符玉水 符元證 楊輝 鐘麗花 霍開明
(1.海南省婦女兒童醫(yī)學中心新生兒科,海南 海口 571924;2.中國醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學教研室,遼寧 沈陽 110013;3.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院兒科,海南 海口 570311)
變應性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)是一種常見的變態(tài)反應介導的炎癥性疾病,其特征是鼻塞、鼻充血、打噴嚏和鼻癢等[1]。據統(tǒng)計,AR在全球的發(fā)病率約為25%~35%,在我國AR的發(fā)病率不斷上升,它與其他炎癥性疾病如哮喘、鼻竇炎、過敏性結膜炎、滲出性中耳炎和腺樣體肥大等密切相關[2-3],其發(fā)病與多種因素有關,主要包括Th1/Th2細胞分化失衡、炎癥介質釋放及免疫球蛋白E升高[4]。甘草次酸(Glycyrrhetinic acid,GA)為甘草主要活性成分之一的五環(huán)三萜烯衍生物,具有與甘草酸相同的藥理作用,可發(fā)揮抗腫瘤、抗?jié)儭⒖寡滓约把泳徸陨砻庖咝约膊“l(fā)展的作用[5-7]。18β-甘草次酸鈉(18β-SGA)是甘草次酸的鈉鹽制劑,已有研究證明18β-SGA在抑制AR方面具有一定的可行性[8],但其治療AR的具體機制尚未明確,本研究擬通過構建AR 大鼠模型,進一步觀察18β-SGA對AR大鼠鼻黏膜的作用并探究相關分子機制,為闡明AR發(fā)病機制和探索新的AR治療途徑提供了依據,現(xiàn)報告如下。
1.1 實驗動物 清潔級Sprague-Dawley大鼠,7 日齡,體質量(18.4±2.2)g,購自中國醫(yī)科大學實驗動物中心。將新生SD幼鼠與母鼠同籠適應性喂養(yǎng),飼養(yǎng)箱環(huán)境設置為溫度25℃~28℃、濕度 60%~80%,給予光照與黑暗各12 h交替。本研究符合實驗動物3R原則,并經海南省婦女兒童醫(yī)學中心倫理委員會批準。
1.2 主要試劑 卵清蛋白(ovalbumin,OVA)和氫氧化鋁[Al(OH)3]干粉購自美國Sigma公司;伊紅染色液、蘇木素染色液、RIPA裂解液和BCA 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術公司;IL-2、IFN-γ、IgE、IL-4、IL-5大鼠特異性ELISA試劑盒購自購自上海西唐生物有限公司;免疫組織化學染色,抗體p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt購自北京博奧森生物技術有限公司;抗體histone H2、NF-κB p65、ICAM-1、TGF-β1、β-actin購自美國 Abcam 公司;HRP標記的山羊抗兔二抗購自上海碧云天生物技術公司。
1.3 方法
1.3.1 模型制作 參考文獻方法[9]建立大鼠變應性鼻炎(AR)模型,首先進行基礎致敏:在0.3 mg卵清蛋白(OVA)和30 mg 氫氧化鋁[Al(OH)3]中加入生理鹽水1 mL混勻,制成混懸液,腹腔內注射,隔日注射1次,共7次,對照組大鼠以等量生理鹽水進行腹腔注射;接著進行鼻腔激發(fā):以50 μL 的2% OVA滴鼻,采用微量進樣器從雙側鼻腔滴入,每天1次,共7次,對照組以等量生理鹽水滴入鼻腔。
1.3.2 分組與給藥 將50只新生SD幼鼠按照隨機數字表法分為五組,包括:對照組、模型組、18β-SGA 低劑量組、18β-SGA高劑量組和地塞米松組,每組10只。模型組、18β-SGA低劑量組、18β-SGA高劑量組和地塞米松組建立AR模型。造模完成后開始給藥治療,18β-SGA 低劑量組、18β-SGA高劑量組分別按照20 mg·kg-1、40 mg·kg-1進行腹腔注射,地塞米松組大鼠以1.5mg·kg-1進行腹腔注射,對照組和模型組同時注射生理鹽水。每日注射一次,共持續(xù)4 周。
