP-C34的保留時間為8.0 min左右,內(nèi)標的保留時間為12.2 min左右,且不受血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾,峰形良好,并得到很好的分離。

圖 2 (a)空白大鼠血漿樣品、(b)空白大鼠血漿加標準品(120 μg/mL)和(c)尾靜脈注射DYSP-C34 (16 mg/kg)2 h后大鼠血漿樣品的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of (a) blank rat plasma, (b) blank spiked rat plasma (120 μg/mL) and (c) a rat plasma sample obtained 2 h after intravenous administration of 16 mg/kg DYSP-C34

2.2 方法學考察

2.2.1線性關系

取空白大鼠血漿0.1 mL,加入0.1 mL不同濃度的DYSP-C34,使樣品中DYSP-C34的質(zhì)量濃度分別為1、4、8、16、40、80、120和200 μg/mL。按上述1.5.1節(jié)所述方法進行樣品處理和HPLC測定。采用加權最小二乘法計算標準曲線方程,以DYSP-C34與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標(y), DYSP-C34的質(zhì)量濃度為橫坐標(x, μg/mL),得到的回歸方程為y=0.101 0x+0.139 8,判定系數(shù)(r2)為0.994 1。

采用同樣方法測定并計算DYSP-C34在荷瘤小鼠組織中的線性回歸方程。結(jié)果見附表1,不同組織中的DYSP-C34在1～200 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系,r2均大于0.99。

2.2.2回收率與精密度

提取回收率為空白血漿中加入藥物經(jīng)提取后的藥物響應值與空白血漿處理后加入相同量藥物響應值的比值。取大鼠空白血漿0.1 mL,加入0.1 mL不同含量的DYSP-C34,使藥物的質(zhì)量濃度分別為8、40、120 μg/mL;用空白血漿提取液分別配制8、40、120 μg/mL的DYSP-C34藥物溶液,分別對上述溶液進行分析。如表1所示,大鼠血漿在高、中、低3個水平下的提取回收率為65.89%～74.39%, RSD≤3.61%,說明該方法可靠。

表 1 DYSP-C34在大鼠血漿中3個水平下的提取回收率(n=3)

在大鼠空白血漿中加入DYSP-C34標準品溶液,配制成8、40、120 μg/mL的樣品溶液,按上述1.5.1節(jié)方法處理樣品并進行HPLC測定。同一天內(nèi)測定6次,連續(xù)測定3 d,分別考察日內(nèi)和日間精密度。實驗結(jié)果見表2,該方法的日間和日內(nèi)精密度均在5%以內(nèi),符合2015版《中華人民共和國藥典》對于生物樣品分析的要求[14]。以上結(jié)果表明該方法重復性良好,可應用于大鼠血漿中DYSP-C34的測定。

表 2 DYSP-C34在大鼠血漿中的日內(nèi)及日間精密度(n=6)

2.2.3穩(wěn)定性

取大鼠空白血漿0.1 mL,加入0.1 mL不同濃度的DYSP-C34,使藥物的質(zhì)量濃度分別為8、40、120 μg/mL,將樣品室溫放置(2 h)、反復凍融3次或者放入-80 ℃冰箱冷凍保存30 d后,按上述1.5.1節(jié)所述方法處理樣品并進行HPLC測定,考察DYSP-C34在大鼠血漿中的穩(wěn)定性。實驗結(jié)果顯示,高、中、低3個水平的血漿樣品在上述條件下測定的精密度均在10%以內(nèi),表明DYSP-C34血漿樣品在儲存及測定過程中均是穩(wěn)定的。

