鄭若韻，賀 娟，熊為鋒，王 旭，王冉然，郝 宇

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029）

五運六氣理論是中醫(yī)學(xué)“天人合一”整體觀思想的集中體現(xiàn)。運氣理論認為疾病的發(fā)生受到天地氣化的影響。抑郁癥是一種復(fù)發(fā)率高、對患者生活影響極大的精神類疾病[1]，根據(jù)世界衛(wèi)生組織2017年數(shù)據(jù)顯示，全球抑郁癥發(fā)病率占總?cè)丝诘?.3%，患病人數(shù)已經(jīng)達到3.22億，我國抑郁障礙患病率為4.2%[2]，嚴重威脅人類健康。抑郁癥屬于中醫(yī)學(xué)“郁證”的范疇。《素問》運氣七篇大論中記載了干支運氣與郁證發(fā)生相關(guān)，如《素問·五常政大論篇》言：“太陽司天，寒氣下臨，心氣上從，……喜悲數(shù)欠?！鼻矣醒芯孔C實抑郁癥患者存在明顯的五運六氣稟賦特征[3]，抑郁癥發(fā)病具有明顯的五運六氣時間規(guī)律[4]。

《黃帝內(nèi)經(jīng)》不僅強調(diào)分析病機要重視運氣，而且在《素問》七篇大論中提出了基于運氣理論的諸多治則，如《素問·六元正紀大論篇》提出五運之氣郁而不發(fā)時的治療法則，“木郁達之，火郁發(fā)之，土郁奪之，金郁泄之，水郁折之”?！端貑枴ぶ琳嬉笳撈穭t提出六氣司天、在泉時的藥味組方原則，如“諸氣在泉，風(fēng)淫于內(nèi)，治以辛涼，佐以苦，以甘緩之，以辛散之。熱淫于內(nèi)，……；司天之氣，風(fēng)淫所勝，平以辛涼，佐以苦甘，以甘緩之，以酸瀉之。熱淫所勝，……”等，但遺憾的是有其法而無其方。宋代陳無擇對此進行了完善與發(fā)展，他根據(jù)《內(nèi)經(jīng)》的理論法則創(chuàng)立十六首運氣方。運氣方應(yīng)用于臨床，多有奇效，成為歷代醫(yī)家指導(dǎo)臨床用藥的圭臬。但是，目前關(guān)于運氣方的研究多為臨床個案驗案的報道[5-6]，動物實驗研究仍屬空白，導(dǎo)致運氣方臨床療效的科學(xué)性難以證實，也限制了運氣方的應(yīng)用推廣。

靜順湯出自陳無擇《三因極一病證方論》卷五，為辰戌之年，太陽寒水司天、太陰濕土在泉，全年寒濕之氣較重而設(shè)，具有溫陽散寒除濕之功。本研究開展于2018年（戊戌年），從動物實驗水平觀察運氣方靜順湯改善慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（CUMS）聯(lián)合孤養(yǎng)大鼠模型的抑郁行為的效果，并探討其作用機制，從而挖掘運氣理論對于臨床診療的重要價值，為運氣方靜順湯的臨床使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量180~220 g，購于北京斯貝福實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：11401500044265，動物許可證號：SCXK（京）2016-0002。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房，12 h晝夜循環(huán)，室溫恒定在22~24℃，相對濕度55%~65%。動物的飼養(yǎng)和使用符合國際動物倫理法，并經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準，批準號：bucm-4-2019030507-1046。

