符玉水 符元證 楊輝 鐘麗花 霍開明

(1.海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心新生兒科，海南 海口 571924；2.中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110013；3.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院兒科，海南 海口 570311)

變應(yīng)性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)是一種常見的變態(tài)反應(yīng)介導(dǎo)的炎癥性疾病，其特征是鼻塞、鼻充血、打噴嚏和鼻癢等[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，AR在全球的發(fā)病率約為25%～35%，在我國AR的發(fā)病率不斷上升，它與其他炎癥性疾病如哮喘、鼻竇炎、過敏性結(jié)膜炎、滲出性中耳炎和腺樣體肥大等密切相關(guān)[2-3]，其發(fā)病與多種因素有關(guān)，主要包括Th1/Th2細(xì)胞分化失衡、炎癥介質(zhì)釋放及免疫球蛋白E升高[4]。甘草次酸(Glycyrrhetinic acid，GA)為甘草主要活性成分之一的五環(huán)三萜烯衍生物，具有與甘草酸相同的藥理作用，可發(fā)揮抗腫瘤、抗?jié)?、抗炎以及延緩自身免疫性疾病發(fā)展的作用[5-7]。18β-甘草次酸鈉(18β-SGA)是甘草次酸的鈉鹽制劑，已有研究證明18β-SGA在抑制AR方面具有一定的可行性[8]，但其治療AR的具體機(jī)制尚未明確，本研究擬通過構(gòu)建AR 大鼠模型，進(jìn)一步觀察18β-SGA對AR大鼠鼻黏膜的作用并探究相關(guān)分子機(jī)制，為闡明AR發(fā)病機(jī)制和探索新的AR治療途徑提供了依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級Sprague-Dawley大鼠，7 日齡，體質(zhì)量(18.4±2.2)g，購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將新生SD幼鼠與母鼠同籠適應(yīng)性喂養(yǎng)，飼養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)置為溫度25℃～28℃、濕度 60%～80%，給予光照與黑暗各12 h交替。本研究符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則，并經(jīng)海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和氫氧化鋁[Al(OH)3]干粉購自美國Sigma公司；伊紅染色液、蘇木素染色液、RIPA裂解液和BCA 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；IL-2、IFN-γ、IgE、IL-4、IL-5大鼠特異性ELISA試劑盒購自購自上海西唐生物有限公司；免疫組織化學(xué)染色，抗體p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；抗體histone H2、NF-κB p65、ICAM-1、TGF-β1、β-actin購自美國 Abcam 公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制作 參考文獻(xiàn)方法[9]建立大鼠變應(yīng)性鼻炎(AR)模型，首先進(jìn)行基礎(chǔ)致敏：在0.3 mg卵清蛋白(OVA)和30 mg 氫氧化鋁[Al(OH)3]中加入生理鹽水1 mL混勻，制成混懸液，腹腔內(nèi)注射，隔日注射1次，共7次，對照組大鼠以等量生理鹽水進(jìn)行腹腔注射；接著進(jìn)行鼻腔激發(fā)：以50 μL 的2% OVA滴鼻，采用微量進(jìn)樣器從雙側(cè)鼻腔滴入，每天1次，共7次，對照組以等量生理鹽水滴入鼻腔。

1.3.2 分組與給藥 將50只新生SD幼鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為五組，包括：對照組、模型組、18β-SGA 低劑量組、18β-SGA高劑量組和地塞米松組，每組10只。模型組、18β-SGA低劑量組、18β-SGA高劑量組和地塞米松組建立AR模型。造模完成后開始給藥治療，18β-SGA 低劑量組、18β-SGA高劑量組分別按照20 mg·kg-1、40 mg·kg-1進(jìn)行腹腔注射，地塞米松組大鼠以1.5mg·kg-1進(jìn)行腹腔注射，對照組和模型組同時(shí)注射生理鹽水。每日注射一次，共持續(xù)4 周。

