奚倩慧，楊華元，白姍姍，周子依，舒 婭

（上海中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，上海 201203）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是青春期和育齡期女性常見生殖內分泌疾病，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)或持續(xù)性無排卵，多毛、痤瘡等高雄激素癥狀，以及卵巢多囊樣形態(tài)學改變。PCOS發(fā)病率達5%～10%[1]，是女性不孕的重要原因。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）伴隨PCOS的發(fā)病率可達44%～77%[2]，IR可加速雄激素合成，是PCOS發(fā)病與發(fā)展的關鍵因素，由此形成代謝與生殖功能的交互紊亂。

近年來，“中樞代謝-生殖整合”理論形成并提出，認為循環(huán)中的瘦素（Leptin，LEP）、脂聯(lián)素、胃饑餓素等代謝因子可將代謝信號傳遞至下丘腦弓狀核區(qū)域的Kisspeptin（KP）神經(jīng)元，作為生殖中樞的KP神經(jīng)元整合各類代謝信息，通過調控其所分泌的KP神經(jīng)肽影響下丘腦GnRH神經(jīng)元，開啟和維持機體的生殖功能[3-4]。該理論揭示了代謝狀態(tài)與生殖功能的關聯(lián)性。由于電針在治療PCOS過程中能同時影響生殖內分泌與代謝功能，可能與其調節(jié)下丘腦LEP表達，并溝通KP神經(jīng)元，即下丘腦LEP/KP信號傳導有關。該信號可下達至下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸，體現(xiàn)電針干預對代謝信號與生殖中樞的聯(lián)動效果，從而實現(xiàn)同時改善生殖內分泌與代謝功能的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物3～4周齡SPF級雌性健康SD大鼠50只購于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心，體質量：50～60 g，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，適應性飼養(yǎng)5 d。實驗過程中對動物的處理均遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》，并經(jīng)上海中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑硫酸普拉睪酮鈉（上海源葉，1 g/瓶，批號：Y20S10Y98237）；鹽酸二甲雙胍片（中美施貴寶，0.5 g/片，批號：AAC5032，國藥準字號：H20023370）；ELISA試劑盒：FINS（中國臺灣Abnova，批號：KA3811），T（批號：XYE1289105）、FSH（批號：XYE1287931）、LH（批號：XYE1290417）、LEP（批號：XYE1277645）（上海信裕）；蘇木素試劑（批號：714094）、伊紅試劑（批號：BA4099）（珠海貝索）；SYBR Green PCR試劑盒（美國Thermo Fisher，批號：KAA0223S）；逆轉錄試劑盒（立陶宛Fermentas，批號：WKHF16225）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher，批號：PICPI23223）；Leptin抗體（北京博奧森，批號：BS0409R）；Kisspeptin抗體（英國Abcam，批號：AB19028）；GAPDH抗體（美國Proteintech，批號：6000411G）；羊抗兔HRP標記二抗（上海碧云天，批號：A0208）。

1.3 主要儀器一次性無菌針灸針（0.3 mm×25 mm，華佗牌）；G9805型低頻電子脈沖治療儀（上海醫(yī)用電子儀器廠）；SQ2125型石蠟切片機（中國徠克）；ECLIPSE Ni顯微鏡（日本NIKON）；MK3酶標儀（芬蘭Labsystems）；7300Real-time檢測儀（美國ABI）；mini protean 3 cell電泳儀（美國BIO-RAD）；PS-9電轉儀（大連競邁）。

1.4 造模與分組

1.4.1 造模方法 隨機選取42只大鼠作為造模組，根據(jù)謝陽等[5]的建模方法，采用硫酸普拉睪酮鈉合并高脂飼料喂養(yǎng)誘導建立模型，造模組每日按體質量9 mg/100 g稱取硫酸普拉睪酮鈉，溶解于0.2 mL純水，頸背部皮下注射。同時給予40%高脂飼料[上海斯萊康，含繁殖鼠料（54.6g/100g）、豬油（16.9 g/100 g）、蔗糖（14 g/100 g）、酪蛋白（10.2 g/100 g）、預混料（2.1 g/100 g）、麥芽糊精（2.2 g/100 g）]喂養(yǎng)。另隨機取8只大鼠作為空白組，每日0.2 mL純水頸背部皮下注射，常規(guī)飼料喂養(yǎng)。連續(xù)21 d。

