劉天易，李 莉，馬茂強，楊 飛，郭功玲，王 信，張學順

（1.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250011；2.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性腸道炎癥性腸病，發(fā)病率逐年升高，被WTO列為不治之癥[1-2]，其病變通常發(fā)生在乙狀結腸和直腸，也可蔓延至降結腸，甚至整個結腸，病變大多局限于大腸黏膜及黏膜下層[3]。UC發(fā)病機制尚未明確，治療策略大多采用西藥治療，西藥主要由水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑、生物制劑等組成，但UC存在病程長且易復發(fā)的特點，長期應用西藥治療毒副作用較大[4]。

重芪結腸靶向微丸（PA-CTPC）是本研究團隊前期針對UC患者血性腹瀉、腹痛、便血、體質(zhì)量減輕等癥狀，以重樓總皂苷、黃芪總多糖為主要成分研制而成的中藥新制劑[5]。本研究擬建立PA-CTPC中黃芪總多糖、重樓皂苷類成分的含量測定方法，并從炎癥因子和黏膜屏障角度評價其對4%葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導UC模型小鼠的干預作用，為PA-CTPC深入開發(fā)提供實驗依據(jù)，為臨床應用含重樓-黃芪藥對治療UC提供參考。

1 儀器與材料

1.1 試藥D-無水葡萄糖對照品（批號：110833-201205，中國食品藥品檢定研究院）；重樓皂苷Ⅰ對照品、重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枺?11590-200402，111591-200402，中國食品藥品檢定研究院）；重樓皂苷Ⅶ對照品、重樓皂苷H對照品（純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司）；PA-CTPC（自制，批號：20190410，20190515，20190618）；DSS（分子量：36 000～50 000，MP biomedical公司）；便潛血檢測試紙（北京金華科生物技術有限公司）；D-LA、DAO ELISA檢測試劑盒（上海一研生物科技有限公司）；IL-6、TNF-α、IL-10、IL-4 ELISA試劑盒（武漢市博士德有限公司）；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器UV2800型紫外分光光度計（日本日立公司）；DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；Aglient 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent有限公司）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；EP214C型萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；AB135-S型十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；EG1150石蠟包埋機（德國Leica公司)；RM2235石蠟切片機（德國Leica公司)；BX50顯微鏡（日本Olympus公司）；H1650臺式高速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱（鞏義科瑞儀器有限公司）；DW-86W100型超低溫保存箱（北京慧龍環(huán)科環(huán)境儀器有限公司）。

1.3 實驗動物6周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠50只，體質(zhì)量（20.0±1.0）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證編號：SCXK（魯）20140007。飼養(yǎng)環(huán)境：山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院動物實驗中心，屏障環(huán)境飼養(yǎng)，使用許可證編號：SYXK（魯）20180015。本實驗經(jīng)過山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準（批準號：AWE-2019-093），符合實驗動物倫理標準。

2 方法與結果

2.1 黃芪總多糖的含量測定[6]

2.1.1 供試品溶液制備 取PA-CTPC適量，研細，取約2.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇溶液50 mL，超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）30 min，濾過，殘渣揮干乙醇，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）40 min，再稱定質(zhì)量，以水補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 取D-無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水配制成約0.1 mg/mL的溶液，即得。

2.1.3 線性關系考察 精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的標準葡萄糖溶液（0.098 6 mg/mL），加水補至2.0 mL，加1.0 mL 5%的苯酚，再加濃硫酸10.0 mL，漩渦震蕩搖勻，沸水浴加熱10 min，水浴冷卻后，485 nm檢測吸光度（A），以葡萄糖濃度為橫坐標（X），A為縱坐標（Y）繪制標準曲線。結果得到標準曲線方程：Y=0.011 5X-0.000 6，r=0.995 6，表明葡萄糖在9.86～59.16 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.4 測定法 精密量取供試品溶液0.5 mL，其余按照“2.1.3”項下“加水補至2.0 mL，……，485 nm檢測吸光度”操作。將樣品的吸光度數(shù)值代入標準曲線方程，計算黃芪總多糖含量。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液1.0 mL，按“2.1.4”項下方法測定吸光度，重復測定6次，測得吸光度的RSD為0.35%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.1.1”項下供試品溶液0.5 mL，于0、2、4、8、12、24 h，按“2.1.4”項下方法測定吸光度，測得吸光度的RSD為3.45%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復性試驗 取PA-CTPC（批號：20190515）適量，按“2.1.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.4”項下方法測定吸光度并計算含量，結果黃芪總多糖的平均含量為150.75 mg/g，RSD為2.47%，表明測定方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取PA-CTPC（批號：20190515）95%乙醇超聲處理后的殘渣6份，每份約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入葡萄糖對照品約40 mg，其余操作按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項下方法測定吸光度，并計算回收率。（見表1）

