潘曉君，呂渭升，楊文惠，梁 慧，潘 婷，陳 芳，鄧淙友，霍文杰，李振雨

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244）

酒萸肉是中藥材山茱萸除去雜質和殘留果核，經酒燉或酒蒸炮制而成的飲片[1]。山茱萸除去雜質和殘留果核為山萸肉，山萸肉長于斂汗固脫，用于自汗或大汗不止，陰虛盜汗[2]。山萸肉酒制后，補益肝腎作用增強，多入滋補方劑，常用于眩暈耳鳴、陽痿遺精、遺尿、尿頻、月經過多或崩漏、腰部酸痛等[3]。2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定了酒萸肉的炮制方式為“取凈山萸肉，照酒燉法或酒蒸法燉或蒸至酒吸盡”，炮制后的酒萸肉形如山茱萸，但表面紫黑色或黑色，質滋潤柔軟，微有酒香氣。由于各版《中華人民共和國藥典》對酒萸肉的酒燉或酒蒸工藝參數均沒有明確規(guī)定，市面上所售酒萸肉飲片多按自擬的工藝炮制。有多篇文獻對酒萸肉的炮制方式進行過考察，但得出的最佳炮制工藝和參數不盡相同[4-8]，市售的酒萸肉飲片顏色上差異較大，內在的質量更是無法保證，僅依靠《中華人民共和國藥典》的質量控制方法，評價酒萸肉飲片的質量仍顯不足。筆者采用UPLC指紋圖譜并結合多成分定量，以及化學計量學方法，對從市面上采購的酒萸肉飲片的質量差異進行分析，旨在為酒萸肉飲片質量的評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器 超高效液相色譜儀（H-class PDA檢測器，沃特世公司）；Waters CORTECS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；ME204E萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）；XP26百萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）；JJ600百分之一天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；KQ500D型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS28型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；Milli-Q級超純水系統(tǒng)（德國默克股份有限公司）。

1.2 試藥14批酒萸肉飲片經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定均為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的酒制品，飲片信息見表1。沒食子酸對照品（批號：110831-201906，含量：91.5%）、5-羥甲基糠醛對照品（批號：111626-201912，含量：99.2%）、莫諾苷對照品（批號：111998-201602，含量：96.3%）、馬錢苷對照品（批號：111640-201808，含量：99.0%）、山茱萸對照藥材（批號：121495-202004）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，默克股份有限公司）；磷酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；甲醇（分析純，西隴科學股份有限公司）；水為超純水。

表1 14批市售酒萸肉來源信息表

2 方法與結果

2.1 酒萸肉飲片指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件Waters CORTECS T3（2.1 mm×150 mm，1.6 μm）色譜柱；以乙腈為流動相A，0.2%磷酸為流動相B，梯度洗脫（0～3 min，2%～8%A；3～9 min，8%～15%A；9～13 min，15%～25%A；13～16 min，25%～100%A；16～19 min，100%A）；流速：0.2 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：35℃；進樣量：1 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含沒食子酸15 μg、5-羥甲基糠醛50 μg、莫諾苷80 μg和馬錢苷100 μg的溶液。

另取山茱萸對照藥材約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，稱定質量，超聲提取30 min，放冷，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，離心，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取酒萸肉飲片粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，稱定質量，超聲提取30 min，放冷，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，離心，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 精密度試驗 取酒萸肉供試品（編號：S2）溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以馬錢苷色譜峰為參照峰S，計算各共有指紋峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值均小于2.0%，說明該儀器精密度良好。

2.1.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批酒萸肉飲片（編號：S2）粉末，按“2.1.3”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別在0、4、8、16、20、24 h進樣分析，以馬錢苷色譜峰為參照峰S，計算各共有指紋峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值均小于2.0%，說明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.4.3 重復性試驗 取“穩(wěn)定性試驗”項下供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，以馬錢苷色譜峰為參照峰S，計算各共有指紋峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值均小于3.0%，說明該方法重復性良好。