1.3.3 變應性鼻炎癥狀評分 在處死大鼠前,采用5% OVA滴鼻,觀察30 min內大鼠噴嚏、鼻溢和搔鼻動作的行為,并采用疊加量化計分。①噴嚏:1~4個為1分,5~10個為2分,10個以上為3分。②流鼻涕:流至鼻孔前為1分,流出鼻孔為2分,流至面部計為3分。③撓癢:單前肢偶有撓鼻為1分,雙前肢撓鼻為2分,雙前肢不停撓鼻為3分。
1.3.4 ELISA 斷頸法處死各組大鼠,腹主動脈采血,室溫靜置2h,4℃低溫離心機以離心半徑為10cm、4000r/min離心15 min,獲取上清,使用大鼠特異性ELISA試劑盒檢測血清中IL-2、IFN-γ、IgE、IL-4及IL-5水平,步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
1.3.5 HE染色 處死大鼠后分離鼻骨前皮膚,咬除鼻骨,迅速取出雙側鼻腔黏膜組織,置于4%多聚甲醛中固定。將組織進行石蠟包埋,切成5 μm石蠟切片后,進行蘇木精-伊紅染色觀察組織學改變。切片采用二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,使用蘇木精染色5 min,流水沖洗后,伊紅染色3 min,流水再次沖洗,梯度乙醇脫水后,二甲苯透明10 min,中性樹膠封片,于顯微鏡下觀察鼻腔黏膜組織形態(tài)變化并拍照。
1.3.6 免疫組織化學染色 將鼻腔黏膜組織石蠟切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后,在0.3% 過氧化氫中處理 30 min,高溫(98℃)下加熱5 min,加入山羊血清室溫孵育1 h,加入兔抗ICAM-1(1∶100)、TGF-β1(1∶100)與NF-κB(1∶50),4℃孵育過夜。PBS 液洗后,加二抗室溫孵育1h。滴加 DAB 顯色,自來水洗滌,加蘇木素復染,二甲苯透明,中性樹膠封片,在光學顯微鏡下觀察圖像并拍照。
1.3.7 Western blot 將鼻黏膜組織充分剪碎,用 PBS清洗,加入RIPA裂解緩沖液提取總蛋白,通過BCA法測定蛋白質含量。以30μg蛋白的量加樣并通過10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白質,然后轉移至聚偏氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,TBST洗膜后,加入稀釋后的一抗p-PI3K(1∶1000)、PI3K(1∶1000)、p-Akt(1∶1000)、Akt(1∶1000)、NF-κB p65(1∶1000)以及histone H2(1∶1000)、β-actin(1∶1000),4℃下孵育過夜。次日,TBST洗膜,加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000),室溫下孵育1 h,TBST洗膜后,滴加ECL化學發(fā)光液顯色曝光,凝膠成像系統(tǒng)拍照,使用Image Pro-Plus分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行分析。
2.1 各組大鼠行為學評分結果 通過對各組大鼠觀察發(fā)現(xiàn),正常組大鼠未見明顯噴嚏、流涕表現(xiàn),偶有抓鼻;與正常組比較,AR組大鼠均出現(xiàn)明顯的煩躁不安、打噴嚏、流涕、頻繁抓鼻等現(xiàn)象,AR行為學評分顯著增加(P<0.01),且高于 5 分;與模型組比較,18β-SGA 低劑量組、18β-SGA高劑量組和地塞米松組大鼠打噴嚏、流涕、抓鼻等現(xiàn)象有所減輕,AR行為學評分均顯著下降(P<0.01),見表 1。
表1 各組大鼠行為學評分比較
