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        滇黃精多糖對低濃度鏈脲佐菌素所致的糖尿病腎病小鼠的影響

        2021-11-23 03:54:46劉智君梁志敏楊慧瑜陳玉蓮
        中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2021年1期
        關(guān)鍵詞:黃精纈沙坦空白對照

        劉智君,徐 錦,梁志敏,楊慧瑜,陳玉蓮

        (玉林市中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院,廣西 玉林 537000)

        糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿?。╠iabetes mellitus,DM)一種常見的腎臟微血管損傷并發(fā)癥,腎臟組織長期處于高血糖的環(huán)境中,因氧化應(yīng)激反應(yīng)而使腎組織受損,出現(xiàn)腎功能障礙[1]。由于糖尿病是一種終身的內(nèi)分泌代謝紊亂疾病,故糖尿病患者后期多會(huì)出現(xiàn)DN并發(fā)癥。目前對糖尿病腎病的治療手段及藥品不多,主要為患者出現(xiàn)腎功能不全或障礙后,在控制患者血糖的同時(shí)給予血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和鈣拮抗劑進(jìn)行綜合的調(diào)節(jié)[2]。因此,探索出治療DN的藥物對DN的防治具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

        滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl為生長于云南的百合科黃精屬植物的干燥根莖,是《中華人民共和國藥典》規(guī)定作為黃精使用的3種原生藥之一,具有養(yǎng)陰潤肺、補(bǔ)脾益氣的功效。滇黃精的主要成分為多糖、甾體皂苷、黃酮等物質(zhì),具有增強(qiáng)免疫力、降血糖、降血脂等藥理作用[3]。鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)對胰腺組織的損傷程度會(huì)隨其濃度的增大而增大,高濃度的STZ易徹底造成胰腺組織喪失胰島素分泌能力,而形成1型糖尿病模型。而低濃度STZ可誘導(dǎo)2型糖尿病的形成并隨著時(shí)間的推移及病情的發(fā)展,出現(xiàn)糖尿病腎病的并發(fā)癥。本研究采用低濃度鏈脲佐菌素多次誘導(dǎo)的糖尿病小鼠構(gòu)建糖尿病腎病小鼠模型,探討滇黃精多糖對DN小鼠的影響。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級雄性昆明種小鼠60只,體質(zhì)量18~22 g,購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(桂)2017-0005。小鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)良好的環(huán)境,室溫18~25℃,相對濕度40%~70%,12 h光照晝夜循環(huán)。本研究嚴(yán)格按動(dòng)物倫理要求進(jìn)行研究實(shí)驗(yàn)。

        1.2 藥物與試劑藥材滇黃精由廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室朱丹副教授鑒定為百合科黃精屬植物滇黃精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl的干燥根莖。滇黃精多糖由本實(shí)驗(yàn)室采用“水提醇沉法”制備所得。纈沙坦片(海南皇隆制藥股份有限公司,批號(hào):180125);鏈脲佐菌素(美國Sigma公司,批號(hào):B1857);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司,批號(hào):20190117);白介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司,批號(hào):20181229);白介素-6(IL-6)ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司,批號(hào):20190115);轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào):B1903C);纖維連接蛋白(FN)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào):B1901D)。

        1.3 主要儀器羅氏卓越型血糖儀(瑞士ACCU-CHEK Performa);7100型全自動(dòng)血生化分析儀(日本HITACHI);H-7650型透射電鏡(日本HITACHI);9602A酶標(biāo)儀(北京艾普生設(shè)備有限公司)。

        1.4 造模與分組50只雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將小鼠禁食不禁水12 h,用4℃的枸櫞酸緩沖液(pH=7.4)所溶解的STZ溶液,對50只昆明種小鼠進(jìn)行尾靜脈注射STZ(40 mg/kg,STZ配制后需2 min內(nèi)用完,超2 min的藥物不留存使用),1次/d,連續(xù)注射3 d[4]。末次注射1周后,檢測小鼠空腹血糖(FBG),以FBG≥11.1 mmol/L為糖尿病小鼠,繼續(xù)予高脂高糖飲食飼料喂養(yǎng)90 d。通過檢測小鼠24 h尿量、尿蛋白腎功能指標(biāo)驗(yàn)證其損傷的存在,糖尿病腎病小鼠模型形成。將成模的小鼠隨機(jī)分為模型組,纈沙坦組和滇黃精多糖低、中、高劑量組,每組10只。另取10只健康昆明種雄性小鼠設(shè)為空白對照組。