1.2 藥物與試劑靜順湯方劑組成：白茯苓30 g，木瓜干30 g，炮附子10 g，懷牛膝10 g，防風(fēng)10 g，炙甘草15 g，干姜15 g，訶子10 g。柴芩溫膽湯方藥組成：柴胡12 g，黃芩12 g，清半夏9 g，竹茹10 g，茯苓15 g，枳實12 g，陳皮15 g，炙甘草9 g。以上中藥飲片均購自北京同仁堂（亳州）飲片有限責任公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院專家鑒定合格。鹽酸氟西汀（Patheam France，禮來蘇州制藥有限公司分裝，批號：H20170003，規(guī)格：20 mg/粒）。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)標準品：去甲腎上腺素（NE，批號：088K1147）、腎上腺素（E，批號：108K0930）、多巴胺（DA，批號：062426ED）；3，4-二羥基苯乙酸（DOPAC，批號：1364209 22509196）、高香草酸（HVA，批號：107K5002）、5-羥色胺（5-HT，批號：028K5152）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA，批號：1413645 14608169）（Sigma-Aldrich公司）；內(nèi)標：3，4-二羥芐胺（DHBA，Sigma-Aldrich公司，批號：04429MO）；色譜級甲醇（Fisher，批號：186358）；L-半胱氨酸（Amresco公司，批號：20120928）；磷酸二氫鈉（Merck公司，批號：C10095211）；辛烷磺酸鈉（批號：T23B035）、乙二胺四乙酸二鈉（批號：G05R019）、氯化鉀（批號：J23R026）（Alfa Aesar公司）；蔗糖（上海國藥試劑，批號：20181010，500 g/瓶）。

1.3 主要儀器Agilent 1100LC型高效液相色譜儀，包括G1379A型脫氣機、G1311A型色譜泵、G1313A型自動進樣器、G1316A型柱溫箱（美國Agilent公司）；DECADEⅡSDC型電化學(xué)檢測器，包括玻璃碳工作電極、Ag/AgCl參比電極、工作站（Clarity CHS）（荷蘭ANTEC公司）；Biofuge Stratos高速冷凍離心機（德國HERAEUS）；VCX130型超聲破碎儀（美國SONICS）。

1.4 分組大鼠在符合SPF級標準的實驗室適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，對大鼠的糖水基線進行測試，篩選出基線均衡大鼠30只，隨機分為空白組、模型組、氟西汀組、柴芩溫膽湯組、靜順湯組，每組6只。

1.5 造模與給藥本實驗采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（CUMS）聯(lián)合孤養(yǎng)方法復(fù)制抑郁大鼠模型[7]。除空白組外，其余各組大鼠1只/籠孤養(yǎng)，接受CUMS造模刺激42 d，即根據(jù)實驗室條件，選取以下7種溫和刺激：（1）冰水游泳（4℃，5 min）；（2）束縛（3 h）；（3）禁水（24 h）；（4）禁食（24 h）；（5）夾尾（1 min）；（6）晝夜顛倒（顛倒晝夜順序，08:00:00—20:00:00模擬黑夜，20:00:00—08:00:00模擬白晝）；（7）45°籠具傾斜（24 h）。為避免大鼠產(chǎn)生應(yīng)激刺激的耐受性，造模期間，每天隨機施加1種刺激，每種應(yīng)激不在連續(xù)的2 d內(nèi)重復(fù)出現(xiàn)。7 d為1個周期，共6個周期，即造模時間為42 d?？瞻捉M大鼠6只/籠群養(yǎng)，自由攝食、飲水，不給予任何刺激；大鼠造模的同時藥物干預(yù)，治療各組于造模后30~60 min灌胃給藥。

1.6 實驗給藥靜順湯和柴芩溫膽湯復(fù)方按照傳統(tǒng)中藥煎煮方法水煎煮2次，每次30 min，合并煎液，水煎濃縮至200%（相當于生藥2 g/mL），4℃冰箱冷藏備用。鹽酸氟西汀膠囊臨用時用去離子水配成0.3 mg/mL的藥液。

大鼠灌胃給藥量按照成人平均體質(zhì)量60 kg換算成大鼠的等效藥物劑量（大鼠給藥量=成人劑量×6.17/60 kg×大鼠體質(zhì)量）。氟西汀組大鼠灌胃給予氟西汀混懸液，2.057 mg/kg；柴芩溫膽湯組大鼠灌胃給予柴芩溫膽湯，9.667 g/kg；靜順湯組大鼠灌胃給予靜順湯13.368 g/kg；空白組、模型組大鼠灌胃給予等量去離子水，各給藥組大鼠每天固定時間灌胃，1次/d，連續(xù)給藥42 d。每7 d測量一次大鼠體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量變化更新灌胃劑量。