1.4.2 模型鑒定與分組 造模第12天起，每日取陰道分泌物，10%亞甲蘭染色，顯微鏡下觀察表層細胞與底層細胞分布比例，判定動情期。以連續(xù)10 d（即2個動情周期）陰道脫落細胞失去規(guī)律性變化、無明顯動情周期，提示無排卵，判定為PCOS造模成功。PCOS造模成功大鼠于第21天晚禁食，次晨目內眥取血，快速血糖儀測空腹血糖（FPG），酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測空腹胰島素（FINS）。計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FPG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5。以HOMA-IR＞2.8為造模成功的PCOS合并IR大鼠。判定結果為：24只大鼠PCOS合并IR造模成功。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、西藥組和電針組，每組8只；空白組8只大鼠有規(guī)律排卵周期，可用于后續(xù)實驗。

1.5 實驗給藥與干預電針組大鼠于特制固定裝置制動，參照《實驗針灸學》“常用實驗動物針灸穴位”，選用“關元”、“中脘”、雙側“三陰交”及雙側“足（后）三里”，直刺穴位2～5 mm，針柄連接電刺激儀，關元、中脘一組，三陰交、后三里雙側各一組；采用疏密波，頻率為4/20 Hz，治療20 min，并每日予2 mL純水灌胃1次，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)干預28 d。西藥組大鼠按體質量250 mg/kg劑量將鹽酸二甲雙胍片溶于2 mL純水，每日灌胃1次，并采用電針組固定法制動20 min，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)給藥28 d。模型組大鼠繼予高脂飼料喂養(yǎng)，每日采用電針組固定法制動20 min，2 mL純水灌胃1次，連續(xù)干預28 d?？瞻捉M大鼠予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，每日采用電針組固定法制動20 min，2 mL純水灌胃1次，連續(xù)干預28 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 取材 治療第28天晚禁食，次日大鼠予2%戊巴比妥鈉麻醉，沿劍突方向開腹，取腹主動脈血，快速血糖儀測FPG，后將血液樣本液氮速凍，24 h后轉入-80℃冰箱保存待檢。分離卵巢，洗凈、吸干，稱重后于10%福爾馬林溶液固定，24 h后轉入-80℃冰箱。固定頭部，用咬骨鉗打開顱骨，剝離腦膜，快速分離并取出全腦。根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》（人民衛(wèi)生出版社，第三版），于大腦腹面下丘腦結節(jié)區(qū)，定位弓狀核區(qū)域（前囟后2.0 mm～4.5 mm，中縫旁0.5 mm，緊靠正中隆起處），切取含弓狀核的下丘腦組織，液氮速凍后轉入-80℃冰箱保存待檢。

1.6.2 血清睪酮（T）、促黃體生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）、空腹胰島素（FINS）和瘦素（LEP）水平 采用ELISA法。根據(jù)試劑盒說明書，在孔板中加入相應標準品和待測樣品，將辣根過氧化物酶標記的檢測抗體添加到標準品孔和待測樣品孔中，封板搖勻，37℃孵育60 min。棄液，洗滌，拍干。每孔加酶標試劑，封板，37℃溫育60 min。棄液，洗滌，拍干。先后加入A、B顯色劑混勻，37℃避光孵育10 min。以空白孔調零，加入終止液后用酶標儀在450 nm波長測量各孔OD值，計算樣本濃度。

1.6.3 卵巢病理學觀察 采用蘇木素-伊紅染色（Hematoxylin-Eosin，HE）法。10%福爾馬林溶液固定后，乙醇逐級脫水，二甲苯液洗滌。恒溫箱中蠟化，冷凝后取出切片。65℃烤片，二甲苯液脫蠟，乙醇逐級浸泡，放入蘇木素溶液染色，氨水分色。清水沖洗后置入70%、90%乙醇脫水，放入伊紅乙醇溶液染色，無水乙醇脫水。置于二甲苯液中透明，中性樹膠封片，65℃烘干。光學顯微鏡下10×40倍觀察并拍照。

