黃爭(zhēng)榮，林 浩，林錦培，王 泳，何火聰，賴義勤

（福建省腫瘤醫(yī)院/福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，福建 福州 350014）

原發(fā)性肝癌（簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌）是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)患者約占全球肝癌發(fā)病的55%[1]。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，且惡性程度高，病情發(fā)展迅速，確診時(shí)往往病情已進(jìn)入晚期，而肝癌對(duì)放化療不敏感，因此晚期肝癌臨床治療效果總體不佳。

通關(guān)藤為蘿藦科牛奶菜屬植物，別稱(chēng)通光藤、烏骨藤，始記載于《滇南本草》，味苦，性微甘、涼，具有清熱解毒、止咳平喘、祛痰等功效[2]。研究表明，通關(guān)藤提取物治療晚期原發(fā)性肝癌，具有較好的抗腫瘤療效，能改善患者生活質(zhì)量[3-4]。通關(guān)藤抗腫瘤作用的具體機(jī)制尚不明確，因此本實(shí)驗(yàn)以人肝癌細(xì)胞株HepG2為模型，探討通關(guān)藤提取物促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用及其相關(guān)機(jī)制，為更好地開(kāi)發(fā)利用通關(guān)藤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥物與試劑MTE（南京圣和藥業(yè)有限公司，商品名：消癌平注射液，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025868，生藥濃度為2.5 g/mL）；胰蛋白酶-EDTA（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：J170049）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：NWM0534）；Annexin V-FITC/PI雙染法試劑盒（美國(guó)Becton Dickinson公司，批號(hào)KGA107）；JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：C2006）；BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：23235）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：32132）；一抗兔抗人Bcl-2、Bax、Cytochrome-c、Caspase-3、Caspase-9多克隆抗體及二抗辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.2 主要儀器超凈工作臺(tái)（江蘇蘇州凈化設(shè)備公司）；3111型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Electron公司）；Mikro高速離心機(jī)（德國(guó)Hettieh公司）；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson公司）；Tetra凝膠電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；4000MM PRO凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Carestream公司）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞系由福建省腫瘤醫(yī)院放射生物學(xué)研究室傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以不含MTE的DMEM培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，以不同濃度MTE處理的肝癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況將HepG2細(xì)胞按2×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞貼壁，加入低、中、高劑量MTE（終濃度為15、20、30 mg/mL），同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（0 mg/mL）和調(diào)零組，每組3個(gè)復(fù)孔，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入MTT溶液10 μL/孔，再置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸去上層清液。每孔加入100 μL DMSO，放置振蕩搖床上低速震蕩10 min，待產(chǎn)生的藍(lán)紫色結(jié)晶溶解后，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定各孔OD值。計(jì)算抑制率：抑制率=（1-藥物處理組OD值/空白對(duì)照組OD值）×100%。

2.3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡將HepG2細(xì)胞按5×104個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度MTE（終濃度分別為15、20、30 mg/mL）。作用24 h后，用胰酶消化收集細(xì)胞，并用預(yù)冷的PBS洗滌2次。根據(jù)Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，收集1×106細(xì)胞至離心管，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI室溫下避光反應(yīng)15 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。

2.4 JC-1染色法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位細(xì)胞處理同“2.3”，作用24 h后取出細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化處理細(xì)胞，PBS沖洗2次，加入0.5 mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻，放置37℃孵育20 min后，加入JC-1 Buffer重懸細(xì)胞2次，離心沉淀細(xì)胞，加入適量PBS重懸沉淀，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。綠色熒光通過(guò)FL1通道檢測(cè)，紅色熒光通過(guò)FL2通道檢測(cè)，以紅、綠熒光強(qiáng)度的相對(duì)比值來(lái)衡量線粒體膜電位去極化程度。

2.5 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于6孔板，24 h后加入不同濃度的MTE（終濃度分別為15、20、30 mg/mL）處理24 h。離心收集細(xì)胞，向各孔加入適量PMSF裂解液，收集上清液，用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。將定量的蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，120 V恒壓1 h轉(zhuǎn)移至NC膜，3%BSA于4℃封閉過(guò)夜，TTBS（Tris-HCl 20 mmol/L，pH 7.2，NaCl 150 mmol/L，吐溫-20 0.1%）洗膜，分別加入Bcl-2、Bax、Cytochrome-c、Caspase-3、Caspase-9一抗與膜上抗原結(jié)合，用相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗與其反應(yīng)后加ECL化學(xué)發(fā)光試劑，多功能成像分析系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)并分析。以目的蛋白與內(nèi)參照β-actin蛋白電泳條帶的吸光度比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，每組實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。計(jì)量資料采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 MTE對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度藥物處理HepG2細(xì)胞24 h后，低、中、高濃度MTE對(duì)HepG2細(xì)胞增殖均表現(xiàn)明顯抑制作用，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），抑制率隨藥物濃度的增加而增加，呈劑量依賴效應(yīng)關(guān)系。（見(jiàn)表1）

表1 各組HepG2細(xì)胞增殖比較（±s，n=3）

表1 各組HepG2細(xì)胞增殖比較（±s，n=3）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.01

組別 給藥濃度（mg/mL） 抑制率（%）空白對(duì)照組 0 0 MTE低劑量組 15 17.36±2.47a MTE中劑量組 20 41.92±2.64a MTE高劑量組 30 56.81±3.11a

