陳桂園，王 巧，黃利全，崔飛飛，朱樓英，丁明星

失禁病人最常見的并發(fā)癥之一是由于暴露于尿液或糞便引起的皮膚病，其被稱為失禁性皮炎(incontinence-associated dermatitis，IAD)[1]。當尿液或糞便接觸會陰或生殖器周圍皮膚時，皮膚會出現(xiàn)皮疹、紅斑、水皰或糜爛[2]。IAD廣泛存在于久臥病人，老年人和重癥病人中。IAD的危險因素包括失禁性化學刺激物(例如蛋白酶和脂肪酶)、皮膚表面pH值和相關(guān)微生物的變化(例如由白色念珠菌引起的真菌感染)、反復的皮膚清潔活動和機械因素(例如摩擦)[3]。據(jù)報告，IAD在ICU的發(fā)病率高達50%[4]。此外，由于老年人經(jīng)常有大小便失禁現(xiàn)象，因此該類人群IAD的發(fā)病率特別高[5]。IAD發(fā)生后會伴有不適感，例如刺痛、發(fā)癢、灼痛和疼痛，對病人的生活質(zhì)量產(chǎn)生負面影響。因此，迫切要求制定有效的護理策略。IAD的常規(guī)護理主要是通過清潔或使用皮膚屏障產(chǎn)品(如無痛皮膚保護膜)以避免重復接觸，并從該區(qū)域去除尿液或糞便[6]。然而，這種護理不會直接促進IAD的康復。因此，應盡早提供有效的IAD皮膚護理方案[7]。由于長時間的IAD會增加細菌感染、潰瘍和壓瘡等風險，此外，由于知識和臨床證據(jù)的不足，在預防和管理IAD時，清潔或皮膚屏障產(chǎn)品的選擇仍具有挑戰(zhàn)性[8]。

本研究構(gòu)建了IAD大鼠模型并比對了3種皮膚護理方案(氧化鋅、無痛皮膚保護膜和硅酮敷料)的效果，其中，硅酮敷料取得了最好的治療效果?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 材料 63只7～8周齡的雄性SD大鼠(體重為150～220 g)購自金華市實驗動物中心。人工尿液的配制方法如下：使用Millipore Direct Q5凈化系統(tǒng)生成超純水。將尿素25 g(實驗室試劑級，>99%)、氯化鈉9 g(實驗室試劑級，>99%)、氯化銨3 g(分析試劑級，>99.9%)、亞硫酸鈉3 g(分析試劑級，>98%)、無水正磷酸氫二鈉2.5 g(實驗室試劑級，>99%)和肌酐2 g(>99%)溶解在1 000 mL超純水中制備合成尿液。在合成尿液中添加入適當體積的25%氫氧化銨溶液稀釋至25 mL，配制成1%氫氧化銨合成尿液作為刺激物。切片機(型號：KD-3358-Ⅵ)購自科迪公司。顯微鏡(型號：BX53)購自日本Olympus公司。電子天平(型號：PL-203)購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。二甲苯(貨號：10023418)，無水乙醇(貨號：10009259)購自上海國藥集團化學試劑有限公司。蘇木素(貨號：B600020)、HRP標記山羊抗小鼠二抗(貨號：SA00001-1)、NF-κB P65抗體(貨號：10745-1-AP)、STAT1抗體(貨號：10144-2-AP)、GAPDH抗體(貨號：60004-1-Ig)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。伊紅染液購自美國Sigma公司。4%多聚甲醛中性組織固定液購自武漢谷歌生物科技有限公司。中性樹膠(貨號：G1403)購自生工生物科技有限公司。MHC-II抗體(貨號：ab23990)、Phospho-STAT1(Ser727；貨號：ab126598)購自美國Abcam公司。辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔鼠通用二抗(貨號：K5007)和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(貨號：K5007)購自上海DAKO公司。RIPA裂解液(貨號：P0013B)購自上海碧云天公司。Phospho-NF-κB p65(Ser536；3033T)購自CST公司。