2.1.5 指紋圖譜的建立及共有峰的確定 取14批酒萸肉飲片樣品，按“2.1.3”項下方法制備14份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，得到14批酒萸肉飲片樣品指紋圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件，以編號S1樣品指紋圖譜為參照，進行保留時間校正和全峰匹配，共標定出9個共有指紋峰。14批酒萸肉飲片指紋圖譜疊加圖見圖1，以平均數法生成酒萸肉飲片對照指紋圖譜，見圖2。馬錢苷是酒萸肉的主要有效成分之一，色譜峰居中，分離度較好，且該成分色譜峰面積較大，因此選擇馬錢苷（峰6）色譜峰為參照峰S，計算各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD值；各共有指紋峰的相對保留時間RSD值在0.32%～2.82%范圍內，相對峰面積RSD值在30.04%～115.69%范圍內。以山茱萸對照藥材為參照（見圖3），酒萸肉飲片樣品指紋圖譜的9個共有指紋峰與對照藥材色譜中相應的色譜峰均能夠一一對應，說明14批酒萸肉飲片與對照藥材基原的一致性，9個共有指紋峰能很好地表征酒萸肉飲片的特征。

圖1 14批酒萸肉飲片UPLC指紋圖譜

圖2 14批酒萸肉飲片對照指紋圖譜

圖3 山茱萸對照藥材指紋圖譜

2.1.6 相似度評價 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”采用自主編程，采用夾角余弦算法，將指紋圖譜導入數據庫管理，對圖譜進行處理，能定量地表征各樣品間相似程度。相似度范圍從0到1，數值越大表明樣品間相似程度越高[9-10]。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”計算14批酒萸肉飲片指紋圖譜的相似度，結果見表2。結果顯示，14批酒萸肉飲片樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度在0.380～0.992范圍內，說明不同廠家的酒萸肉飲片質量存在較大差異，其中編號為S1、S6、S7和S13的樣品指紋圖譜與其他批次相比，相似度值明顯較低，說明以上4批酒萸肉飲片的化學成分與其他批次存在較大差異，以上4批飲片分別來自廠家1、廠家4和廠家3。此外，同一家公司生產的酒萸肉飲片在指紋圖譜相似度上也存在較大的差異，如編號S3、S5和S13的樣品，可能是因為同一廠家所采購的藥材原料質量不一，也可能是由于同一廠家的炮制工藝不穩(wěn)定，雖然都來自廠家3，但S3與S5的相似度為0.818，S5和S13的相似度為0.209，S3和S13的相似度為0.570，3批樣品的指紋圖譜相似度均有較大差異。編號S4、S7和S14的樣品，雖然都來自廠家4，但S4與S7的相似度只有0.345，S4與S14的相似度為0.937，S7與S14的相似度只有0.178，說明S7與S4、S14差異較大。

表2 14批酒萸肉飲片指紋圖譜相似度評價表

2.1.7 共有峰的指認 查閱相關文獻，通過與對照品保留時間進行比對，結并合紫外吸收光譜圖，確定峰1為沒食子酸、峰2為5-羥甲基糠醛、峰5為莫諾苷、峰6為馬錢苷。（見圖4）

圖4 指紋圖譜共有峰的指認

2.1.8 聚類分析（CA）采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件以9個共有指紋峰的峰面積積分為變量，采用組間平均數聯(lián)接法對14批樣品進行系統(tǒng)聚類分析，結果見圖5。14批酒萸肉飲片樣品按相似度分成3類，其中S11、S12、S8、S9、S10和S14為Ⅰ類，S2、S3、S4和S5為Ⅱ類，S1、S6、S13和S7為Ⅲ類，聚類分析的結果表明批次間有較大差異，與指紋圖譜相似度計算結果類似。

圖5 14批酒萸肉飲片聚類樹狀圖

2.1.9 主成分分析（PCA） 采用SPSS 25.0軟件以9個共有指紋峰的峰面積為變量進行主成分分析，以特征根>1為判定標準，共提取4個成分，累積貢獻率達到91.8%，結果見表3，成分載荷矩陣的數值及符號代表變量在主成分當中的載荷，載荷越大，表明該化合物在藥材主成分分析中作用越大[11]，結果見表4，其中峰4、沒食子酸、峰3對主成分1的貢獻最大，峰8、峰9和馬錢苷對主成分2的貢獻最大，5-羥甲基糠醛、莫諾苷和峰7對主成分3的貢獻最大，莫諾苷對主成分4的貢獻最大。前3個成分累積貢獻率約80%，表明3個主成分能夠反映酒萸肉飲片指紋圖譜大部分信息，以前3個主成分繪制主成分3D得分圖，見圖6。其中S1、S7、S11和S12離群較遠，因為S1和S7的主成分3得分值明顯高于其他批次，S11和S12主成分2得分值為負數且明顯低于其他批次。結合峰面積可知，S1樣品峰7的峰面積，以及S7樣品馬錢苷的峰面積明顯高于其他批次，而S11和S12樣品峰8、峰9的峰面積明顯小于其他批次。