3.2 MTE對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響隨著MTE濃度的增加，HepG2細(xì)胞24 h后的凋亡率明顯升高，并且凋亡程度呈濃度依賴性，各實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（見(jiàn)圖1、表2）

圖1 各組HepG2細(xì)胞凋亡情況

表2 各組HepG2細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=3）

表2 各組HepG2細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=3）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.01

組別 給藥濃度（mg/mL） 凋亡率（%）空白對(duì)照組 0 5.92±0.23 MTE低劑量組 15 7.97±0.16a MTE中劑量組 20 8.42±0.20a MTE高劑量組 30 16.26±0.74a

3.3 MTE對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響空白對(duì)照組HepG2細(xì)胞線粒體膜電位（FL-2/FL-1）為4.33±0.18，MTE低、中、高劑量組HepG2細(xì)胞線粒體膜電位分別下降至2.86±0.12、1.25±0.08、0.81±0.07，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（見(jiàn)圖2）

圖2 各組HepG2細(xì)胞線粒體膜電位比較（±s，n=3）

3.4 MTE對(duì)HepG2細(xì)胞相關(guān)蛋白的影響MTE低劑量組Bax表達(dá)與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MTE中、高劑量組可以上調(diào)Bax、Cytochrome-c、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達(dá)（P＜0.01或P＜0.05）。MTE各劑量組均可以下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見(jiàn)圖3、表3）

圖3 各組HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白電泳條帶

表3 各組HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s，n=3）

表3 各組HepG2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s，n=3）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別 給藥濃度(mg/mL)Bcl-2 Bax Cytochrome-c Caspase-9 Caspase-3空白對(duì)照組 0 0.522±0.026 0.133±0.007 0.284±0.043 0.125±0.011 0.154±0.006 MTE低劑量組15 0.371±0.031b 0.154±0.006 0.448±0.040b 0.164±0.012a 0.281±0.015b MTE中劑量組20 0.326±0.022b 0.347±0.027b 0.657±0.049b 0.255±0.013b 0.426±0.017b MTE高劑量組30 0.248±0.023b 0.464±0.035b 0.761±0.042b 0.685±0.031b 0.482±0.011b

4 討 論

目前治療晚期肝癌有效藥物較少，中藥因具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、副作用低等特點(diǎn)，在治療肝癌方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，從中藥中尋找新型安全有效的抗肝癌藥物已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[5]。通關(guān)藤具有廣泛的藥理活性，包括平喘、降壓、免疫調(diào)節(jié)、保肝利尿等[6]。近年來(lái)，越來(lái)越多研究表明通關(guān)藤具有較強(qiáng)的抗肝癌活性[7-9]，臨床上治療肝癌也獲得較好的療效[10-11]，但探討其具體作用機(jī)制的研究仍較少。

細(xì)胞凋亡又稱(chēng)程序性死亡，是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由細(xì)胞自身基因調(diào)控的細(xì)胞死亡形式[12]。腫瘤的發(fā)生不僅是分裂失控導(dǎo)致的細(xì)胞過(guò)度增生，同時(shí)也是細(xì)胞凋亡通路受阻，使本該死亡的細(xì)胞繼續(xù)存在而產(chǎn)生腫瘤。在各種致癌因素作用下，基因發(fā)生突變，影響細(xì)胞增殖與死亡機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞增殖過(guò)度，凋亡減弱，細(xì)胞數(shù)量無(wú)限增多，在病變部位堆積而形成腫瘤。細(xì)胞凋亡機(jī)制障礙既是腫瘤發(fā)生的重要早期事件，也是伴隨其全程的重要病理現(xiàn)象[13]。目前抗腫瘤的一項(xiàng)重要干預(yù)策略是通過(guò)誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，使腫瘤自然消亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，MTE處理HepG2細(xì)胞24 h后，HepG2細(xì)胞增殖明顯下降，各劑量組細(xì)胞凋亡率均明顯高于空白對(duì)照組，表明MTE具有誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用，并隨著藥物濃度增加，細(xì)胞凋亡率相應(yīng)增加，具有一定的劑量依賴性。

目前研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡的主要途徑有兩條：外源性死亡受體途徑和內(nèi)源性線粒體凋亡途徑。Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑的主要調(diào)控因子[14]，包括Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡因子和Bax、Bak等促凋亡因子。在致凋亡因子的刺激下，Bcl-2維持線粒體膜完整性的作用下降，Bax易位至線粒體膜外，引起線粒體膜通透性發(fā)生改變，繼而線粒體跨膜電位降低而去極化，線粒體基質(zhì)中釋放出Cytochrome-c等活性因子，Cytochrome-c進(jìn)入胞質(zhì)在ATP/dATP的協(xié)同作用下與凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）結(jié)合形成寡聚體，激活Caspase-9，進(jìn)而活化下游Caspase-3等酶系。激活的Caspase-3可以水解包括細(xì)胞調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA修復(fù)等環(huán)節(jié)中重要的蛋白，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15-16]。由此可見(jiàn)，在線粒體凋亡途徑中，線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中早期發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[17]，Caspases家族在細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路中具有中心主導(dǎo)作用[18]，其中Caspase-3更是起著關(guān)鍵的功能[19]，一旦Caspase-3被激活，不可避免誘發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)MTE處理24 h后，HepG2細(xì)胞Bcl-2表達(dá)顯著下降，Bax表達(dá)顯著升高，線粒體膜電位下降，Cytochrome-c、Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)顯著上調(diào)，提示MTE能夠啟動(dòng)內(nèi)源性線粒體凋亡途徑相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。