2.3 DYSP-C34在大鼠體內(nèi)的藥代動力學

采用藥代動力學計算軟件DAS 2.0[15],按照非室模型進行擬合并計算藥代動力學參數(shù)。在大鼠中單次尾靜脈注射DYSP-C34(16 mg/kg)后,DYSP-C34的平均血藥濃度隨時間變化曲線如圖3所示,主要藥代動力學參數(shù)見附表2。DYSP-C34尾靜脈注射后的半衰期t1/2z為6.984 h,藥-時曲線下面積AUC(0-∞)為1 025.01 h·mg/L,平均駐留時間MRT(0-∞)為9.19 h。藥物在大鼠血漿中的半衰期較長,表明藥物在血漿中清除較慢,可以維持穩(wěn)定的血藥濃度,有利于延長體內(nèi)循環(huán)時間,這對臨床給藥方案具有一定的指導意義。因此,在臨床應用中,可以通過單次靜脈給藥的方式來施用DYSP-C34。

圖 3 大鼠單次尾靜脈注射16 mg/kg DYSP-C34后的平均 血藥濃度-時間曲線(n=6)Fig. 3 Mean plasma concentration-time profiles after a single intravenous administration of DYSP-C34 with the dose of 16 mg/kg (n=6)

2.4 DYSP-C34在荷瘤小鼠體內(nèi)的組織分布

將收集的小鼠組織按照1.5.2節(jié)處理并進行HPLC分析,根據(jù)DYSP-C34在荷瘤小鼠組織中的線性回歸方程(見附表1)計算得到DYSP-C34在荷瘤小鼠組織中濃度隨時間變化曲線,如圖4所示。結(jié)果表明,給藥后1 h, DYSP-C34在小鼠心、肝、脾、肺、腎以及腫瘤組織中均有分布。隨著時間的增加,DYSP-C34在肝臟組織中的濃度均高于其他組織,提示其主要通過肝臟代謝;其次，腎臟中DYSP-C34達峰時濃度高于心臟、脾和肺,提示腎臟可能為DYSP-C34的主要排泄器官。

圖 4 荷瘤小鼠單次尾靜脈注射16 mg/kg DYSP-C34后 組織中的藥物濃度隨時間變化曲線(n=5)Fig. 4 Concentration-time profiles of DYSP-C34 in tumor- bearing mice tissues after a single intravenous administration with the dose of 16 mg/kg (n=5)

腫瘤組織內(nèi)的DYSP-C34含量在給藥后總體呈現(xiàn)出隨時間延長而上升的趨勢,在6～12 h后,腫瘤組織中DYSP-C34含量變化不十分明顯,維持在一個相對穩(wěn)定的水平。DYSP-C34可以在腫瘤組織中蓄積,使其作用時間延長。在6 h時,心臟、脾和肺的DYSP-C34濃度小于腫瘤組織,因此可以選擇該時間點作為異位移植瘤小鼠的光動力光照處理時間。需要注意的是,DYSP-C34在肝臟和腎臟組織從2 h之后一直處于較高濃度,所以DYSP-C34介導的光動力療法用于肝癌和腎癌的治療時一定要注意其導致的副作用。

3 結(jié)論

建立并驗證了一種簡便、快速、準確的HPLC-UV方法測定大鼠血漿中新型二氫卟吩光敏劑DYSP-C34,成功測定了大鼠尾靜脈注射16 mg/kg DYSP-C34后的血藥濃度,并運用此方法檢測DYSP-C34在荷瘤小鼠不同組織樣品中的濃度。結(jié)果表明,DYSP-C34是一種體內(nèi)循環(huán)時間長、腫瘤組織蓄積性好、在體內(nèi)部分組織代謝速率快的光敏劑。單次靜脈注射給藥后,DYSP-C34在大鼠體內(nèi)的血藥濃度和荷瘤小鼠組織中的藥物濃度變化結(jié)果,為后續(xù)的藥效學研究和臨床使用提供了用藥劑量、光照時間、光毒副作用等方面的參考和依據(jù)。

致謝 感謝大連理工大學化工學院藥學系潘悅在荷瘤小鼠模型構建方面給予的幫助與指導。感謝廣州意斯生物工程科技有限公司提供技術支持。