1.6.4 下丘腦LEP mRNA、Kiss-1（Kisspeptin編碼基因）mRNA和促性腺素釋放激素（GnRH）mRNA表達水平 采用實時PCR法?？俁NA提?。合虑鹉X組織于Trizol中勻漿提取，加氯仿-異丙醇-75%乙醇-無水乙醇洗滌，加DEPC水溶解RNA。按試劑盒說明，消除總RNA中的DNA（反應程序：37℃，30 min；加1 μL EDTA；65℃，10 min）及反轉錄（反應程序：37℃，60 min；85℃，5min；4℃，5min）。將cDNA進行PCR擴增，引物序列LEP，F(xiàn)：5'-CTGTGGCTTTGGTCCTATC-3'，R：5'-CAAGCTGGTGAGGATCTGT-3'；Kiss-1，F(xiàn)：5'-TGCTGCTTCTCCTCTGTG-3'，R：5'-AGGCTTGCTCTCTGCATA-3'；GnRH，F(xiàn)：5'-GGAGTCTACTGGCGTCTTC-3'，R：5'-TCCTCCTTGCCCATCTCT-3'；GAPDH，F(xiàn)：5'-GGAGTCTACTGGCGTCTTC-3'，R：5'-ATGAGC CCTTCCACGAT-3'。數(shù)據(jù)采用ABI Prism 7300 SDS Software分析。

1.6.5 下丘腦LEP、KP蛋白表達水平 采用蛋白質印跡（Western blotting）法。隨機選取3個樣本，按每20 mg組織碎片150～250 μL比例加入RIPA裂解液，勻漿至裂解，離心后取上清。BCA法測定蛋白濃度。將配制好的PAGE膠放入電泳槽中，將樣品加入對應孔內。電泳，半干式轉膜。2%麗春紅染色蛋白檢測。5%脫脂奶封閉，抗體加入封閉液中稀釋，4℃孵育過夜。TBST洗滌，羊抗兔HRP標記二抗，37℃孵育1 h。TBST洗滌后加ECL發(fā)光液。放入成像系統(tǒng)掃描，Image lab分析。

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 24.0軟件統(tǒng)計，計量資料用“均數(shù)±標準差”（±s）表示。多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，方差齊時采用Bonferroni檢驗比較、方差不齊時采用Dunnett`s T3檢驗比較；不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗法比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠性激素指標比較與空白組比較，模型組大鼠血清T、LH水平明顯升高、FSH水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，西藥組大鼠血清T、LH水平明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），電針組大鼠血清LH水平明顯降低（P＜0.01）。電針組大鼠血清T、LH和FSH水平與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組血清性激素及LEP水平比較（±s）

表1 各組血清性激素及LEP水平比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

血清性激素水平 血清LEP T(ng/mL) LH(ng/L) FSH(IU/L) 水平(μg/L)空白組 8 0.60±0.21 4.41±1.43 3.25±1.00 0.90±0.43模型組 8 1.06±0.30a 12.54±3.27a 1.66±0.58a 3.06±0.88a西藥組 8 0.64±0.13b 6.12±3.16c 2.14±0.63 1.61±0.59c電針組 8 0.75±0.24 5.97±2.74c 2.16±0.45 1.52±0.34c組別 動物數(shù)（只）

2.2 各組大鼠卵巢HE染色觀察空白組大鼠卵巢結構清晰、形態(tài)正常，可見黃體和不同發(fā)育階段卵泡；模型組大鼠卵巢內多見囊性擴張卵泡，卵泡腔內卵母細胞或放射冠缺失，各階段發(fā)育期卵泡及黃體少見，顆粒細胞層數(shù)減少；西藥組大鼠卵巢內少量囊性擴張卵泡及封鎖卵泡，部分卵泡腔內可見卵母細胞及放射冠；電針組大鼠卵巢內少量囊性擴張卵泡及封鎖卵泡，可見各發(fā)育期卵泡及黃體。（見圖1）

圖1 各組大鼠卵巢組織病理圖（HE，×400）

2.3 各組大鼠糖代謝指標比較治療前，空白組、模型組、西藥組和電針組大鼠血清FPG水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；模型組、西藥組和電針組大鼠血清FINS水平及HOMAIR明顯高于空白組（P＜0.01），且3組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療后，與空白組比較，模型組大鼠血清FPG、FINS水平及HOMA-IR明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組大鼠血清FINS水平、HOMA-IR降低（P＜0.05）；電針組大鼠HOMA-IR低于模型組（P＜0.05）；電針組大鼠血清FPG、FINS水平和HOMA-IR與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠治療前后血清FPG、FINS水平與HOMA-IR比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.01，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05