        1.5 實(shí)驗(yàn)給藥纈沙坦組小鼠灌胃予生理鹽水配制的纈沙坦混懸液,20 mg/kg;滇黃精多糖低、中、高劑量組小鼠分別灌胃予生理鹽水配制的滇黃精多糖混懸液,劑量分別為120、240、480 mg/kg;空白對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水;1次/d,連續(xù)給藥90 d。

        1.6 觀察指標(biāo)

        1.6.1 空腹血糖及尿蛋白檢測 末次給藥1 d后,采集小鼠尾部末端血液,用血糖儀檢測小鼠FBG;通過代謝鼠籠的尿漏斗裝置收集各組小鼠尿液后,統(tǒng)計(jì)各組小鼠尿量,并采用全自動(dòng)血生化分析儀將收集到的尿液進(jìn)行24 h尿蛋白(UP)含量檢測。

        1.6.2 腎功能檢測 小鼠拔眼球取血法取血,每只小鼠取0.8~1 mL血液,3 500 r/min高速低溫離心機(jī)分離10 min,吸取上層血清存放于-80℃環(huán)境中備用。按試劑盒說明書操作測定血清中肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)含量。

        1.6.3 病理及超微組織觀察 切取小鼠右側(cè)少部分腎臟,置于10%福爾馬林溶液中滲透固定。制蠟塊,切片脫蠟,依次對標(biāo)本使用二甲苯、無水乙醇、酒精、蒸餾透化及洗滌,HE染色法對其進(jìn)行染色,觀察糖尿病腎病小鼠腎臟的病理學(xué)變化。另切取小鼠右側(cè)少部分腎臟,置于2.5%戊二醛溶液中滲透固定,制片,采用透射電鏡觀察腎臟組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

        1.6.4 炎癥因子及纖維化因子檢測 將剩余的右側(cè)腎臟組織與左側(cè)腎臟組織一起制備成勻漿液后,采用ELISA法,按說明書操作分別檢測腎臟組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量及纖維化因子TGF-β1、FN的含量。

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。多組間比較采用單因素方差分析,若方差齊性,進(jìn)一步采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較;若方差不齊,采用Kruska-Wallis H秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 各組小鼠24 h尿量、尿蛋白含量比較模型組小鼠24 h尿量及尿蛋白含量明顯高于空白對照組(P<0.01);纈沙坦組和滇黃精多糖高、中、低劑量組小鼠24 h尿量及尿蛋白含量明顯低于模型組(P<0.05或P<0.01);滇黃精多糖中、低劑量組小鼠24 h尿量及尿蛋白含量明顯高于纈沙坦組(P<0.05或P<0.01);滇黃精多糖高劑量組小鼠24 h尿量及尿蛋白含量高于纈沙坦組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(見表1)

        表1 各組小鼠24 h尿量、尿蛋白含量比較(±s)

        表1 各組小鼠24 h尿量、尿蛋白含量比較(±s)

        注:與空白對照組比較,aP<0.05,bP<0.01;與模型組比較,cP<0.05,dP<0.01;與纈沙坦組比較,eP<0.05,fP<0.01

        組別 動(dòng)物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)24 h尿量(mL)尿蛋白(mg/24 h)空白對照組 10 - 0.41±0.04 0.35±0.03模型組 10 - 2.07±0.18b 4.76±0.52b纈沙坦組 10 20 0.69±0.11d 1.17±0.12a d滇黃精多糖高劑量組10 480 0.71±0.09a d 1.21±0.16b d滇黃精多糖中劑量組10 240 1.05±0.23a d e 1.96±0.31b d e滇黃精多糖低劑量組10 120 1.74±0.17b c f 2.84±0.44b d f

        2.2 各組小鼠血清中Scr、BUN含量比較模型組小鼠血清中Scr、BUN含量明顯高于空白對照組(P<0.01);纈沙坦組和滇黃精多糖高、中、低劑量組小鼠血清中Scr、BUN含量明顯低于模型組(P<0.05或P<0.01);滇黃精多糖中、低劑量組小鼠血清中Scr、BUN含量明顯高于纈沙坦組(P<0.05或P<0.01);滇黃精多糖高劑量組小鼠血清中BUN含量低于纈沙坦組(P<0.05),但Scr含量與纈沙坦組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(見表2)

        表2 各組小鼠血清中Scr、BUN含量比較(±s,mg/dL)

        表2 各組小鼠血清中Scr、BUN含量比較(±s,mg/dL)

