高 磊

（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所，西藏 拉薩 850000）

靈芝，屬于常見的大型真菌。靈芝中主要的活性物質(zhì)為靈芝多糖和三萜，具備抗腫瘤、抗氧化、保肝護(hù)肝、調(diào)整免疫功能等很好的功效。由于人工栽培耗時(shí)久，因此采取液體進(jìn)行發(fā)酵，從而獲得白肉靈芝菌絲體和發(fā)酵產(chǎn)物，合適的發(fā)酵條件可有效地促進(jìn)菌絲體生長，提高菌絲體產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)主要從時(shí)間、碳源、氮源、pH 值等方面分別對(duì)白肉靈芝菌絲體液體發(fā)酵條件進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試靈芝為西藏白肉靈芝，由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所食用菌實(shí)驗(yàn)室提供。供試培養(yǎng)基：①PDA培養(yǎng)基；②加富液體培養(yǎng)基、PDA基礎(chǔ)上添加蛋白胨0.2%、磷酸二氫鉀0.046%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、維生素B每1000 mL 0.03 mg；③液體培養(yǎng)基，不含瓊脂的PDA培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種制備

斜面菌種（一級(jí)種）制備：選用實(shí)驗(yàn)室保藏菌株試管斜面，通過轉(zhuǎn)管培養(yǎng)獲得。

液體菌種制備：使用容量為250 mL 的三角瓶，盛裝PDA 液體的液體培養(yǎng)基100 mL，無菌條件接入約0.5 cm × 0.5 cm 白肉靈芝一級(jí)種3 塊，使用恒溫?fù)u床時(shí)，調(diào)節(jié)溫度為25 ℃、150 r/min，培養(yǎng)5 d，得到我們需要的液體菌種。

1.2.2 菌絲體干質(zhì)量測(cè)定方法

將獲得的液體菌種通過離心機(jī)，在3000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min后，去上清，用滅菌水反復(fù)清洗，再使用高速離心機(jī)，在3000 r/min 轉(zhuǎn)速下，離心10 min 后，使用吸水紙吸干水分，置于滅菌的平板內(nèi)，放置于60 ℃干燥箱烘干，使用精密電子天平稱質(zhì)量。

1.2.3 pH值測(cè)定

采用實(shí)驗(yàn)室常用pH 計(jì)測(cè)量發(fā)酵后液體的pH值。

1.2.4 白肉靈芝菌絲體生長

曲線圖繪制過程，需要以250 mL 三角瓶作為培養(yǎng)耗材，并在其瓶內(nèi)加入加富液體培養(yǎng)基100 mL，共計(jì)30 瓶，使用壓力滅菌器進(jìn)行高壓滅菌1 h。冷卻后在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行接種，然后在每個(gè)250 mL三角瓶中放入10 mL液體菌種，接種密封后，將其放置于恒溫?fù)u床內(nèi)，置于25 ℃、150 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)。 1 d 后，每次取其中3 瓶，測(cè)量瓶內(nèi)液體的pH值和菌絲體干質(zhì)量，共觀察13 d。

1.2.5 白肉靈芝菌絲體液體發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

單因素試驗(yàn)中會(huì)使用到250 mL 三角瓶作為實(shí)驗(yàn)儀器，裝液體培養(yǎng)基100 mL，在超凈工作臺(tái)中每個(gè)三角瓶中接入10 mL 液體菌種，將其放置于恒溫?fù)u床內(nèi)，控制溫度為25 ℃、在轉(zhuǎn)速150 r/min 條件下培養(yǎng)6 d 后。測(cè)量其瓶內(nèi)液體的pH 值和菌絲干質(zhì)量。

1）C 因素試驗(yàn)：選擇實(shí)驗(yàn)室中比較常見的單糖（葡萄糖）、雙糖（蔗糖）、多糖（玉米粉、淀粉），對(duì)照組選擇不加任何碳源，通過測(cè)量三角瓶內(nèi)液體的菌絲體干質(zhì)量，得出不同C 源條件下白肉靈芝菌絲體生長的情況，共進(jìn)行9個(gè)處理，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2）N 因素試驗(yàn)：選擇實(shí)驗(yàn)室中常見的無機(jī)氮（硫酸銨、硝酸鉀、硝酸銨）、有機(jī)氮（牛肉膏、酵母膏），選擇的N 源可分別替換PDA 培養(yǎng)基中的蛋白胨，對(duì)照組中不加任何N 源，通過測(cè)量三角瓶內(nèi)液體的菌絲體干質(zhì)量，得出不同N 源條件下白肉靈芝菌絲體生長的情況，共10 個(gè)處理，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3）pH 值試驗(yàn)：用1.1 中提到的②號(hào)培養(yǎng)基，使用0.1 mol/L NaOH 和0.1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 值，設(shè)pH 值為4，5，6，7，8，9，10，11 共8 個(gè)實(shí)驗(yàn)梯度，每個(gè)功能梯度可以重復(fù)3 次，通過分析儀器設(shè)備測(cè)得數(shù)據(jù)不同的pH值對(duì)白肉靈芝菌絲體生長產(chǎn)生的影響。