血清FPG(mmol/l) 血清FINS(μIU/mL) HOMA-IR治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后空白組 8 4.28±0.63 4.50±0.54 17.30±1.50 18.77±1.08 3.32±0.73 3.74±0.33模型組 8 5.03±0.52 8.28±0.71b 26.18±5.91a 30.15±6.01b 5.84±1.27a 11.13±2.64b西藥組 8 5.03±0.41 8.30±0.92 26.74±3.85a 22.31±2.67c 6.01±1.16a 8.26±1.64c電針組 8 4.54±0.38 8.01±0.83 26.30±3.45a 23.03±1.71 5.29±0.77a 8.20±1.01c組別 動物數(shù)（只）

2.4 各組大鼠血清LEP水平比較與空白組比較，模型組大鼠血清LEP明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組與電針組大鼠血清LEP水平均明顯降低（P＜0.01）；電針組大鼠血清LEP水平與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表1）

2.5 各組大鼠下丘腦各物質mRNA表達比較與空白組比較，模型組LEP mRNA表達明顯降低（P＜0.01），Kiss-1 mRNA、GnRH mRNA表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和電針組LEP mRNA表達均明顯升高（P＜0.01），Kiss-1 mRNA表達與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；西藥組GnRH mRNA表達與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；電針組GnRH mRNA表達降低（P＜0.05），電針組LEP mRNA、Kiss-1 mRNA和GnRH mRNA表達與西藥組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠LEP mRNA、Kiss-1 mRNA和GnRH mRNA相對表達比較（±s，GAPDH·10-3）

表3 各組大鼠LEP mRNA、Kiss-1 mRNA和GnRH mRNA相對表達比較（±s，GAPDH·10-3）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別 動物數(shù)（只）LEP mRNA Kiss-1 mRNA GnRH mRNA空白組 8 23.88±10.17 12.42±0.70 6.37±1.80模型組 8 7.45±4.47a 27.55±11.65a 21.71±10.54a西藥組 8 15.08±3.34c 24.61±5.87c 13.75±5.40b電針組 8 14.90±4.10c 21.44±8.05c 10.59±5.25c

2.6 各組大鼠下丘腦各物質蛋白表達比較與空白組比較，模型組LEP蛋白表達明顯降低（P＜0.01），KP蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；西藥組LEP、KP蛋白表達與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，電針組LEP蛋白表達升高（P＜0.05），KP蛋白表達與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；電針組LEP和KP蛋白表達與西藥組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖2、表4）

圖2 各組大鼠LEP和KP蛋白相對表達灰度比較

表4 各組大鼠LEP和KP蛋白相對表達灰度值比較（±s，GAPDH·10-2）

表4 各組大鼠LEP和KP蛋白相對表達灰度值比較（±s，GAPDH·10-2）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

組別 動物數(shù)（只） LEP Kp空白組 3 65.08±9.49 19.10±3.36模型組 3 35.84±10.41a 54.09±2.53a西藥組 3 48.38±4.16 47.81±4.30電針組 3 58.51±2.49b 40.99±9.26

3 討 論

PCOS中醫(yī)發(fā)病機理為臟腑功能失調，尤其是肝脾腎功能失調[6]引起的痰瘀互結阻滯沖任，引起胞宮失序。肝腎同源、互生精血，脾胃化精而生津統(tǒng)血，故肝脾腎功能失調可致精津血不能正化，反生痰飲、瘀血等病理產(chǎn)物，從而阻滯沖任。沖任是聯(lián)系臟腑與胞宮的經(jīng)絡、運行氣血的通道，乃女性生殖關鍵。吳效科團隊提出中西醫(yī)結合PCOS病機理論，認為“沖任”的生理作用包含了代謝與能量信息的整合與傳遞、生殖微環(huán)境的精準協(xié)調，以及以生殖為核心的整個機體功能的動員[7-8]。本實驗選用關元、三陰交補腎培元、疏肝通絡，足三里、中脘健脾化濕、消食導滯；且關元、中脘在任脈，三陰交聯(lián)絡足三陰經(jīng)與沖任相通，足三里所在足陽明經(jīng)與沖脈交會，諸穴共用不僅可以調補肝腎、健脾通絡以祛瘀化痰，還能疏導臟腑氣血灌注沖任，沖任充盛則胞宮滋盈。