        注:與空白對照組比較,aP<0.05,bP<0.01;與模型組比較,cP<0.05,dP<0.01;與纈沙坦組比較,eP<0.05,fP<0.01

        組別 動(dòng)物數(shù)(只) 給藥劑量(mg/kg)Scr BUN空白對照組 10 - 0.21±0.05 13.18±1.12模型組 10 - 0.64±0.08b 34.52±2.18b纈沙坦組 10 20 0.32±0.04a 19.49±1.93a滇黃精多糖高劑量組 10 480 0.31±0.05d 16.54±1.85ade滇黃精多糖中劑量組 10 240 0.46±0.04ace 24.83±2.67bce滇黃精多糖低劑量組 10 120 0.52±0.07ace 28.55±2.51bcf

        2.3 各組小鼠空腹血糖比較給藥前,模型組、纈沙坦組和滇黃精多糖高、中、低劑量組小鼠空腹血糖明顯高于空白對照組(P<0.01)。給藥后,模型組、纈沙坦組小鼠空腹血糖值增加;滇黃精多糖高、中劑量組小鼠空腹血糖值下降(P<0.05)。與纈沙坦組比較,滇黃精多糖高劑量組小鼠血糖明顯下降(P<0.05)。(見表3)

        表3 各組小鼠空腹血糖比較(±s,mmol/L)

        表3 各組小鼠空腹血糖比較(±s,mmol/L)

        注:與空白對照組比較,aP<0.05,bP<0.01;與模型組比較,cP<0.05,dP<0.01;與纈沙坦組比較,eP<0.05,fP<0.01

        組別 動(dòng)物數(shù)(只) 給藥劑量(mg/kg) 給藥前 給藥后空白對照組 10 - 7.24±1.08 7.44±1.63模型組 10 - 16.28±2.73b 21.52±3.52b e纈沙坦組 10 20 16.47±2.34b 18.48±3.68b c滇黃精多糖高劑量組10 480 16.56±2.05b 12.79±3.83b d e滇黃精多糖中劑量組10 240 16.42±2.41b 15.72±2.49b c e滇黃精多糖低劑量組10 120 16.01±1.97b 17.35±2.15b c

        2.4 各組小鼠腎臟的病理學(xué)觀察HE染色結(jié)果顯示,空白對照組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整飽滿,細(xì)胞形態(tài)正常,組織中未有空泡出現(xiàn),腎臟的包曼氏囊腔飽滿;模型組小鼠腎小球空泡較多,細(xì)胞變形且有炎性細(xì)胞浸潤,包曼氏囊腔呈皺縮變??;纈沙坦組小鼠腎組織空泡數(shù)量少且空泡較少,輪廓較飽滿;滇黃精多糖各劑量組小鼠腎組織細(xì)胞變形有所緩解,腎小球結(jié)構(gòu)相對完整,少有空泡出現(xiàn),炎性細(xì)胞浸潤減少,包曼氏囊腔輪廓皺縮程度減少。(見圖1)

        圖1 各組小鼠腎臟的病理學(xué)觀察(HE,×400)

        2.5 各組小鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)的變化情況透射電鏡觀察結(jié)果顯示,空白對照組小鼠腎小球基底膜無融合、增生、增厚現(xiàn)象,足突清晰且數(shù)量較多;模型組小鼠腎小球中基底膜增厚且融合現(xiàn)象明顯,腎小球系膜增寬,足突數(shù)量較少;纈沙坦組小鼠基底膜融合現(xiàn)象少,足突數(shù)量較模型組多;滇黃精多糖各劑量組小鼠腎小球基底膜融合增厚得到緩解,足突數(shù)量有所增加。(見圖2)

        圖2 各組小鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)的變化(×15 000)

        2.6 各組小鼠腎臟中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量比較模型組小鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量明顯高于空白對照組(P<0.05);纈沙坦組和滇黃精多糖高、中、低劑量組小鼠腎組織TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均低于模型組(P<0.01);滇黃精多糖中、低劑量組小鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量明顯高于纈沙坦組(P<0.01),滇黃精多糖高劑量組小鼠TNF-α含量低于纈沙坦組(P<0.05),而IL-1β、IL-6含量低于纈沙坦組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(見表4)

        表4 各組小鼠腎臟中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較(±s,ng/L)

        表4 各組小鼠腎臟中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較(±s,ng/L)

        注:與空白對照組比較,aP<0.05,bP<0.01;與模型組比較,cP<0.05,dP<0.01;與纈沙坦組比較,eP<0.05,fP<0.01

        組別 動(dòng)物數(shù)(只) 給藥劑量(mg/kg) TNF-α IL-1β IL-6空白對照組 10 - 65.61±5.76 6.09±1.42 11.95±1.69模型組 10 - 127.22±6.29b 14.27±2.78b 51.08±3.75b纈沙坦組 10 20 80.74±6.47bd 8.29±1.51bd 20.84±1.22bd滇黃精多糖高劑量組10 480 76.23±5.42bde 8.14±1.84ad 19.75±1.49bd滇黃精多糖中劑量組10 240 92.75±7.38bdf 10.85±2.09bdf 31.82±2.51bdf滇黃精多糖低劑量組10 120 105.91±8.14bdf 12.76±2.63bcf 40.78±2.37bdf