2 結(jié)果分析

2.1 白肉靈芝菌絲體生長曲線

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)把培養(yǎng)時(shí)間作為橫坐標(biāo)，菌絲干質(zhì)量作為縱坐標(biāo)（圖1）。從圖1 可直觀看到，菌絲在加富培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種接種后，發(fā)現(xiàn)1 d 后菌絲生長速率進(jìn)入增長期，其中生長期的適應(yīng)期較長，直至培養(yǎng)進(jìn)行到第9 d 時(shí)，菌絲干質(zhì)量達(dá)到所測(cè)數(shù)值最高點(diǎn)。其中第10 d 到第12 d 的菌絲干質(zhì)量差別不大，三角瓶發(fā)酵液中菌絲體干質(zhì)量依次為4.27 g/L，4.30 g/L，4.37 g/L。一直到第13 d 天菌絲干質(zhì)量出現(xiàn)明顯的下降，為3.57g/L。依據(jù)白肉靈芝生長曲線可知，白肉靈芝作為工業(yè)化生產(chǎn)的液體菌種，培養(yǎng)7 d較為適宜，生產(chǎn)中如果需要菌絲體，需要培養(yǎng)10 d，而收獲發(fā)酵代謝產(chǎn)物，則需要至少11 d。

圖1 白靈芝菌絲體生長曲線

2.2 C源對(duì)白肉靈芝菌絲體生長的影響

從不同C 源對(duì)白肉靈芝菌絲體干質(zhì)量的影響（表1）可以直觀地發(fā)現(xiàn)，白肉靈芝菌絲體對(duì)各類C源均能吸收利用，但對(duì)于多糖類的利用優(yōu)于雙糖及單糖。在本文選擇的C 源中，白肉靈芝菌絲體對(duì)可溶性淀粉的吸收利用率最高，白肉靈芝菌絲體干質(zhì)量達(dá)4.90 g/L，其次是玉米粉，菌絲干質(zhì)量為4.82 g/L。在本文使用的C 源雙糖中，白肉靈芝菌絲體對(duì)蔗糖的利用效果最好，菌絲干質(zhì)量為2.70 g/L。實(shí)驗(yàn)中選擇的2 種多糖對(duì)白肉靈芝菌絲干質(zhì)量的影響比其他碳源利用高。但是，從成本考慮，優(yōu)先選擇使用玉米粉作為實(shí)驗(yàn)C源的來源。

表1 不同C源對(duì)白肉靈芝菌絲體干質(zhì)量的影響

2.3 N源對(duì)白肉靈芝菌絲體生長的影響

從N源對(duì)白肉靈芝菌絲體干質(zhì)量的影響（表2）可以看出，在供試的N 源中，白肉靈芝菌絲體對(duì)酵母膏吸收利用效果最好，菌絲體干質(zhì)量為10.29 g/L，然后是硝酸銨、牛肉膏，實(shí)驗(yàn)中N 源蛋白胨的吸收利用效果最差，菌絲體干質(zhì)量僅為3.17 g/L。試驗(yàn)結(jié)果分析表明，與其他氮源相比，酵母膏效果最好。但是考慮到價(jià)格，可選硝酸銨作為實(shí)驗(yàn)氮源。

表2 不同N源對(duì)白肉靈芝菌絲體干質(zhì)量的影響

2.4 pH值對(duì)白肉靈芝菌絲體生長的影響

從圖2 可明顯觀察到，白肉靈芝菌絲體對(duì)酸堿度的適應(yīng)范疇較廣，pH 值為1～13 均能生長，但是在其他條件不變，調(diào)節(jié)pH 值培養(yǎng)6 d 后，不難發(fā)現(xiàn)pH 值為6 時(shí)菌絲干質(zhì)量最高，但由于發(fā)酵期間，代謝產(chǎn)物會(huì)使發(fā)酵液體pH 值降低，故應(yīng)調(diào)高液體培養(yǎng)基的pH值，因此應(yīng)該選擇pH=7作為白肉靈芝菌絲體發(fā)酵較適宜的pH值。

圖2 pH值對(duì)白肉靈芝菌絲體生長的影響

3 結(jié)論與討論

白肉靈芝菌絲體液體發(fā)酵在利用C 源、N 源的時(shí)候不僅要考慮到利用率的問題，還需要考慮成本問題，因此在選擇C 源、N 氮源的時(shí)候有限考慮成本較低，有助于大規(guī)模生產(chǎn)的品種；發(fā)酵期間代謝產(chǎn)物會(huì)使發(fā)酵液pH 值降低，因此應(yīng)調(diào)高初始液體培養(yǎng)基的pH 值，因此主要選取玉米粉作為C 源，硝酸銨作為N 源，pH=7 作為最優(yōu)條件。本實(shí)驗(yàn)如果僅僅從單因素方面研究不同條件對(duì)白肉靈芝菌絲體液體發(fā)酵的影響，不很全面，還需進(jìn)一步進(jìn)行多因素實(shí)驗(yàn)分析，使其為白肉靈芝菌絲體發(fā)酵產(chǎn)業(yè)提供實(shí)踐依據(jù)和試驗(yàn)指導(dǎo)。