1.3.3 變應(yīng)性鼻炎癥狀評分 在處死大鼠前，采用5% OVA滴鼻，觀察30 min內(nèi)大鼠噴嚏、鼻溢和搔鼻動(dòng)作的行為，并采用疊加量化計(jì)分。①噴嚏：1～4個(gè)為1分，5～10個(gè)為2分，10個(gè)以上為3分。②流鼻涕：流至鼻孔前為1分，流出鼻孔為2分，流至面部計(jì)為3分。③撓癢：單前肢偶有撓鼻為1分，雙前肢撓鼻為2分，雙前肢不停撓鼻為3分。

1.3.4 ELISA 斷頸法處死各組大鼠，腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置2h，4℃低溫離心機(jī)以離心半徑為10cm、4000r/min離心15 min，獲取上清，使用大鼠特異性ELISA試劑盒檢測血清中IL-2、IFN-γ、IgE、IL-4及IL-5水平，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.5 HE染色 處死大鼠后分離鼻骨前皮膚，咬除鼻骨，迅速取出雙側(cè)鼻腔黏膜組織，置于4%多聚甲醛中固定。將組織進(jìn)行石蠟包埋，切成5 μm石蠟切片后，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色觀察組織學(xué)改變。切片采用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，使用蘇木精染色5 min，流水沖洗后，伊紅染色3 min，流水再次沖洗，梯度乙醇脫水后，二甲苯透明10 min，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察鼻腔黏膜組織形態(tài)變化并拍照。

1.3.6 免疫組織化學(xué)染色 將鼻腔黏膜組織石蠟切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，在0.3% 過氧化氫中處理 30 min，高溫(98℃)下加熱5 min，加入山羊血清室溫孵育1 h，加入兔抗ICAM-1(1∶100)、TGF-β1(1∶100)與NF-κB(1∶50)，4℃孵育過夜。PBS 液洗后，加二抗室溫孵育1h。滴加 DAB 顯色，自來水洗滌，加蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察圖像并拍照。

1.3.7 Western blot 將鼻黏膜組織充分剪碎，用 PBS清洗，加入RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，通過BCA法測定蛋白質(zhì)含量。以30μg蛋白的量加樣并通過10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜后，加入稀釋后的一抗p-PI3K(1∶1000)、PI3K(1∶1000)、p-Akt(1∶1000)、Akt(1∶1000)、NF-κB p65(1∶1000)以及histone H2(1∶1000)、β-actin(1∶1000)，4℃下孵育過夜。次日，TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)，室溫下孵育1 h，TBST洗膜后，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，使用Image Pro-Plus分析系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)評分結(jié)果 通過對各組大鼠觀察發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠未見明顯噴嚏、流涕表現(xiàn)，偶有抓鼻；與正常組比較，AR組大鼠均出現(xiàn)明顯的煩躁不安、打噴嚏、流涕、頻繁抓鼻等現(xiàn)象，AR行為學(xué)評分顯著增加(P<0.01)，且高于 5 分；與模型組比較，18β-SGA 低劑量組、18β-SGA高劑量組和地塞米松組大鼠打噴嚏、流涕、抓鼻等現(xiàn)象有所減輕，AR行為學(xué)評分均顯著下降(P<0.01)，見表 1。

表1 各組大鼠行為學(xué)評分比較

2.2 各組大鼠鼻粘膜組織病理學(xué)觀察 HE染色結(jié)果顯示，在對照組大鼠的鼻粘膜組織中未見明顯的損傷，鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)整齊、有序排列；模型組大鼠鼻粘膜組織可見明顯的血管擴(kuò)張、水腫和嚴(yán)重炎性細(xì)胞浸潤；18β-甘草次酸鈉低劑量組鼻黏膜組織仍有水腫，伴有輕度的炎癥細(xì)胞浸潤，但較模型組鼻粘膜組織病理變化得以改善，18β-甘草次酸鈉高劑量組鼻黏膜組織水腫、炎癥細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象較18β-甘草次酸鈉低劑量組明顯減輕。地塞米松組鼻黏膜組織病理變化改善效果較18β-甘草次酸鈉低、高劑量組更好，見圖1。

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織病理圖片(HE，200×)

2.3 各組大鼠血清Th1/Th2 細(xì)胞因子表達(dá)比較 ELISA 檢測結(jié)果顯示，模型組 IL-2、IFN-γ 含量顯著低于對照組，IgE、IL-4及IL-5 顯著高于對照組(P<0.01)；與模型組比較，18β-甘草次酸鈉低、高劑量組與地塞米松組IL-2、IFN-γ 含量顯著升高，而IgE、IL-4及IL-5水平顯著低于模型組(P<0.01)，見圖2。