表3 特征根

表4 主成分載荷矩陣

圖6 主成分得分圖

2.2 含量測定

2.2.1 方法學考察

2.2.1.1 線性關系考察 精密稱定沒食子酸3.145 mg、5-羥甲基糠醛13.855 mg、莫諾苷對照品24.150 mg、馬錢苷對照品15.552 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得每1 mL含沒食子酸57.554 μg、5-羥甲基糠醛274.883 μg、莫諾苷465.129 μg、馬錢苷307.930 μg混合對照品貯備液。精密吸取混合對照貯備液0.5 mL至100 mL量瓶中，再分別精密吸取混合對照貯備液0.5、2.0、3.0、5.0 mL至10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜方法依次進樣1 μL，記錄色譜峰面積。以對照品濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線，4種成分的線性回歸方程和線性范圍見表5。

表5 4種成分的線性回歸方程及線性范圍

2.2.1.2 精密度試驗 取酒萸肉飲片（編號：S2）供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件重復進樣6次，計算沒食子酸峰面積RSD值為2.81%；5-羥甲基糠醛峰面積RSD值為1.51%；莫諾苷峰面積RSD值為0.72%；馬錢苷峰面積RSD值為0.71%，表明該儀器精密度良好。

2.2.1.3 穩(wěn)定性試驗 取酒萸肉飲片（編號：S2）供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、16、24、30 h，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算得到沒食子酸峰面積的RSD值為2.55%；5-羥甲基糠醛峰面積RSD值為2.45%；莫諾苷峰面積RSD值為1.31%；馬錢苷峰面積RSD值為1.27%，表明供試品溶液在30 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.1.4 重復性試驗 取同一批酒萸肉飲片粉末（編號：S2），按“2.1.3”項下方法制備6份酒萸肉供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算沒食子酸含量均值為0.180%，RSD值為0.54%；5-羥甲基糠醛含量均值為0.512%，RSD值為1.20%；莫諾苷含量均值為0.879%，RSD值為1.61%；馬錢苷含量均值為0.650%，RSD值為0.49%，RSD值均小于3.00%，表明該方法重復性良好。

2.2.1.5 加樣回收率試驗 精密稱取同一批酒萸肉飲片（編號：S2）供試品0.1 g，精密稱定，平行樣9份，按照樣品中4種成分與對照品的含量比分別為1∶0.5、1∶1、1∶1.5加入沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷、馬錢苷對照品，每個比例平行3份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行含量測定，計算得到沒食子酸平均加樣回收率為101.16%，RSD為2.15%；5-羥甲基糠醛平均加樣回收率為93.23%，RSD為1.08%；莫諾苷平均加樣回收率為95.34%，RSD為1.46%；馬錢苷平均加樣回收率為102.68%，RSD為1.98%，表明該分析方法準確度良好，結果見表6。

表6 加樣回收率試驗結果

2.2.2 樣品測定 取酒萸肉飲片粉末，按“2.1.3”項下供試品溶液制備方法制備酒萸肉供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算各批次酒萸肉飲片沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷及馬錢苷的含量，結果見表7。2020年版《中華人民共和國藥典》酒萸肉項下規(guī)定，酒萸肉含莫諾苷（C17H26O11）和馬錢苷（C17H26O10）的總量不得少于0.70%，14批酒萸肉飲片莫諾苷和馬錢苷總量在1.09%～3.29%范圍內，說明14批酒萸肉飲片均符合2020年版《中華人民共和國藥典》的要求，其中編號S7和S13的樣品，莫諾苷和馬錢苷的總量分別是《中華人民共和國藥典》的3倍和4.7倍，其余12批莫諾苷和馬錢苷的總量差異不大。14批酒萸肉飲片，除編號為S8和S13的樣品外，其余12批酒萸肉飲片沒食子酸的含量差異并不大，但是5-羥甲基糠醛的含量，不同廠家生產的飲片卻差異明顯，最大值是最小值的130倍，且同一廠家生產的不同批次飲片5-羥甲基糠醛的含量也差異明顯，如廠家1生產的編號為S1、S11和S12的飲片，5-羥甲基糠醛的含量分別為0.03%、0.93%和0.93%，含量相差31倍，廠家3生產的編號為S3、S5和S13的酒萸肉飲片，5-羥甲基糠醛的含量分別為0.24%、0.42%和0.01%，含量相差42倍。廠家4生產的編號為S4、S7和S14的飲片5-羥甲基糠醛的含量分別為0.56%、0.01%和1.30%，含量更是相差130倍。酒萸肉飲片5-羥甲基糖醛的含量差別大可能是因為所采購的藥材原料質量不一，同時，酒萸肉的炮制中，需要對山萸肉藥材進行一定時間的酒蒸，而5-羥甲基糠醛化學性質受長時間的加熱影響，導致其含量的變化。因此，炮制工藝不穩(wěn)定也會導致酒萸肉中5-羥甲基糖醛的含量差別。