2.2 各組大鼠鼻粘膜組織病理學觀察 HE染色結果顯示,在對照組大鼠的鼻粘膜組織中未見明顯的損傷,鼻黏膜組織結構整齊、有序排列;模型組大鼠鼻粘膜組織可見明顯的血管擴張、水腫和嚴重炎性細胞浸潤;18β-甘草次酸鈉低劑量組鼻黏膜組織仍有水腫,伴有輕度的炎癥細胞浸潤,但較模型組鼻粘膜組織病理變化得以改善,18β-甘草次酸鈉高劑量組鼻黏膜組織水腫、炎癥細胞浸潤的現(xiàn)象較18β-甘草次酸鈉低劑量組明顯減輕。地塞米松組鼻黏膜組織病理變化改善效果較18β-甘草次酸鈉低、高劑量組更好,見圖1。
圖1 各組大鼠鼻黏膜組織病理圖片(HE,200×)
2.3 各組大鼠血清Th1/Th2 細胞因子表達比較 ELISA 檢測結果顯示,模型組 IL-2、IFN-γ 含量顯著低于對照組,IgE、IL-4及IL-5 顯著高于對照組(P<0.01);與模型組比較,18β-甘草次酸鈉低、高劑量組與地塞米松組IL-2、IFN-γ 含量顯著升高,而IgE、IL-4及IL-5水平顯著低于模型組(P<0.01),見圖2。
圖2 各組大鼠血清IL-2、IFN-γ、IgE、IL-4與IL-5水平檢測
2.4 各組鼻黏膜組織中 ICAM-1、AQP5和 NF-κB測定結果 免疫組織化學染色結果顯示,與正常組比較,模型組大鼠鼻黏膜組織中ICAM-1、AQP5著色較深,NF-κB在細胞質和細胞核中均有著色,三種蛋白表達顯著升高(P<0.05);與模型組比較,18β-SGA 低劑量組、18β-SGA高劑量組和地塞米松組中,ICAM-1、AQP5著色較淺,NF-κB主要在細胞質中著色,這三種蛋白表達均顯著下降(P<0.05),見圖3、表2。
圖3 各組大鼠鼻黏膜組織中 ICAM-1、AQP5和 NF-κB(免疫組化染色,200×)
表2 大鼠鼻粘膜組織 ICAM-1、AQP5和 NF-κB平均光密度比較
2.5 各組大鼠鼻粘膜組織NF-κB 與PI3K-Akt信號通路相關蛋白表達 Western blot檢測結果顯示,模型組鼻粘膜組織中p-PI3K、p-AKT及NF-κB p65蛋白表達量顯著上升(P<0.05);而18β-甘草次酸鈉低、高劑量組與地塞米松組中p-PI3K、NF-κB p65蛋白表達受到抑制,較模型組均顯著下降(P<0.05),18β-甘草次酸鈉高劑量組與地塞米松組中p-AKT蛋白表達量較模型組也顯著下降(P<0.05);而各組間PI3K、AKT蛋白表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖4、表3。
圖4 Western blot檢測各組大鼠鼻黏膜組織NF-κB 與PI3K-Akt信號通路相關蛋白表達
表3 各組大鼠粘膜組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB p65蛋白表達量比較
變應性鼻炎(AR)是成人和兒童哮喘發(fā)生的危險因素之一,AR患者表現(xiàn)出由IgE介導的炎癥反應,其特征在于Th2免疫學模式與肥大細胞、嗜酸性粒細胞的活化以及對暴露于過敏原的炎癥介質的釋放[4]。AR反應中當過敏原與鼻粘膜接觸后,肥大細胞立即分泌并釋放炎性介質如組胺、白介素等,從而誘導包括打噴嚏、瘙癢和流鼻涕等急性過敏反應,當在過敏原中繼續(xù)暴露6~10 h后,在鼻腔中發(fā)生炎性細胞如嗜酸性粒細胞浸潤,嗜酸性粒細胞來源的介質誘導上皮損傷并導致鼻粘膜腫脹[10]。
本研究通過使用OVA誘導AR大鼠模型觀察18β-甘草次酸鈉的抗過敏作用。OVA 致敏后的大鼠出現(xiàn)煩躁不安、打噴嚏、流涕、頻繁抓鼻等現(xiàn)象,鼻黏膜組織可見明顯的結構破壞、血管擴張、水腫和炎性細胞浸潤等病理改變,說明AR大鼠模型構建成功。經過18β-甘草次酸鈉治療后,大鼠打噴嚏、流涕、抓鼻等現(xiàn)象較模型組有所減輕,顯著改善了鼻黏膜組織鼻黏膜水腫、血管擴張和炎性細胞浸潤。與先前研究結果一致,本研究也顯示出18β-甘草次酸鈉對于AR大鼠具有一定的治療功效。