        2.7 各組小鼠腎臟中纖維化因子TGF-β1、FN含量比較模型組小鼠腎組織中TGF-β1、FN的含量明顯高于空白對照組(P<0.01);纈沙坦組和滇黃精多糖高、中、低劑量組小鼠腎組織中TGF-β1、FN的含量均低于模型組(P<0.05或P<0.01);滇黃精多糖中、低劑量組小鼠腎組織TGF-β1、FN的含量明顯高于纈沙坦組(P<0.05或P<0.01),滇黃精多糖高劑量組小鼠腎組織中TGF-β1、FN含量低于纈沙坦組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(見表5)

        表5 各組小鼠腎臟中TGF-β1、FN的含量比較(±s,ng/mL)

        表5 各組小鼠腎臟中TGF-β1、FN的含量比較(±s,ng/mL)

        注:與空白對照組比較,aP<0.05,bP<0.01;與模型組比較,cP<0.05,dP<0.01;與纈沙坦組比較,eP<0.05,fP<0.01

        組別 動(dòng)物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)TGF-β1 FN空白對照組 10 - 1.27±0.09 3.98±0.64模型組 10 - 4.85±1.23b 6.17±0.57b纈沙坦組 10 20 2.74±0.65b d 4.38±0.85b d滇黃精多糖高劑量組 10 480 2.39±0.72a d 4.19±0.72b d滇黃精多糖中劑量組 10 240 3.24±0.79b d e 4.86±1.01b d e滇黃精多糖低劑量組 10 120 3.95±0.81a c f 5.47±0.94a c f

        3 討 論

        糖尿病腎病(DN)是因糖尿病血糖不穩(wěn)定,長期處于高血糖狀態(tài)下導(dǎo)致腎臟微血管受損的并發(fā)癥。由于高血糖對腎臟的損傷需要較長的時(shí)間,DN一般高發(fā)于糖尿病后期患者,且會(huì)發(fā)展為終末期腎臟疾病,這也是糖尿病致死、致殘的主要影響因素[5-7]。由于DN的發(fā)病漫長且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前對其治療的藥物較少,故研發(fā)新的治療DN的藥物具有重要意義。

        腎臟組織中巨噬細(xì)胞大量分泌炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6[8-9]。在DN的發(fā)病機(jī)制中,炎癥細(xì)胞的浸潤及巨噬細(xì)胞自分泌出的炎癥因子對腎臟的損傷起著關(guān)鍵的作用[10-11]。高血糖所引起的氧化應(yīng)激反應(yīng),將進(jìn)一步加重腎組織的炎癥反應(yīng)而加重腎臟的損傷,并啟動(dòng)腎組織中腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程,使纖維化因子TGF-β1、FN被活化,從而加速腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程[12-14]。

        前期的研究中已證實(shí)滇黃精多糖具有良好的降血糖藥理學(xué)效果[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示滇黃精多糖可降低糖尿病小鼠的血糖,同時(shí)能降低小鼠尿液中尿蛋白的含量及緩解小鼠多尿的情況。滇黃精多糖干預(yù)后,糖尿病腎病小鼠血清中Scr、BUN的含量下降,表明糖尿病腎病小鼠腎功能情況有所恢復(fù)。滇黃精多糖干預(yù)下,糖尿病小鼠腎臟組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和纖維化因子TGF-β1、FN的含量均有不同程度的降低。HE染色結(jié)果及透射電鏡觀察表明,糖尿病腎病小鼠在滇黃精多糖干預(yù)后,腎組織細(xì)胞變形有所緩解,腎小球結(jié)構(gòu)相對完整,少有空泡出現(xiàn),炎性細(xì)胞浸潤減少,包曼氏囊腔輪廓皺縮程度減少,基底膜融合增厚得到緩解,足突數(shù)量有所增加。提示滇黃精多糖能有效地調(diào)節(jié)糖尿病腎病小鼠血糖,同時(shí)提高腎組織功能,緩解腎臟的受損情況。其作用機(jī)制可能為降低腎臟組織中炎癥因子的含量,緩解腎臟組織中炎癥反應(yīng),同時(shí)降低纖維化因子的含量,阻止腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程的發(fā)生,從而達(dá)到緩解腎臟的受損情況,保護(hù)腎臟的作用。

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