1.7 觀察指標

1.7.1 糖水偏好實驗 在實驗開始前，訓(xùn)練所有大鼠使其適應(yīng)含1%蔗糖飲水，進行糖水基線測試和篩選，剔除不能獲得穩(wěn)定的糖水偏好值或未表現(xiàn)出糖水偏好的大鼠。分別于實驗開始前1天（0 d）、實驗開始后第7天（7 d）、第14天（14 d）、第21天（21 d）、第28天（28 d）、第35天（35 d）、第42天（42 d）進行糖水偏好實驗，計算大鼠的糖水消耗、純水消耗、總液體消耗和糖水偏好指數(shù)。糖水偏好指數(shù)=（糖水消耗/總液體消耗）×100%，比較分析給藥前后各組大鼠糖水偏好指數(shù)的差異。

1.7.2 海馬單胺神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT的測定 采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測（HPLC-ECD）測定海馬單胺神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT的含量。在完成各項行為學(xué)檢測后以斷頭法處死大鼠，快速取腦置于冰上剝離海馬。稱質(zhì)量后加入組織裂解液（0.2 mol/L高氯酸，0.01% L-半胱氨酸，0.5 mmol/L EDTA-2Na），每10 mg組織加入50 μL裂解液，冰浴超聲破碎10 s。4℃、15 000 r/min離心30 min，取上清液-80℃凍存以析出蛋白，檢測前再以15 000 r/min離心30 min，取上清液用0.22 μm耐酸過濾器過濾，取20 μL進樣檢測。

色譜條件：色譜柱為Skyam C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流動相為磷酸二氫鈉100 mmol/L，辛烷磺酸鈉0.74 mmol/L，乙二胺四乙酸鈉0.027 mmol/L，氯化鉀8 mmol/L，甲醇8%，pH值為3；流速為0.2 mL/min；柱溫為30℃；進樣量為20 μL；測定電極電勢為500 mV。檢測海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、多巴胺（DA），以及代謝產(chǎn)物3，4-二羥基苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）。各神經(jīng)遞質(zhì)含量以ng/g腦組織濕質(zhì)量表示。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS statistics 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，服從正態(tài)分布的計量資料的多組間均數(shù)總體差異的比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性時多組間均數(shù)的兩兩比較采用LSD法，不滿足方差齊性時多組間均數(shù)的兩兩比較采用Dunnett T3法。不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計圖采用GraphPad Prism 7.0軟件進行繪制。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠糖水偏好比較造模前（0 d），各組大鼠的糖水偏好比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；第28天（28 d），與氟西汀組、柴芩溫膽湯組比較，靜順湯組大鼠糖水偏好指數(shù)明顯升高（P＜0.05）；第35天（35 d），與模型組比較，柴芩溫膽湯組和靜順湯組大鼠糖水偏好指數(shù)明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。第42天（42 d），與空白組比較，模型組大鼠糖水偏好指數(shù)明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，氟西汀組、柴芩溫膽湯組、靜順湯組大鼠糖水偏好指數(shù)明顯升高（P＜0.01）；與氟西汀組比較，柴芩溫膽湯組、靜順湯組大鼠糖水偏好指數(shù)明顯升高（P＜0.01）。（見圖1）

圖1 各組大鼠不同時段糖水偏好指數(shù)比較（±s，n=6）

2.2 各組大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物含量比較

2.2.1 NE及代謝產(chǎn)物E的變化 與空白組比較，模型組大鼠海馬NE含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，氟西汀組、柴芩溫膽湯組、靜順湯組大鼠海馬NE含量明顯升高（P＜0.01或P＜0.05）。各組大鼠海馬E含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖2～3）

圖2 各組大鼠海馬NE含量比較（±s，n=6）

圖3 各組大鼠海馬E含量比較（±s，n=6）

2.2.2 DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA含量的變化 與空白組比較，模型組大鼠海馬DA及DOPAC、HVA含量有降低趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，柴芩溫膽湯組大鼠海馬DA含量明顯升高（P＜0.05），其余給藥組大鼠海馬DOPAC、HVA均有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖4～6）