輔助性T細胞是機體內具有特異性和非特異性免疫調節(jié)功能的細胞,根據分泌細胞因子種類的不同可分為Th1細胞和Th2細胞,Th1/Th2失衡與過敏性疾病的發(fā)病機理密切相關[11]。研究表明,AR后Th1細胞因子表達受抑制和Th2 細胞因子表達增加導致了Th1/Th2 失衡[12]。由于過敏原以肥大細胞的Th2免疫模式和由嗜酸性粒細胞產生的炎性浸潤物的相互作用為特征,因此AR是一種IgE介導的鼻粘膜炎性疾病,Th2細胞可能在AR的發(fā)展中起重要作用,而抑制Th2細胞過度分泌以調節(jié)Th1/Th2免疫平衡成為治療AR的新靶點[13]。由Th1 細胞分泌的細胞因子,如IL-2 具有促進 T 細胞活化與增殖的作用,IFN-γ能夠抑制 B 細胞合成IgE,同時抑制 Th0 細胞向 Th2 型細胞分化;Th2 細胞主要分泌IL-4、IL-5等細胞因子,研究顯示IL-4能夠拮抗 IFN-γ,可促進B細胞合成IgE與Th0細胞分化為 Th2 細胞[14-15]。本研究結果顯示,18β-甘草次酸鈉可抑制IL-2、IFN-γ下降與IgE、IL-4及IL-5水平的升高,調節(jié) Th1/Th2 細胞因子平衡,從而對變應性鼻炎大鼠起到保護作用。
細胞間黏附分子-1(ICAM-1)是黏附分子中免疫球蛋白超基因家族成員,ICAM-1在各種細胞類型,如成纖維細胞、白細胞、角質形成細胞、腫瘤細胞的表面上表達,增強與內皮細胞間的黏附作用[16]。研究表明,ICAM-1在變應性炎癥組織中表達急劇增加,沉默ICAM-1可下調炎性細胞因子的水平,并抑制嗜酸性粒細胞和肥大細胞的浸潤[17]。水通道蛋白 5(AQP5)是一種水特異性通道蛋白,是變態(tài)反應性炎癥期間的分泌限速屏障,在AR鼻黏膜組織中AQP5表達升高,并致使腺體過度分泌[18]。本研究顯示,經過18β-甘草次酸鈉治療的大鼠,鼻黏膜組織中ICAM-1和AQP5蛋白表達水平均下降。有研究表明,NF-κB 通路參與了AQP5 的表達調控[19]。NF-κB作為與炎癥密切相關的轉錄因子,活化后能誘導炎癥細胞因子的表達以加重變應性炎癥的病理反應,在AR中NF-κB途徑可被上皮細胞中的組胺所激活,NF-κB p65是一類典型的NF-κB亞基,存在于轉錄激活區(qū)域,當AR發(fā)生后,NF-κB釋放,游離的NF-κB以異源二聚體形式NF-κB p65和NF-κB p50轉移至細胞核,通過激活相關轉錄途徑而加重炎癥反應[20]。本研究中,18β-甘草次酸鈉可抑制鼻黏膜組織中NF-κB p65蛋白表達,抑制了NF-κB通路激活,以減輕AR后的炎癥反應。
磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路參與多種細胞活動和多種病理機制,與細胞增殖、分化、凋亡及代謝等密切相關。PI3K家族由磷酸肌醇催化的激酶組成,AKT是PI3K的關鍵下游靶蛋白,是細胞中重要的信號傳導途徑,能夠響應各種外源刺激而磷酸化至其功能性狀態(tài),從而調控細胞生物學行為。此外,PI3K/AKT通路參與調節(jié)免疫細胞功能來影響AR的發(fā)生發(fā)展。Ceng等[21]研究發(fā)現(xiàn)在肥胖過敏性鼻炎中,瘦素介導的骨橋蛋白表達上調促進了Th 細胞向Th2細胞分化,進而增加了炎癥反應,且該過程是通過調控PI3K/AKT信號通路途徑實現(xiàn)的。本研究結果顯示,18β-甘草次酸鈉作用于AR幼鼠后,鼻粘膜組織中p-PI3K、p-AKT水平均明顯下調,說明18β-甘草次酸鈉阻礙了PI3K-Akt信號通路激活,從而發(fā)揮對AR的改善作用。
18β-甘草次酸鈉改善AR幼鼠鼻黏膜組織病變,調節(jié)Th1/Th2 細胞因子平衡,下調鼻黏膜組織中 ICAM-1、AQP5蛋白表達,抑制NF-κB 與PI3K-Akt信號通路的激活,對AR幼鼠具有一定保護作用。然而AR病理機制較為復雜,18β-甘草次酸鈉是否通過其它通路對AR產生作用和影響仍需進一步進行探索。