圖2 各組大鼠血清IL-2、IFN-γ、IgE、IL-4與IL-5水平檢測

2.4 各組鼻黏膜組織中 ICAM-1、AQP5和 NF-κB測定結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織中ICAM-1、AQP5著色較深，NF-κB在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有著色，三種蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，18β-SGA 低劑量組、18β-SGA高劑量組和地塞米松組中，ICAM-1、AQP5著色較淺，NF-κB主要在細(xì)胞質(zhì)中著色，這三種蛋白表達(dá)均顯著下降(P<0.05)，見圖3、表2。

圖3 各組大鼠鼻黏膜組織中 ICAM-1、AQP5和 NF-κB(免疫組化染色，200×)

表2 大鼠鼻粘膜組織 ICAM-1、AQP5和 NF-κB平均光密度比較

2.5 各組大鼠鼻粘膜組織NF-κB 與PI3K-Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) Western blot檢測結(jié)果顯示，模型組鼻粘膜組織中p-PI3K、p-AKT及NF-κB p65蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05)；而18β-甘草次酸鈉低、高劑量組與地塞米松組中p-PI3K、NF-κB p65蛋白表達(dá)受到抑制，較模型組均顯著下降(P<0.05)，18β-甘草次酸鈉高劑量組與地塞米松組中p-AKT蛋白表達(dá)量較模型組也顯著下降(P<0.05)；而各組間PI3K、AKT蛋白表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4、表3。

圖4 Western blot檢測各組大鼠鼻黏膜組織NF-κB 與PI3K-Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠粘膜組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB p65蛋白表達(dá)量比較

3 討論

變應(yīng)性鼻炎(AR)是成人和兒童哮喘發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一，AR患者表現(xiàn)出由IgE介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，其特征在于Th2免疫學(xué)模式與肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的活化以及對暴露于過敏原的炎癥介質(zhì)的釋放[4]。AR反應(yīng)中當(dāng)過敏原與鼻粘膜接觸后，肥大細(xì)胞立即分泌并釋放炎性介質(zhì)如組胺、白介素等，從而誘導(dǎo)包括打噴嚏、瘙癢和流鼻涕等急性過敏反應(yīng)，當(dāng)在過敏原中繼續(xù)暴露6～10 h后，在鼻腔中發(fā)生炎性細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，嗜酸性粒細(xì)胞來源的介質(zhì)誘導(dǎo)上皮損傷并導(dǎo)致鼻粘膜腫脹[10]。

本研究通過使用OVA誘導(dǎo)AR大鼠模型觀察18β-甘草次酸鈉的抗過敏作用。OVA 致敏后的大鼠出現(xiàn)煩躁不安、打噴嚏、流涕、頻繁抓鼻等現(xiàn)象，鼻黏膜組織可見明顯的結(jié)構(gòu)破壞、血管擴(kuò)張、水腫和炎性細(xì)胞浸潤等病理改變，說明AR大鼠模型構(gòu)建成功。經(jīng)過18β-甘草次酸鈉治療后，大鼠打噴嚏、流涕、抓鼻等現(xiàn)象較模型組有所減輕，顯著改善了鼻黏膜組織鼻黏膜水腫、血管擴(kuò)張和炎性細(xì)胞浸潤。與先前研究結(jié)果一致，本研究也顯示出18β-甘草次酸鈉對于AR大鼠具有一定的治療功效。

