張瑞瑞 趙桓玉 周武碧 孫艷蘭 劉海燕

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院病理科，江蘇 南京 223300)

乳腺癌是發(fā)生于乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤之首，已嚴重影響了患者的生命健康[1-2]。目前，分子靶向技術(shù)已成為各類惡性腫瘤治療的熱點，但乳腺癌的靶向藥物治療效率低下且價格較為昂貴，故研究乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分析機制，并探索新的靶標是提高該疾病的治療效率的重點[3-4]。Bmi-1基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄抑制因子基因家族成員，調(diào)控細胞周期，并可通過結(jié)合INK4a位點，抑制pRb和p53蛋白介導(dǎo)的細胞凋亡，導(dǎo)致細胞生化、惡變甚至腫瘤化[5]。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containingprotein 9，CARD9)是一個重要的銜接蛋白，可調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子等信號通路，與胃癌、腎癌等多種惡性腫瘤存在者密切聯(lián)系[6]，但目前其與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程的聯(lián)系至今尚無定論。故本研究通過分析乳腺癌患者癌組織及癌旁組織的Bmi-1、CARD9表情情況，旨在探究癌組織中Bmi-1、CARD9表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后的關(guān)聯(lián)性，為乳腺癌的治療及病情預(yù)測提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經(jīng)我院倫理委員會審核通過，以2017年1月～2018年11月96例乳腺癌患者為研究對象。納入標準：①符合《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范(2015版)》[7]中關(guān)于乳腺癌的診斷標準，并經(jīng)病理學(xué)檢查確診為乳腺癌患者。②患者知曉本研究的研究內(nèi)容，且已簽署同意書。③均行手術(shù)治療。④臨床資料完整者。排除標準：①嚴重肝腎功能異常者。②乳腺良性腫瘤患者。③其他原發(fā)性惡性腫瘤疾病患者。④入組前1個月內(nèi)有激素替代治療史患者。⑤入組前已接受手術(shù)或放化療治療者。⑥妊娠或哺乳期婦女。

1.2 方法 標本采集：取距病灶邊緣>3 cm處的癌旁非腫瘤組織(經(jīng)快速病理學(xué)檢查證實為正常組織)0.1 g及腫瘤組織0.2g。Bmi-1表達檢測:采用免疫組化法乳腺癌組織及癌旁組織中Bmi-1表達情況，應(yīng)用北京中衫公司的免疫組化試劑盒，石蠟標本連續(xù)4um切片，將切片放置于二甲苯中脫蠟，10 min/次，共2次，然后行乙醇梯度水化處理，蒸餾水沖洗15 min，應(yīng)用EDTA修復(fù)液進行常規(guī)修復(fù)，在微波爐中高火3 min預(yù)熱至沸騰，然后中低火加熱20 min以暴露抗原位點，待其自然冷卻后，應(yīng)用1‰的PBS溶液沖洗3次，緊接著用3%H2O2去離子水孵育10 min；在溶液中滴加美國upatate公司的鼠抗人Bmi-1單克隆抗體(稀釋度為1∶200)，在4℃下孵育過夜，然后用PBS溶液漂洗3次，5 min/次，滴加北京中衫公司SPKIT A液后在室溫下孵育15 min，用PBS溶液漂洗后滴加B液，在室溫下孵育10～15 min后再次應(yīng)用PBS溶液漂洗3次，DBA顯色10 min，終止顯色，用PBS液代替一抗做陰性對照，Bmi-1陽性表達判斷標準：光學(xué)顯微鏡下可觀察到陽性表達的細胞核內(nèi)呈棕黃色或棕褐色顆粒。CARD9表達檢測：用二甲苯進行脫蠟處理，并用醇梯度洗脫，應(yīng)用0.3#過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后將組織切片與CARD9兔抗人單克隆抗體(美國Abcam公司)在4℃下孵育過夜，隨后與辣根過氧化物酶在室溫下溫育30 min，用SP法顯示免疫反應(yīng)性，用PBS液代替一抗做陰性對照。CARD9表達判斷標準：陰性為未見陽性染色細胞，陽性為可見深棕黃色或淡黃色細胞著色，每個切片至少觀察5個視野。

1.3 觀察指標 ①比較乳腺癌組織及癌旁組織中Bmi-1、CARD9表達情況。②統(tǒng)計患者臨床病理資料，包括年齡、TNM分期、病理類型、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，比較乳腺組織中Bmi-1、CARD9陽性表達及陰性表達患者病理資料的差異性，并分析影響乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達的危險因素。③預(yù)后：所有患者均術(shù)后術(shù)后隨訪1年，采用電話隨訪的方式對患者生存情況進行隨訪，比較乳腺組織中Bmi-1、CARD9陽性表達及陰性表達患者的1年生存率及死亡率，并分析乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況對術(shù)后1年生存情況的預(yù)測價值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以百分比表示，采用2檢驗比較組間差異；計量資料經(jīng)正態(tài)檢驗后以均數(shù)±標準差表示，用t檢驗比較組間差異；采用多元logistics回歸分析影響乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達的危險因素；采用Log-rank檢驗對生存曲線進行比較；采用ROC曲線分析乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況對術(shù)后1年生存情況的預(yù)測價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者病理類型 患者年齡39～72歲，平均(52.31±7.18)歲；TNM分期：Ⅰ期19例、Ⅱ期23例、Ⅲ期29例、Ⅳ期25例；病理類型：浸潤性癌36例、髓樣癌29例、黏液腺癌31例；組織學(xué)分級：Ⅰ級43例、Ⅱ級30例、Ⅲ級23例；腫瘤長徑：≥2 cm 38例、<2 cm 58例；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例。

