鐘 源，趙夢姣，彭棟梁，陽佑華，謝 康，李佳聰，劉 芳

（1.古漢中藥有限公司，湖南 衡陽 421003；2.湖南省中藥液體制劑工程技術研究中心，湖南 衡陽 421003）

多糖是由至少10個醛糖或酮糖通過苷鍵結合在一起的高分子碳水化合物，在高等植物、藻類、菌類及動物體內均有存在，是自然界含量最豐富的生物聚合物之一。多糖具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、抗病毒等[1-5]藥理作用，在醫(yī)藥及保健品研發(fā)領域有較多的研究與應用，當前已有黃芪多糖、香菇多糖注射液、紫芝多糖片等眾多產品問世。

古漢養(yǎng)生多糖為古漢養(yǎng)生精醇沉工序中沉淀下來的混合粗多糖，其中包括黃精多糖、枸杞多糖、黃芪多糖、淫羊藿多糖、金櫻子多糖等，干燥粉碎后呈棕褐色粉末，溶于熱水、低濃度乙醇，在50%（V/V）以上的乙醇溶液中開始沉淀，在硫酸的作用下可水解，并迅速生成糖醛衍生物，加入苯酚即顯橙黃色化。大量的研究已證實，上述多糖具有免疫調節(jié)、抗腫瘤等[6-9]功效。目前，古漢養(yǎng)生精產量大，年產醇沉粗多糖100噸以上，利用價值可觀，將此部分粗多糖分離純化、制劑成新產品可為企業(yè)帶來巨大的經濟效益。

目前，利用大孔樹脂層析法去除粗多糖中的蛋白質、色素的研究較多，且效果較好。大孔樹脂層析技術具有吸附量大、易解析、選擇性好、重復利用等特點，在醫(yī)藥研究領域的應用越來越多，尤其在天然產物的提取、分離純化方面的應用尤為突出，并逐漸顯現出其優(yōu)越性。近年來，NAK-20、LSA-5B、D101、AB-8、HPD-100等樹脂廣泛應用于中藥多糖的研究，分離純化黃精多糖、枸杞多糖、甘草多糖的效果明顯，顯著優(yōu)于其他樹脂[10-12]。因此，本研究擬選用NAK-20、LSA-5B、D101、AB-8、HPD-100、X-5、H103共7種大孔樹脂層析法對古漢養(yǎng)生多糖進行吸附-解析實驗，優(yōu)化樹脂吸附-解析工藝參數，以期為進一步分離純化古漢養(yǎng)生多糖、開發(fā)高附加值產品提供前期基礎研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 古漢養(yǎng)生醇沉粗多糖取自古漢中藥有限公司口服液提取車間；D101、AB-8、HPD-100、LSA-5B樹脂（上海藍季科技發(fā)展有限公司）；X-5、H103、NAK-20樹脂（天津南開大學樹脂有限公司）；葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度≥99.8%，批號：110833-210908）；苯酚（湖南匯虹試劑有限公司，AR分析純，批號：20190711），硫酸（衡陽市凱信化工試劑股份有限公司，AR分析純，批號：20180605）；乙醇（湖南匯虹試劑有限公司，AR分析純，批號：20191008）；Lambda35型紫外分光光度計（美國PerkinELmer公司）。

1.2 方 法

1.2.1 樣品處理 車間取古漢養(yǎng)生醇沉粗多糖，回收酒精，60℃烘干至恒重，粉碎，密封保存待用。稱取粗多糖粉末100 g，加水2 L，煮沸30 min，過濾，離心（3000 r/min，40 min），取上清液，定容至10 L，即為粗多糖溶液。試驗中根據需要對粗多糖溶液進行稀釋。

1.2.2 多糖檢測[13]（苯酚—硫酸法）（1）標準曲線制作：精確稱取無水葡萄糖對照品3.03 mg，置100 mL容量瓶中，加水適量溶解，定容至刻度，搖勻。精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置具塞試管中，分別加水補至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置40℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應的試劑為空白，在490 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

（2）樣品多糖測定：精密量取試驗樣品溶液1.0 mL，置100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻。精密量取多糖稀釋樣品2.0 mL，置具塞試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置40℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應的試劑為空白，在490 nm波長處測定吸光度，計算多糖濃度。

1.2.3 樹脂預處理及再生 新購買的D101、AB-8、HPD-100、LSA-5B、X-5、H103、NAK-20樹脂用水洗去除懸浮物及水溶性雜質后，乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，再以乙醇濕法裝入玻璃層析柱，蒸餾水洗至流出液與水混合不渾濁，2% NaOH溶液浸泡4 h，蒸餾水洗至流出液呈中性，再用2%HCl溶液浸泡4 h，蒸餾水洗至流出液中性。

1.2.4 樹脂靜態(tài)吸附-解析試驗 稱取經預處理的7種樹脂各10.0 g于100 mL的錐形瓶中，分別加入30 mL的粗多糖溶液，25℃恒溫振搖24 h，振搖頻率120 r/min。振搖結束之后，濾紙過濾粗多糖溶液，定容至50 mL，再稀釋100倍，按“1.2.2”方法檢測多糖濃度，計算各樹脂多糖吸附率。