表1 黃芪總多糖測定加樣回收率試驗結果（n=6）

2.1.9 樣品含量測定 按照建立的方法測定3批PA-CTPC樣品中黃芪總多糖的含量，結果見表2。

表2 3批PA-CTPC樣品黃芪總多糖的含量測定結果（n=3，mg/g）

2.2 重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H的含量測定[7-8]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～40 min，30%～60%A，40～50 min，60%～30%A）；檢測波長：203 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 供試品溶液制備 取PA-CTPC適量，研細，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用乙醇補足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 混合對照品溶液的制備 取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含重樓皂苷Ⅰ0.412 mg、重樓皂苷Ⅱ0.213mg、重樓皂苷Ⅶ0.271mg、重樓皂苷H 0.161 mg的混合溶液，即得。

2.2.4 陰性供試品溶液的制備 按處方比例，制備缺少重樓的陰性樣品，并按“2.2.2”項下的方法制成陰性供試品溶液。

2.2.5 專屬性試驗 分別取供試品溶液、混合對照品溶液及陰性供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行檢測，結果供試品中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H 4種皂苷類化學成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且保留時間與相應對照品一致；陰性供試品溶液在相同保留時間處無色譜峰，表明無其他成分干擾，方法專屬性良好。（見圖1）

圖1 PA-CTPC中重樓皂苷類成分測定HPLC圖

2.2.6 線性關系考察 取重樓皂苷Ⅰ對照品溶液（1.573 0mg/mL），重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤海?.750 4 mg/mL），重樓皂苷Ⅶ對照品溶液（0.814 0 mg/mL），重樓皂苷H對照品溶液（0.531 2 mg/mL），各精密量取0.5、1、2、4、8、10 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋配制成系列濃度，按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定。以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H對照品進樣量（μg）為橫坐標（X），對應峰面積（M）為縱坐標（Y），分別繪制標準曲線，得回歸方程。（見表3）

表3 PA-CTPC中4種重樓皂苷類成分的回歸方程及線性范圍、相關系數(shù)

2.2.7 精密度試驗 取“2.2.3”項下混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，重復測定6次，測得重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H峰面積的RSD分別為0.32%、0.48%、0.52%、1.02%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液分別于配制后的0、2、4、8、12、24 h，按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，測得重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H峰面積的RSD分別為1.25%、0.89%、1.44%、0.69%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復性試驗 取PA-CTPC（批號：20190515）適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，并計算含量。結果重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H的平均含量分別為30.12、6.02、5.28、8.85 mg/g，RSD分別為2.58%、3.14%、1.67%、1.33%，表明測定方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取PA-CTPC（批號：20190515）適量，研細，取6份，每份約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入重樓皂苷Ⅰ對照品溶液（1.573 0 mg/mL）5 mL，重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤海?.750 4 mg/mL）2 mL，重樓皂苷Ⅶ對照品溶液（0.814 0mg/mL）2mL，重樓皂苷H對照品溶液（0.531 2 mg/mL）5 mL，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，并計算回收率。（見表4）

表4 重樓皂苷類成分測定加樣回收率試驗結果（n=6）

續(xù)表4：

2.2.11 樣品含量測定 按照建立的方法測定3批PA-CTPC樣品中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H的含量，結果見表5。

表5 3批PA-CTPC樣品重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H的含量測定結果（n=3，mg/g）