輔助性T細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)具有特異性和非特異性免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞，根據(jù)分泌細(xì)胞因子種類的不同可分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞，Th1/Th2失衡與過敏性疾病的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)[11]。研究表明，AR后Th1細(xì)胞因子表達(dá)受抑制和Th2 細(xì)胞因子表達(dá)增加導(dǎo)致了Th1/Th2 失衡[12]。由于過敏原以肥大細(xì)胞的Th2免疫模式和由嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生的炎性浸潤物的相互作用為特征，因此AR是一種IgE介導(dǎo)的鼻粘膜炎性疾病，Th2細(xì)胞可能在AR的發(fā)展中起重要作用，而抑制Th2細(xì)胞過度分泌以調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡成為治療AR的新靶點(diǎn)[13]。由Th1 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如IL-2 具有促進(jìn) T 細(xì)胞活化與增殖的作用，IFN-γ能夠抑制 B 細(xì)胞合成IgE，同時(shí)抑制 Th0 細(xì)胞向 Th2 型細(xì)胞分化；Th2 細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5等細(xì)胞因子，研究顯示IL-4能夠拮抗 IFN-γ，可促進(jìn)B細(xì)胞合成IgE與Th0細(xì)胞分化為 Th2 細(xì)胞[14-15]。本研究結(jié)果顯示，18β-甘草次酸鈉可抑制IL-2、IFN-γ下降與IgE、IL-4及IL-5水平的升高，調(diào)節(jié) Th1/Th2 細(xì)胞因子平衡，從而對變應(yīng)性鼻炎大鼠起到保護(hù)作用。

細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)是黏附分子中免疫球蛋白超基因家族成員，ICAM-1在各種細(xì)胞類型，如成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的表面上表達(dá)，增強(qiáng)與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附作用[16]。研究表明，ICAM-1在變應(yīng)性炎癥組織中表達(dá)急劇增加，沉默ICAM-1可下調(diào)炎性細(xì)胞因子的水平，并抑制嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的浸潤[17]。水通道蛋白 5(AQP5)是一種水特異性通道蛋白，是變態(tài)反應(yīng)性炎癥期間的分泌限速屏障，在AR鼻黏膜組織中AQP5表達(dá)升高，并致使腺體過度分泌[18]。本研究顯示，經(jīng)過18β-甘草次酸鈉治療的大鼠，鼻黏膜組織中ICAM-1和AQP5蛋白表達(dá)水平均下降。有研究表明，NF-κB 通路參與了AQP5 的表達(dá)調(diào)控[19]。NF-κB作為與炎癥密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，活化后能誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)以加重變應(yīng)性炎癥的病理反應(yīng)，在AR中NF-κB途徑可被上皮細(xì)胞中的組胺所激活，NF-κB p65是一類典型的NF-κB亞基，存在于轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，當(dāng)AR發(fā)生后，NF-κB釋放，游離的NF-κB以異源二聚體形式NF-κB p65和NF-κB p50轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，通過激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄途徑而加重炎癥反應(yīng)[20]。本研究中，18β-甘草次酸鈉可抑制鼻黏膜組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)，抑制了NF-κB通路激活，以減輕AR后的炎癥反應(yīng)。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路參與多種細(xì)胞活動(dòng)和多種病理機(jī)制，與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及代謝等密切相關(guān)。PI3K家族由磷酸肌醇催化的激酶組成，AKT是PI3K的關(guān)鍵下游靶蛋白，是細(xì)胞中重要的信號傳導(dǎo)途徑，能夠響應(yīng)各種外源刺激而磷酸化至其功能性狀態(tài)，從而調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為。此外，PI3K/AKT通路參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能來影響AR的發(fā)生發(fā)展。Ceng等[21]研究發(fā)現(xiàn)在肥胖過敏性鼻炎中，瘦素介導(dǎo)的骨橋蛋白表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了Th 細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，進(jìn)而增加了炎癥反應(yīng)，且該過程是通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路途徑實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，18β-甘草次酸鈉作用于AR幼鼠后，鼻粘膜組織中p-PI3K、p-AKT水平均明顯下調(diào)，說明18β-甘草次酸鈉阻礙了PI3K-Akt信號通路激活，從而發(fā)揮對AR的改善作用。

4 結(jié)論

18β-甘草次酸鈉改善AR幼鼠鼻黏膜組織病變，調(diào)節(jié)Th1/Th2 細(xì)胞因子平衡，下調(diào)鼻黏膜組織中 ICAM-1、AQP5蛋白表達(dá)，抑制NF-κB 與PI3K-Akt信號通路的激活，對AR幼鼠具有一定保護(hù)作用。然而AR病理機(jī)制較為復(fù)雜，18β-甘草次酸鈉是否通過其它通路對AR產(chǎn)生作用和影響仍需進(jìn)一步進(jìn)行探索。