分離出來的樹脂置于100 mL的錐形瓶中，加入30%（V/V）乙醇100 mL，25℃恒溫振搖24 h，振搖頻率120 r/min。振搖結束之后，濾紙過濾解析液，定容至50 mL，再稀釋100倍，按“1.2.2”方法檢測多糖濃度，計算各樹脂多糖解析率。

吸附率（%）=[C1×V1/（C×V）×100%，解析率（%）]=[C2×V2/（CV-C1V1）]×100%。

式中，C、C1、C2分別為上樣液（粗多糖溶液）多糖濃度，吸附之后的溶液多糖濃度，解析液多糖濃度；V、V1、V2分別為上樣液體積，吸附之后的溶液定容體積，解析液定容體積。

1.2.5 樹脂動態(tài)吸附-解析試驗

1.2.5.1 上樣濃度對樹脂吸附效果的影響 量取經預處理的NAK-20樹脂50 mL 4份，濕法裝入4根玻璃層析柱內，分別以0.46、0.91、1.81、3.62 mg/mL的粗多糖溶液上樣，上樣流速3 BV/h（1 BV=50 mL），上樣體積4 BV。按“1.2.2”方法檢測流出液多糖濃度，計算樹脂吸附量，確定最佳上樣濃度。

1.2.5.2 上樣體積對樹脂吸附效果的影響 量取經預處理的NAK-20樹脂50 mL，濕法裝入玻璃層析柱內，以1.81 mg/mL的粗多糖溶液上樣，上樣流速3 BV/h，上樣體積4 BV，依次收集流出液，每個樣品50 mL。按“1.2.2”方法檢測流出液樣品的多糖濃度，確定最佳上樣體積。

1.2.5.3 上樣流速對樹脂吸附效果的影響 量取經預處理的NAK-20樹脂50 mL 3份，濕法裝入3根玻璃層析柱內，以1.81 mg/mL的粗多糖溶液上樣，上樣體積2 BV，上樣流速分別為1、2、3、4 BV/h，分別收集流出液。按“1.2.2”方法檢測吸附流出液的多糖濃度，計算樹脂吸附率，確定最佳上樣流速。

1.2.5.4 解析溶液濃度對解析效果的影響 按實驗“1.2.5.1”“1.2.5.2”“1.2.5.3”確定的NAK-20樹脂吸附條件進行上樣，進行4組試驗，每組分別用4 BV的10%、20%、30%、40%（V/V）乙醇進行解析，解析流速2 BV/h，分別收集不同濃度乙醇解析下的解析液。按“1.2.2”方法檢測吸附流出液和解析液的多糖濃度，計算多糖解析率，確定最佳解析液濃度。

1.2.5.5 解析溶液用量對解析效果的影響 按實驗“1.2.5.1”“1.2.5.2”“1.2.5.3”確定的樹脂吸附條件進行上樣，再以10%（V/V）乙醇為解析液進行解析實驗，解析體積4 BV，解析流速2 BV/h，每50 mL解析液收集為一個樣品。按“1.2.2”方法檢測吸附流出液和解析液樣品的多糖濃度，計算多糖解析率，確定最佳解析液體積。

1.2.5.6 解析流速對解析效果的影響 按實驗“1.2.5.1”“1.2.5.2”“1.2.5.3”確定的樹脂吸附條件進行4根玻璃層析柱上樣，再以10%（V/V）乙醇為解析溶液進行解析實驗，解析流速分別為1、2、3、4 BV/h，解析體積均為2 BV。按“1.2.2”方法檢測吸附流出液和各解析液的多糖濃度，計算多糖解析率，確定最佳解析流速。

1.2.5.7 驗證實驗 按實驗“1.2.5.1”“1.2.5.6”確定的參數進行3次驗證實驗，檢測吸附流出液和解析液的多糖濃度，計算NAK-20樹脂對古漢養(yǎng)生精多糖的吸附率和解析率。

2 結果與分析

2.1 多糖標準曲線 見圖1。

圖1 多糖標準曲線

2.2 靜態(tài)吸附-解析試驗結果 見表1。

表1 7種大孔吸附樹脂對古漢養(yǎng)生多糖靜態(tài)吸附-解析的效果

由表1的數據可知，7種樹脂中H103H和NAK-20對古漢養(yǎng)生多糖的靜態(tài)吸附效果較好，吸附率分別為62.50%、66.76%，其中NAK-20的解析效果更好，解析率達到78.56%。因此，動態(tài)吸附-解析試驗選用NAK-20樹脂，優(yōu)化NAK-20樹脂吸附-解析古漢養(yǎng)生多糖工藝參數。

2.3 動態(tài)吸附-解析試驗結果

2.3.1 上樣濃度對樹脂多糖吸附效果的影響 見圖2。

圖2 上樣濃度對樹脂吸附效果的影響

從圖2可知，NAK-20樹脂對古漢養(yǎng)生多糖的吸附量隨著上樣濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢。上樣濃度為1.81 mg/mL，吸附量達到8.35 mg/mL；當上樣濃度再增加時，吸附量反而下降。因此，最佳上樣濃度為1.81 mg/mL。