2.3 對DSS誘導的小鼠UC模型的干預作用

2.3.1 動物造模、分組與給藥6周齡雄性C57BL/6小鼠50只，適應性飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機分空白組、模型組及PA-CTPC低、中、高劑量組?？瞻捉M小鼠自由飲食、飲水，第2周開始灌胃生理鹽水（3 mL/d），至第2周末實驗結束；模型組第1周開始以含有4% DSS的飲用水喂養(yǎng)小鼠，第2周開始灌胃生理鹽水（3 mL/d），至第2周末實驗結束；PA-CTPC低、中、高劑量組第1周開始以含有4% DSS的飲用水喂養(yǎng)小鼠，第2周開始每天分別灌胃給予0.1、0.2、0.4 mg/g的PA-CTPC，至第2周末實驗結束。

2.3.2 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊的采用SNK檢驗，方差不齊的采用Dunnet t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.3.3 小鼠疾病活動指數(shù)（DAI）評分 每天觀察并記錄各組小鼠體質(zhì)量變化情況、糞便性狀、便血情況，并進行DAI評分[9]。結果表明，空白組小鼠飲食正常，糞便性狀正常，毛色光亮，精神良好；模型組和PA-CTPC低、中、高劑量組小鼠在飲4% DSS后逐漸出現(xiàn)毛色無光、便稀的情況，部分小鼠肛門處出現(xiàn)紅腫跡象，進而加重為腹瀉、便血等癥狀。模型組和PA-CTPC低、中、高劑量組小鼠的食物消耗量均不同程度的減少，且存在好懶惡動的現(xiàn)象。與空白組比較，模型組小鼠DAI評分明顯升高（P＜0.01）。給藥7 d后，PA-CTPC低、中、高劑量組小鼠便血、體質(zhì)量下降等情況均不同程度減輕，PA-CTPC中、高劑量組小鼠DAI評分明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。（見表6）

表6 各組小鼠DAI、結腸組織大體形態(tài)、病理學評分比較（±s，分）

表6 各組小鼠DAI、結腸組織大體形態(tài)、病理學評分比較（±s，分）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/g）DAI評分 形態(tài)評分 組織病理學評分空白組 10 - 0 0 0.14±0.04模型組 10 - 2.89±0.31a 3.41±0.53a 2.43±0.25a PA-CTPC低劑量組 10 0.1 1.85±0.27 3.24±0.62 2.13±0.66 PA-CTPC中劑量組 10 0.2 1.31±0.17b 1.99±0.47c 1.74±0.64b PA-CTPC高劑量組 10 0.4 1.10±0.18c 1.26±0.59c 0.86±0.25c

2.3.4 結腸組織大體形態(tài)及病理學評分 將小鼠脫頸椎處死后，自盲腸部位開始至肛門口處取出整個腸段，沿腸系膜緣縱向剪開，用冰生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，進行結腸組織大體形態(tài)評分[10]，結腸組織采用多聚甲醛固定48 h后，組織常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，置于光學顯微鏡下觀察小鼠結腸組織病變情況，并按照OBERMEIER F等[11]介紹的評分標準進行病理學評分。結果顯示，空白組小鼠結腸外形完整，結腸黏膜腺體排列整齊，上皮細胞基本完整。與空白組比較，模型組小鼠存在結腸浮腫、充血和粒狀糜爛的情況（P＜0.01）；與模型組比較，PA-CTPC各劑量組小鼠結腸組織病理形態(tài)均有一定程度的好轉，PA-CTPC低劑量組小鼠結腸形態(tài)、組織病理評分與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），PA-CTPC中、高劑量組結腸組織形態(tài)、病理評分明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。（見表6、圖2）

圖2 各組小鼠結腸組織形態(tài)學比較（HE，×100）

2.3.5 血清IL-6、TNF-α、IL-10、IL-4、D-LA、DAO水平檢測 第15天時，腹腔注射水合氯醛將小鼠麻醉，摘眼球取血，8 000 r/min離心10 min，分離血清并置-80℃冰箱中保存，按ELISA試劑盒說明書操作檢測血清中IL-6、TNF-α、IL-10、IL-4、D-LA、DAO含量。結果顯示，模型組小鼠血清IL-6、TNF-α、D-LA、DAO水平明顯高于空白組（P＜0.01），IL-10、IL-4水平明顯低于空白組（P＜0.01）；與模型組比較，PA-CTPC中、高劑量組小鼠血清IL-6、TNF-α、D-LA、DAO水平明顯降低（P＜0.01），IL-10、IL-4水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），PA-CTPC低劑量IL-6、IL-10、IL-4、D-LA、DAO水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖3）