1.2 構(gòu)建失禁性皮炎大鼠模型 將9只大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為3組：對照組、胰蛋白酶誘導的IAD模型組和合成尿聯(lián)合胰蛋白酶誘導的IAD模型組。將濃度為4 g/100 mL的胰蛋白酶液體或合成尿聯(lián)合胰蛋白酶在氫氧化鈉的調(diào)節(jié)下，調(diào)至pH值為7.5～8.5。浸泡棉球，將濕潤棉球覆蓋在大鼠背部選定區(qū)域，用3M透明輔料覆蓋并用彈性繃帶固定，建模維持4 d，每天分別于上午、下午各1次，向大鼠的棉球部位添加對應的溶液，保持棉球的潮濕，持續(xù)覆蓋于大鼠背部。1～4 d每天進行失禁性皮炎評分和皮膚pH值檢測，做好記錄。4 d后拆除繃帶，宏觀觀察IAD的嚴重程度，包括皮炎發(fā)生范圍的大小以及嚴重程度的評分，并做好記錄。在戊巴比妥鈉腹腔注射以麻醉大鼠的條件下，進行所有程序，以避免引起動物不適。對照組用生理鹽水浸泡過的棉球進行相同的處理。本研究得到了金華市食品藥品檢驗檢測研究院實驗動物倫理委員會的批準。

1.3 評估失禁性皮炎大鼠模型是否構(gòu)建成功 根據(jù)Borchert[9]描述的IAD嚴重程度評估工具量表，在干預前和干預后每天定時分別觀察評估1次，并進行干預前后的皮炎恢復程度的比較。IAD根據(jù)易發(fā)生部位的皮膚發(fā)紅的程度，皮膚缺失及皮疹3個方面來評估。評分標準，0分無;1分粉色;2分出現(xiàn)紅色，不伴有皮疹和皮膚缺失;3分出現(xiàn)皮疹;4分出現(xiàn)任何程度的皮膚缺失。

1.4 實驗分組 造模成功后，將54只大鼠按隨機數(shù)字表法分為9組：對照組、模型組(胰蛋白酶造模)、模型+氧化鋅組、模型+無痛皮膚保護膜組、模型+硅酮敷料組、聯(lián)合模型組(人工尿液聯(lián)合胰蛋白酶造模)、聯(lián)合模型+氧化鋅組、聯(lián)合模型+無痛皮膚保護膜組和聯(lián)合模型+硅酮敷料組，每組6只。對照組和模型組的處理方式如1.2所述。氧化鋅組的大鼠：超過尿便污染皮膚范圍1 cm處均勻涂抹一次氧化鋅軟膏，每日2次；無痛皮膚保護膜組：距尿便污染皮膚范圍10～15 cm，超過尿便污染皮膚范圍l cm處，噴涂1次皮膚保護膜，每日2次；硅酮敷料組：距尿便污染皮膚范圍10～15 cm，超過尿便污染皮膚范圍l cm處，噴涂1次硅酮敷料，每日2次。

每天對各組大鼠失禁性皮炎的嚴重程度進行評估(如1.3所述)并檢測皮膚pH值，做好記錄。實驗4 d后取皮膚組織標本進行相關(guān)指標觀察。

1.5 蘇木精-伊紅(H&E)染色 新鮮的皮膚組織樣本在4%多聚甲醛中固定24 h以上。脫水和石蠟包埋后，將組織切成4 μm的厚度。將石蠟切片脫蠟后進行H&E染色。用蘇木精將切片染色5 min，并用0.5%曙紅溶液染色2 min。脫水后將切片用中性樹膠封片，并置于顯微鏡下觀察。

1.6 免疫組化 皮膚組織切片在室溫下用山羊血清封閉30 min。將切片與MHC-II抗體在4 ℃孵育過夜，然后與HRP標記山羊抗兔鼠通用二抗室溫孵育30 min。切片經(jīng)DAB染色5～10 min后，蘇木精將細胞核復染3～5 min。脫水和透明后將切片用中性樹膠封片。最后，顯微鏡鏡檢并圖像采集分析。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡 組織經(jīng)200 μL RIPA裂解物在4 ℃裂解30 min。以每分鐘12 000轉(zhuǎn)離心10 min后，收集上清液并保存在于-80 ℃。BCA定量試劑盒評估蛋白質(zhì)的濃度。樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。在室溫下將膜用5%脫脂奶粉封閉2 h。然后，將膜與在4 ℃孵育過夜，然后與二抗在室溫下孵育1.5 h。ECL Plus發(fā)光試劑盒用于可視化蛋白質(zhì)條帶。Image J軟件用于定量蛋白質(zhì)的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 評估大鼠的皮炎嚴重程度和pH值 如圖1所示，與對照組的大鼠相比，胰蛋白酶或者人工尿液聯(lián)合胰蛋白酶誘導的IAD大鼠IAD嚴重程度評分顯著升高(P<0.000 1)。在胰蛋白酶誘導的大鼠模型中，經(jīng)無痛皮膚保護膜(P<0.01)或硅酮敷料(P<0.000 1)治療4 d后，IAD值顯著地降低；雖然，氧化鋅也降低了IAD值，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在人工尿液聯(lián)合胰蛋白酶的模型中，經(jīng)氧化鋅(P<0.01)、無痛皮膚保護膜(P<0.000 1)或硅酮敷料(P<0.000 1)治療4 d后，IAD值均顯著下降，但硅酮敷料的治療效果最顯著。此外，本研究檢測了大鼠皮膚的pH值。如圖2所示，在胰蛋白酶或者人工尿液聯(lián)合胰蛋白酶誘導的IAD模型中，大鼠皮膚的pH值高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1)。氧化鋅、無痛皮膚保護膜或硅酮敷料治療顯著地降低了IAD大鼠皮膚的pH值(P<0.000 1)。經(jīng)硅酮敷料治療后pH值下降最顯著。