圖4 各組大鼠海馬DA含量比較（±s，n=6）

圖5 各組大鼠海馬DOPAC含量比較（±s，n=6）

圖6 各組大鼠海馬HVA含量比較（±s，n=6）

2.2.3 5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIAA含量的變化 與空白組比較，模型組大鼠海馬5-HT、5-HIAA含量明顯降低（P＜0.01或P＜0.05）；與模型組比較，靜順湯組海馬5-HT含量明顯升高（P＜0.01）。（見圖7~8）

圖7 各組大鼠海馬5-HT含量比較（±s，n=6）

圖8 各組大鼠海馬5-HIAA含量比較（±s，n=6）

3 討 論

抑郁癥患者主要表現(xiàn)為情緒低落、興趣喪失、思維遲緩和認知障礙。CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)能較好地模擬臨床抑郁癥的行為和生理癥狀，是目前較為公認的抑郁癥動物模型。本研究沿用了經(jīng)典的造模方法即CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)，并通過糖水偏好實驗來評價該模型大鼠的抑郁情況[8]。其中邊造模邊給藥的方法，即在CUMS期間應(yīng)用藥物進行干預(yù)，模擬了藥物對抑郁癥的發(fā)病和進展的預(yù)防和治療作用，相比造模后篩選成功模型入組再治療的方式，更貼合中醫(yī)臨床“治未病”的思想，這種方法為較多實驗研究采用[9-11]。結(jié)果顯示，造模前各組大鼠糖水偏好基線值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。6周的造模程序?qū)е麓笫蟮奶撬弥笖?shù)明顯低于空白組，表明模型復(fù)制成功。第28天時，靜順湯組大鼠糖水偏好指數(shù)明顯高于氟西汀組和柴芩溫膽湯組，此時模型組均值低于空白組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示靜順湯提高大鼠對獎賞刺激的敏感性的作用優(yōu)于其他給藥組；第35天、第42天時，柴芩溫膽湯組、靜順湯組大鼠糖水偏好指數(shù)均明顯高于模型組，而第42天，柴芩溫膽湯組、靜順湯組大鼠糖水偏好指數(shù)明顯高于氟西汀組，一定程度表明中藥在改善抑郁大鼠快感缺失方面優(yōu)于西藥氟西汀，且靜順湯組大鼠糖水偏好指數(shù)均值高于柴芩溫膽湯組。綜合來看，靜順湯更快、更好地改善了抑郁模型大鼠的糖水偏好指數(shù)?？瞻捉M大鼠糖水偏好指數(shù)在42 d的實驗過程中波動較大，但無明顯上升或下降趨勢，可能由于空白組大鼠采用群養(yǎng)的方法，每次進行糖水偏好實驗則需改為孤養(yǎng)，大鼠生活環(huán)境發(fā)生了變化，而其余各組數(shù)據(jù)的波動可能也與環(huán)境因素相關(guān)，提示了在將來的實驗中應(yīng)改進設(shè)計，嚴格控制糖水偏好實驗的影響因素。

單胺假說是抑郁癥發(fā)病機制研究中的經(jīng)典理論之一。研究表明，抑郁癥與大腦中、低水平的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)，包括5-HT、DA和NE[12-14]。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)傳遞過程對情緒調(diào)節(jié)、心理應(yīng)激反應(yīng)、自控、動機、驅(qū)動力和認知表現(xiàn)等腦回路有重要影響[15]。海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，對記憶、行為、情緒、學(xué)習(xí)等起重要的調(diào)節(jié)作用，也是應(yīng)激反應(yīng)的高級調(diào)節(jié)中樞，慢性應(yīng)激可損害海馬，引起其功能和結(jié)構(gòu)的變化[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠海馬NE、5-HT和5-HIAA的含量均低于空白組，與文獻報道一致[17-19]。本實驗中模型組大鼠DA及代謝產(chǎn)物含量較空白組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。有研究表明，抑郁患者血漿多巴胺代謝產(chǎn)物高香草酸（HVA）和3，4-二羥基苯乙酸（DOPAC）水平明顯降低[20]；動物強迫游泳應(yīng)激后伏隔核中HVA和DOPAC濃度均降低[21]，但也有研究發(fā)現(xiàn)CUMS造模后大鼠海馬或皮層的DOPAC和HVA的水平明顯升高或無明顯差異[22-23]。與模型組比較，靜順湯組可顯著提高大鼠海馬內(nèi)NE、5-HT的含量，提示靜順湯可能通過增加模型大鼠海馬NE、5-HT含量發(fā)揮其抗抑郁作用。