圖3 各組小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-10、IL-4、D-LA、DAO水平比較（±s，n=10）

3 討 論

黃芪總多糖是重芪結腸靶向微丸的主要藥效成分之一，目前其常用的含量測定方法主要為紫外分光光度法，主要有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3，5-二硝基水楊酸法等，本研究在對以上3種方法進行考察基礎上，選用苯酚-硫酸法測定制劑中黃芪總多糖的含量，并對反應時間、反應溫度、測定波長等進行了考察，建立的黃芪總多糖含量測定方法穩(wěn)定、準確、可行。測定總多糖的含量只是多糖類成分質(zhì)量控制的一個方面，相關學者還采用HPLC法檢測多糖衍生化后單糖組成及其含量、采用高效凝膠滲透色譜法測定多糖相對分子質(zhì)量及其分布、采用薄層色譜法檢查游離單糖、采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和核磁共振波譜對糖苷鍵連接位置及構型進行判斷等進行多糖成分的質(zhì)量控制[12]，隨著分析技術的不斷成熟，后續(xù)將會進一步完善本制劑中黃芪總多糖的質(zhì)量控制方法。

重樓主要活性成分為甾體皂苷類成分，2015年版《中華人民共和國藥典》以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ作為質(zhì)控指標，然而相關研究表明重樓皂苷Ⅵ在正品云南重樓或七葉一枝花中含量較低或不含，而在近緣種植物球藥隔重樓及延齡草或吉林延齡草中含量較高，并建議去除重樓皂苷Ⅵ，增加重樓皂苷H作為含量測定指標[13]，因此，本研究選擇重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和H作為本制劑中重樓皂苷類成分的測定指標。

本研究采用4.0%DSS水溶液給予小鼠自由飲用7 d，成功復制了UC模型。模型組小鼠DAI評分、結腸組織大體形態(tài)及病理學評分與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學意義。在造模成功后給予PA-CTPC藥物干預，PA-CTPC中、高劑量組小鼠DAI評分、結腸組織大體形態(tài)及病理評分明顯降低，表明PA-CTPC對DSS誘導小鼠形成的UC癥狀具有明顯的治療作用。

細胞因子在UC的發(fā)病機制中扮演重要的角色，其中促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等）和抗炎因子（IL-4、IL-10等）兩者間的調(diào)節(jié)失衡與UC的發(fā)病密切相關[14]。本研究采用ELISA法測定小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-10、IL-4水平，結果PA-CTPC中、高劑量組能明顯降低模型組小鼠血清IL-6、TNF-α，明顯升高IL-10、IL-4水平，表明PA-CTPC能調(diào)整小鼠UC模型促炎、抗炎因子水平，發(fā)揮抗炎作用。現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)IL-6/JAK2/STAT3信號通路可調(diào)控免疫與炎癥反應，在UC的發(fā)生、發(fā)展及轉歸中發(fā)揮了重要作用[15-16]，基于本研究結果，后續(xù)將對PA-CTPC干預IL-6/JAK2/STAT3信號通路進行研究，分析探尋其治療UC的可能的靶點及作用機制。

UC發(fā)病過程中多種效應細胞釋放細胞因子和炎癥介質(zhì)會促進腸黏膜損傷[17-18]。二胺氧化酶（DAO）可在腸道黏膜上皮細胞損傷時被釋放入血，血清DAO水平可間接反映腸道黏膜上皮細胞損傷的程度[19]。腸道D乳酸（D-LA）可通過受損黏膜入血，血清中D-LA水平高低可間接反映腸道黏膜通透性的變化[20]。本研究結果表明中、高劑量PA-CTPC能顯著降低模型小鼠血清DAO、D-LA水平，說明PA-CTPC在一定程度上可改善腸道黏膜屏障功能。

綜上所述，本研究以黃芪總多糖及重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H的含量測量，建立了PA-CTPC的質(zhì)量控制方法，并初步證明PA-CTPC可通過降低血清中促炎因子的表達，升高抗炎因子水平，改善腸道黏膜屏障功能，發(fā)揮其對UC小鼠的治療作用。本研究為PA-CTPC深入開發(fā)提供了實驗依據(jù)，為臨床含重樓-黃芪藥對應用治療UC提供了參考。