****，####，&&&&表示P<0.000 1；##，&&表示P<0.01圖1 9組IAD大鼠皮炎的嚴重程度

****，####，&&&&表示P<0.000 1圖2 9組IAD大鼠皮膚的pH值

2.2 評估大鼠皮炎的病理改變 H&E染色用于檢測大鼠皮膚組織皮炎的病理改變。如圖3所示，對照組的大鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整。而胰蛋白酶模型組和人工尿液聯(lián)合胰蛋白酶模型組的大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)嚴重破壞，創(chuàng)面無表皮覆蓋，可見大量的炎性細胞浸潤。經(jīng)氧化鋅、無痛皮膚保護膜或硅酮敷料治療4 d后，IAD大鼠的皮膚組織出現(xiàn)層次分明的表皮、真皮結(jié)構(gòu)，但各組仍有不同程度的毛囊損壞和水腫。其中硅酮敷料治療組的IAD大鼠恢復效果最好。

圖3 H&E染色檢測各組IAD皮膚組織的病理改變(放大倍率：40×)

2.3 檢測大鼠皮膚組織中MHC-Ⅱ的表達 免疫組化實驗用于檢測大鼠皮膚組織中MHC-Ⅱ的表達情況。如圖4所示，對照組的大鼠皮膚組織中MHC-Ⅱ幾乎無表達。胰蛋白酶模型組和人工尿液聯(lián)合胰蛋白酶模型組的大鼠皮膚組織中MHC-Ⅱ的表達均顯著升高；聯(lián)合造模組的大鼠皮膚組織中MHC-Ⅱ的表達稍高于胰蛋白酶造模組。與模型組相比，氧化鋅、無痛皮膚保護膜、硅酮治療組的大鼠皮膚組織中MHC-Ⅱ的表達均有不同程度降低，其中硅酮敷料治療組降低的最顯著。

圖4 免疫組化檢測皮膚組織中MHC-Ⅱ的表達情況(放大倍率：200×)

2.4 檢測大鼠皮膚組織中NF-κB p65、p-NF-κB p65、STAT1和p-STAT1的表達 蛋白質(zhì)免疫印跡用于檢測大鼠皮膚組織中NF-κB p65、p-NF-κB p65、STAT1和p-STAT1的表達情況，結(jié)果如圖5所示。與對照組相比，在胰蛋白酶模型組和人工尿液聯(lián)合胰蛋白酶模型組的大鼠皮膚組織中NF-κB p65(P<0.000 1，見圖6)、p-NF-κB p65(P<0.000 1，見圖7)、STAT1(P<0.000 1，見圖8)和p-STAT1(P<0.000 1，見圖9)的表達水平顯著升高。經(jīng)無痛皮膚保護膜或硅酮敷料治療后，IAD大鼠皮膚組織中NF-κB p65、p-NF-κB p65、STAT1和p-STAT1的表達顯著降低(P<0.01)；其中，硅酮治療組中以上蛋白的降低水平最顯著。此外，氧化鋅治療組p-STAT1的表達低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖5 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測各組IAD大鼠皮膚組織中NF-κB p65、p-NF-κB p65、STAT1和p-STAT1的表達情況