臨床上柴胡類方常用于精神疾患尤其是抑郁癥的治療，因抑郁癥在中醫(yī)學(xué)中歸屬“郁證”范疇，解郁常伴疏肝，柴胡為要藥[24]。柴芩溫膽湯即是由名方溫膽湯加入柴胡、黃芩而成，具有理氣化痰、溫膽和胃之功，尤長于改善抑郁癥肝郁氣滯、痰濕阻遏之證候。因此本實驗，將柴芩溫膽湯為陽性對照中藥。有實驗研究表明，柴芩溫膽湯能有效改善抑郁癥模型小鼠抑郁表現(xiàn)，增加模型小鼠腦組織中的5-HT含量，減少MDA和NOS的損害是其發(fā)揮作用的部分機理[25]。本研究發(fā)現(xiàn)柴芩溫膽湯顯著改善了抑郁大鼠的糖水偏好指數(shù)，其均值與靜順湯結(jié)果接近；柴芩溫膽湯明顯提高了海馬NE、DA水平，其中DA水平均值高于靜順湯組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；其對海馬5-HT含量的改變并不明顯，分析其原因，可能與本實驗研究腦區(qū)僅局限于海馬有關(guān)，推測柴芩溫膽湯對不同腦結(jié)構(gòu)的單胺神經(jīng)遞質(zhì)有不同的干預(yù)效應(yīng)，還需進一步探究。

陳無擇的三因司天方是將運氣理論應(yīng)用于臨床的較為完善的方藥體系。其根據(jù)運氣七篇大論中關(guān)于不同中運、司天、在泉的運氣特點，創(chuàng)立了16首針對每年易發(fā)疾病的方劑，簡稱“運氣方”。其中靜順湯，主治“辰戌之歲，病身熱頭痛，嘔吐，氣郁中滿，瞀悶少氣，足痿，注下赤白，肌腠瘡瘍，發(fā)為癰疽”。靜順湯方中以防風(fēng)通行十二經(jīng)，與炮附子合用以逐表里之寒濕，木瓜酸溫入脾之血分，合干姜以溫煦太陰，茯苓、牛膝引附子以達下焦，甘草、防風(fēng)引干姜以入脾土，訶子之酸溫，醒脾助運，同時借助其酸斂，將所補之火潛藏下焦，以防僭越傷肺[26]。全方針對寒濕之氣而設(shè)，而抑郁癥是神氣失養(yǎng)而表現(xiàn)出的虛損低落之癥，“陽氣者，精則養(yǎng)神”，正是戊戌年的寒濕之氣加重了陽氣耗散，更容易表現(xiàn)出低落萎靡之癥。另外，本實驗開展于2018年11月22日至12月30日，正是六氣中終之氣的時節(jié)，太陰濕土加臨太陽寒水，土克水，濕令行，“寒濕交加，民病慘悽”。靜順湯溫陽散寒濕，正以此立方，所以能較好地改善抑郁模型大鼠的抑郁狀態(tài)。

綜上所述，具有溫陽散寒濕作用的運氣方靜順湯對模型大鼠抑郁癥狀具有較好的改善作用，提高海馬的NE、5-HT可能是其發(fā)揮抗抑郁作用的機制之一。靜順湯較柴芩溫膽湯抗抑郁樣行為的作用更明顯，一定程度說明了偏于寒濕的運氣特點，可能對本年抑郁癥大鼠模型的發(fā)病有所影響，靜順湯相對于理氣化痰之柴芩溫膽湯更切中病機。