2.3.2 上樣體積對樹脂多糖吸附效果的影響 見圖3。

圖3 NAK-20樹脂上樣飽和曲線

圖3所示，NAK-20樹脂以1.81 mg/mL的粗多糖溶液上樣，隨著上樣體積的增加，流出液收集樣品多糖濃度明顯升高；當上樣第3 BV時，收集樣品多糖濃度已到達1.37 mg/mL，說明此時NAK-20樹脂已達到吸附飽和。因此，NAK-20樹脂吸附古漢養(yǎng)生多糖的最佳上樣體積為2 BV。

2.3.3 上樣流速對樹脂多糖吸附效果的影響 見圖4。

圖4 上樣流速對NAK-20樹脂吸附效果的影響

樹脂吸附上樣流速過快，目標組分可能來不及吸附就流出；流速過慢，雜質競爭性吸附可能較強，同時吸附效率不高，不利于工業(yè)化大生產。圖4所示，隨著上樣流速的增大，NAK-20樹脂吸附率先增大后降低，流速為3 BV/h時，吸附效果最佳，達到79.05%。因此，NAK-20樹脂吸附古漢養(yǎng)生多糖的最佳上樣流速為2.5 BV/h。

2.3.4 解析液濃度對多糖解析效果的影響 見圖5。

圖5 解析溶液乙醇濃度對多糖解析效果的影響

多糖一般在30%以下的乙醇或熱水中溶解較好，柱層析中常用30%及以下的乙醇作為解析劑，能取得很好的解析效果[14-15]。動態(tài)試驗對比研究了10%、20%、30%、40%乙醇的解析效果，如圖5所示，隨著乙醇濃度的增大，多糖解析率逐漸降低，4 BV 10%乙醇解析多糖解析率能達到81.38%，證明以10%乙醇為解析溶液解析效果較好。

2.3.5 解析溶液用量對多糖解析效果的影響 見圖6。

圖6 解析溶液用量對多糖解析效果的影響

圖6所示，隨著解析溶液用量的增加，古漢養(yǎng)生多糖解析率增大。當解析溶液用量為2 BV時，解析率達到79.03%，再增加解析溶液用量解析率變化不明顯，考慮到經濟效益，故選擇解析溶液用量為2 BV。

2.3.6 解析流速對多糖解析效果的影響 見圖7。

解析流速（BV/h）圖7 解析流速對古漢養(yǎng)生多糖解析效果的影響

解析流速太慢，樹脂對多糖的競爭性吸附作用較大，不利于多糖解析下來；流速過快，多糖還來不及被解析下來，解析溶液已流出。從圖7的趨勢可以看出，隨著解析流速的增大，古漢養(yǎng)生多糖解析率呈現先升高后降低的趨勢，當解析流速為2 BV/h，解析率達到85.38%，解析效果最好。

2.4 驗證實驗結果 按照實驗“2.3”確定的NAK-20樹脂吸附-解析工藝參數進行3次重復實驗，NAK-20樹脂對古漢養(yǎng)生多糖的吸附率分別為68.94%、67.77%、70.01%，解析率分別為86.23%、82.36%、85.88%，平均吸附率和解析率分別為68.91%、84.82%。實驗證明，NAK-20樹脂對古漢養(yǎng)生多糖的吸附-解析效果較好，工藝參數穩(wěn)定。

3 小 結

古漢養(yǎng)生多糖為復合純中藥多糖類物質，其中含有淫羊藿多糖、黃精多糖、枸杞多糖等。多糖結構復雜。目前多糖定量分析方法主要有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，筆者采用苯酚-硫酸法對多糖含量進行檢測，利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，該化合物在490 nm波長處有特征吸收。

大孔吸附樹脂是一類不含交換基團且有大孔結構的高分子吸附樹脂，具有良好的大孔網狀結構和較大的比表面積，可以有選擇地通過物理吸附水溶液中的有機物。實驗選用了NAK-20等7種大孔吸附樹脂對醇沉粗多糖進行研究吸附-解析研究，在靜態(tài)吸附試驗篩選樹脂的基礎上，對NAK-20樹脂的動態(tài)吸附-解析試驗進行了工藝參數優(yōu)化，得到的最佳工藝參數為：上樣液多糖濃度1.81 mg/mL，上樣體積2 BV，上樣流速3 BV/h；解析溶液為10%乙醇，解析溶液用量2 BV，解析流速2 BV/h。吸附率和解析率分別達到68.91%、84.82%，效果較好。

實驗未對古漢養(yǎng)生精多糖中蛋白質、色素等雜質的脫除情況進行考察，多糖純度未進行深入分析，這是本研究存在的不足之處，也是后期研究的方向。利用現代分離純化技術提高古漢養(yǎng)生多糖的純度，并以此開發(fā)保健食品、藥品等，能達到變廢為寶、提升企業(yè)經濟效益的目的。