2.2 乳腺癌組織及癌旁組織中Bmi-1、CARD9表達情況分析 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9陽性表達率均高于癌旁組織(P<0.05)，見表1。

表1 乳腺癌組織及癌旁組織中Bmi-1、CARD9表達情況分析[n，n(×10-2)]

2.3 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況與臨床病理關(guān)系 Bmi-1陽性表達組在TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期、組織學(xué)分級為Ⅲ級、腫瘤長徑≥2 cm、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER+方面的人數(shù)比例高于Bmi-1陰性表達組，CARD9陽性表達組在TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期、腫瘤長徑≥2 cm、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面的人數(shù)比例高于CARD9陰性表達(P<0.05)，見表2。

表2 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況與臨床病理關(guān)系

2.4 影響乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達的多因素分析 TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期、腫瘤長徑≥2cm、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響B(tài)mi-1表達的危險因素，TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響CARD9表達的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達的多因素分析

2.5 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況與預(yù)后關(guān)系 Bmi-1、CARD9不同表達情況的1年生存率對比無明顯差異(P>0.05)，見表4、圖1。

圖1 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達與預(yù)后的生存曲線分析

表4 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況與預(yù)后關(guān)系[n，n(×10-2)]

2.6 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況對預(yù)后的預(yù)測價值 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況預(yù)測患者術(shù)后1年生存情況的AUC分別為0.561、0.628，見表5、圖2。

表5 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況對預(yù)后的預(yù)測價值

圖2 乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況預(yù)測術(shù)后1年生存情況的ROC曲線分析

3 討論

Bmi-1基因PcG家族中的核心成員之一，對胚胎期哺乳動物骨骼、造血及神經(jīng)的發(fā)育發(fā)揮重要作用，其具有阻抑子功能，可阻斷細胞周期中兩種關(guān)鍵抑制蛋白，并可與c-myc協(xié)同作用引起細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成[8-9]。CARD9是CARD蛋白家族中的一員，定位于細胞質(zhì)中，并存在于人體多種組織中，同時在多種癌細胞系中有大量表達，提示其或與腫瘤的生長增殖有關(guān)[10-13]。本研究對乳腺癌組織及癌旁組織中Bmi-1、CARD9表達情況進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織Bmi-1、CARD9陽性表達率均高于癌旁組織，表明乳腺癌細胞中存在Bmi-1、CARD9高表達的現(xiàn)象。

相關(guān)報道指出，多種腫瘤細胞中Bmi-1呈現(xiàn)為高表達狀態(tài)，使腫瘤細胞不斷更新成為癌癥干細胞，其表達水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、預(yù)后等病理指標相關(guān)[14-16]。但目前尚不知其與乳腺癌的病理特征的關(guān)系，為此本研究進行了相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期、腫瘤長徑≥2cm、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響B(tài)mi-1表達的危險因素，說明Bmi-1表達與TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這可能是與Bmi-1基因可激活端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)端粒酶活性，而促進腫瘤增殖有關(guān)[17-19]。CARD9為銜接蛋白，可通過蛋白間的相互作用調(diào)節(jié)NF-kB等信號通路，調(diào)控腫瘤壞死因子、白介素等免疫因子的表達，并能調(diào)節(jié)機體固有免疫反應(yīng)，對于維持機體微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用[20-22]。局部微環(huán)境的炎癥反應(yīng)是誘導(dǎo)癌癥發(fā)生、發(fā)展的重要因素，慢性炎癥可促進癌癥的發(fā)生，并參與了腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移等的病理過程[23]。有研究指出，CARD9表達情況與腫瘤的惡性程度有關(guān)[24-25]。本研究結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅲ、Ⅳ期、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響CARD9表達的危險因素，表明，這主要是因為CARD9異常表達可促進病理炎癥反應(yīng)的發(fā)生，而炎癥參與了腫瘤的發(fā)生，引起未惡化的癌細胞擴增，促進血管生成，有利于腫瘤細胞的生長、擴增，也促進惡性腫瘤細胞擴散，進而導(dǎo)致腫瘤出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[26-27]。

經(jīng)上述研究可知，Bmi-1、CARD9表達與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程的存在一定的聯(lián)系，提示其表達情況或與預(yù)后相關(guān)。但本研究發(fā)現(xiàn)，Bmi-1、CARD9不同表達情況的1年生存率對比無明顯差異，乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9表達情況預(yù)測患者術(shù)后1年生存情況的AUC均小于0.7，表明Bmi-1、CARD9表達情況與預(yù)后無較大關(guān)聯(lián)，且對預(yù)后的預(yù)測價值較低，與既往研究結(jié)果存在差異[28-39]，這可能與本研究樣本量少、且研究時間尚短有關(guān)，故后期需延長預(yù)后觀察時間，以進一步分析Bmi-1、CARD9表達與預(yù)后的關(guān)系。本研究不足之處在于，納入病例的TNM分期及病理類型的人數(shù)比例并不均勻，可能對研究結(jié)果造成誤差，并且本研究在進行預(yù)后分析時，觀察時間較短，未分析術(shù)后3年、5年生存率，無法準確得到Bmi-1、CARD9表達與預(yù)后的關(guān)系，故后續(xù)需延長研究時間以分析其與預(yù)后的關(guān)聯(lián)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中Bmi-1、CARD9陽性表達率較高，且其陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，但Bmi-1、CARD9表達情況與術(shù)后1年生存情況無明顯關(guān)聯(lián)。