****，####，&&&&表示P<0.000 1；###表示P<0.001； &&表示P<0.01圖6 蛋白免疫印跡定量檢測IAD大鼠和經(jīng)氧化鋅、無痛皮膚保護膜或硅酮敷料治療后的大鼠皮膚組織中NF-κB p65的表達情況

****，####，&&&&表示P<0.000 1；&&&表示P<0.001；##表示P<0.01圖7 蛋白免疫印跡定量檢測IAD大鼠和經(jīng)氧化鋅、無痛皮膚保護膜或硅酮敷料治療后的大鼠皮膚組織中p-NF-κB p65的表達情況

****，####，&&&&表示P<0.000 1；###表示P<0.001圖8 蛋白免疫印跡定量檢測IAD大鼠和經(jīng)氧化鋅、無痛皮膚保護膜或硅酮敷料治療后的大鼠皮膚組織中STAT1的表達情況

****，####，&&&&表示P<0.000 1；#，&表示P<0.05圖9 蛋白免疫印跡定量檢測IAD大鼠和經(jīng)氧化鋅、無痛皮膚保護膜或硅酮敷料治療后的大鼠皮膚組織中p-STAT1的表達情況

3 討論

IAD是臨床護理工作中最常見的問題之一。國內(nèi)外尚無治療IAD的金標準。目前，3M傷口保護膜是普遍應用的皮膚保護劑。但該類護理措施存在工序繁瑣、清潔不便等缺點[10]。因此，選擇合適的皮膚護理方案是解決該問題的核心。本研究建立了胰蛋白酶以及人工尿液聯(lián)合胰蛋白酶誘導的兩種IAD模型。與趙梓佳等[1]的研究結(jié)果一致，胰蛋白酶模型大鼠的皮炎嚴重程度的評分顯著高于對照組。同樣地，人工尿液聯(lián)合胰蛋白酶誘導的IAD大鼠出現(xiàn)嚴重的皮炎癥狀?？傮w來講，這兩種IAD模型制作簡單。

IAD的病因很復雜，與皮膚的化學和物理刺激有關(guān)。由尿液和糞便引起的pH值升高會增加角質(zhì)層腫脹和脂質(zhì)硬度的改變，從而增加皮膚的滲透性并降低皮膚的屏障保護功能[11]。此外，pH值的升高會增加細菌定植的風險，從而增加皮膚感染的風險[12]。在本研究中，經(jīng)氧化鋅、無痛皮膚保護膜或硅酮敷料治療4 d后，IAD大鼠的皮炎明顯緩解且pH值顯著降低。H&E染色結(jié)果表明，與對照組相比，模型組的大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)嚴重破壞，創(chuàng)面無表皮覆蓋，可見大量的炎性細胞浸潤。經(jīng)氧化鋅、無痛皮膚保護膜或硅酮敷料治療后，IAD大鼠皮炎明顯緩解。在先前的研究中，有研究觀察了氧化鋅軟膏在防治IAD中的效果。結(jié)果顯示，氧化鋅軟膏在防治IAD具有較好的治療效果[13]。研究表明，3M無痛保護膜可以有效地治療IAD并極大地減輕病人的痛苦[14]。Kyung Hee Park[15]發(fā)現(xiàn)，硅酮敷料能有效地減少IAD病人壓瘡的發(fā)生并改善皮炎的癥狀。本研究結(jié)果顯示，硅酮敷料治療IAD的效果最好。

本研究更深入地分析IAD的分子機制。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，IAD大鼠的皮膚組織中MHC-Ⅱ、NF-κB p65、p-NF-κB p65、STAT1和p-STAT1的表達顯著升高。其中，MHC-Ⅱ已被證實在皮炎的發(fā)病過程中扮演著重要的角色[16-18]。抑制NF-κB p65、p-NF-κB p65、STAT1和p-STAT1的表達可以有效地降低皮炎的嚴重程度[19-22]。經(jīng)氧化鋅、無痛皮膚保護膜或硅酮敷料治療后，以上蛋白質(zhì)的表達均顯著降低。其中，經(jīng)硅酮敷料治療的IAD大鼠的皮膚組織中MHC-Ⅱ、NF-κB p65、p-NF-κB p65、STAT1和p-STAT1表達降低的最明顯。這些結(jié)果表明，氧化鋅、無痛皮膚保護膜和硅酮敷料能夠有效地抑制炎癥相關(guān)的通路，進而改善皮炎的癥狀。

綜上所述，本研究構(gòu)建了由胰蛋白酶和人工尿液聯(lián)合胰蛋白酶誘導的IAD模型。 氧化鋅、無痛皮膚保護膜和硅酮敷料可以明顯改善IAD大鼠的皮炎癥狀。其中，硅酮敷料表現(xiàn)出最佳的治療效果。因此，這些干預措施值得進一步驗證。