臨床試驗表明，電針可降低PCOS患者IR程度，改善脂代謝，并恢復性激素水平[9]，對PCOS合并IR模型動物也有相似效果[10]。研究顯示，電針在治療PCOS過程中調節(jié)了少量中樞阿片肽，反饋性影響生殖中樞GnRH及下游LH和FSH的分泌[11]。實驗結果顯示，電針后模型大鼠下丘腦GnRH mRNA表達降低、LH下降，提示電針對生殖內分泌的作用可能從下丘腦開始，自性腺軸產(chǎn)生連續(xù)良性反饋。此外，電針兼具改善糖脂代謝療效。二甲雙胍可促進糖原利用，通過增加胰島素受體，提高胰島素敏感性，臨床廣泛應用于合并IR的PCOS患者。在本實驗中，通過對所有大鼠共同進行束縛制動及灌胃操作，避免了不同操作手法對治療結果造成的誤差。結果顯示，二甲雙胍治療PCOS合并IR的作用與電針治療相比，對改善生殖內分泌與代謝功能的作用無顯著差異。

LEP由脂肪細胞分泌，存在于外周血循環(huán)并表達于下丘腦，可以調節(jié)能量和生殖，與IR[12]及PCOS[13]發(fā)病有關。“中樞代謝-生殖整合”理論提出，LEP可將外周代謝信息傳遞至下丘腦生殖中樞，通過結合KP神經(jīng)元上的LEP受體，直接調控KP神經(jīng)元表達；或結合NPY/AgRP、POMC/CART等神經(jīng)元上的LEP受體，并通過這些神經(jīng)元與KP神經(jīng)元之間的信號互通，間接改變KP神經(jīng)元活性[14]。Kisspeptin（KP）神經(jīng)元主要分布在下丘腦弓狀核，由Kiss-1基因編碼，是生殖中樞的戰(zhàn)略組成部分，其分泌的神經(jīng)肽KP可與GnRH神經(jīng)元上的特異性受體結合，調節(jié)GnRH分泌，繼而影響HPO軸活動，開啟和維持生殖內分泌[15]。

實驗結果顯示，電針治療可以增加PCOS合并IR大鼠下丘腦（含弓狀核）LEP基因轉錄和蛋白表達水平，降低KP的基因轉錄水平。研究顯示，電針可以提升下丘腦LEP水平治療單純性肥胖[16]，且調節(jié)腦缺血再灌注損傷相關血腦屏障通透性[17]。結合本實驗推測，電針可能改善病理因素引起的LEP血腦屏障通透水平降低，促進LEP由外周向中樞的輸送，從而改變下丘腦LEP表達。研究顯示，電針可以激活去卵巢大鼠下丘腦KP系統(tǒng)，并調節(jié)GnRH及外周雌激素水平[18-19]。結合本實驗推測，電針可能通過影響下丘腦LEP/KP信號途徑，增加下丘腦LEP表達、降低KP表達，改善GnRH分泌，從而調節(jié)HPO軸活動及相關代謝紊亂，可能是治療PCOS的潛在機制。由于二甲雙胍可以在腦部各區(qū)域表達[20]，結合本實驗推測，二甲雙胍可能跨越血腦屏障，影響下丘腦LEP和KP表達，其效果與電針相當。

綜上，電針調節(jié)了代謝信號LEP，并傳遞至下丘腦影響KP表達，體現(xiàn)了生殖信號接受代謝信號的調節(jié)，及兩者在中樞的傳導作用，符合“沖任”生理內涵所包含的對中樞、外周及微環(huán)境中與生殖相關信號的傳遞與整合作用。這一系列信號活動，是激發(fā)自身修復功能，開展整體協(xié)作的積極響應。電針可以影響下丘腦LEP/KP信號傳導，可能是其同時調節(jié)PCOS生殖內分泌與代謝功能的作用機制，為進一步推廣電針治療該疾病提供新的實驗依據(jù)。