表7 14批酒萸肉樣品含量測定結果

3 討 論

3.1 色譜條件選擇 本研究采用UPLC構建酒萸肉飲片的指紋圖譜，并對多種成分含量同時測定。與傳統(tǒng)的HPLC比較，UPLC分辨率高、分析能力強、分析時間短，同時減少了溶劑用量降低了分析成本[12]。分別進行了色譜柱、流動相系統(tǒng)、檢測波長考察，結果顯示采用Waters CORTECS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.6 μm)，檢測波長為260 nm，乙腈-0.2%磷酸溶液梯度洗脫時，整體基線平穩(wěn)、各色譜峰分離效果良好且方法耐用性良好。

張振凌等[13]建立與比較了對不同方法制酒萸肉飲片高效液相指紋圖譜，分析時間需要70 min，70 min后無特征峰出現(xiàn)。而筆者采用UPLC構建酒萸肉飲片的指紋圖譜，分析時間需要24 min，24 min后無特征峰出現(xiàn)，這展現(xiàn)了UPLC分析能力強、分析時間短，同時減少了溶劑用量降低了分析成本的優(yōu)勢。這也是本文采用UPLC構建酒萸肉飲片的指紋圖譜的優(yōu)勢。

3.2 供試品溶液制備方法考察 以沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷和馬錢苷的含量，以及各色譜峰“峰面積/稱樣量”為評價指標，考察不同濃度甲醇、乙醇的提取效果，結果發(fā)現(xiàn)50%甲醇作為提取溶劑時，峰面積響應值高，基線平穩(wěn)，提取效率最高，且色譜峰信息豐富；另外，以50%甲醇為提取溶劑，考察了超聲、加熱回流對提取效率的影響，結果顯示加熱回流與超聲處理提取效率無明顯差別，因此選擇操作更為簡便的超聲處理提取。同時，對樣品提取時間進行考察，結果表明，超聲提取30 min已能夠完全提取。通過上述考察，最終確定最佳供試品溶液制備方法為：50%甲醇超聲提取30 min，提取效率最佳。

3.3 指紋圖譜、聚類分析和主成分分析14批酒萸肉飲片共確定9個共有指紋峰，與山茱萸對照藥材中的9個指紋峰相對應，表明炮制過程并沒有使指紋峰的數目明顯增加或消失，指紋圖譜的相似度評價結果顯示14批飲片的質量存在較大的差異，反映了目前市售酒萸肉飲片質量的參差不齊。聚類分析將酒萸肉飲片分為3類，不同企業(yè)生產的飲片差異較大。

3.4 含量測定分析 沒食子酸、5-羥甲基糠醛、莫諾苷和馬錢苷均為山萸肉或酒萸肉的有效成分[14]，研究結果顯示，除個別批次樣品中沒食子酸含量及莫諾苷和馬錢苷總量與其他批次差異較大外，其余樣品均差別不大，但5-羥甲基糠醛的含量差異比較明顯。5-羥甲基糠醛是由葡萄糖脫水產生的一種具有呋喃環(huán)結構的糠醛化合物，在許多中藥加熱炮制過程中均能產生或者含量增加，研究證實，5-羥甲基糠醛具有抗氧化、抗炎、改善學習記憶力和保護神經細胞等多種藥理活性[15]，但劑量過大也顯示出急性毒性和腎毒性[16]。目前少量的5-羥甲基糠醛更多被當成食品添加劑使用，對人類健康的影響仍沒有明確的定論，但是《中華人民共和國藥典》從1985年版開始，對葡萄糖注射液中增加了5-羥甲基糠醛的限量檢查，以防止臨床上的過敏反應。5-羥甲基糠醛的含量高低與炮制過程中的加熱溫度、加熱時間等因素密切相關，反映了酒萸肉炮制工藝的差異及炮制工藝是否穩(wěn)定。從14批酒萸肉飲片5-羥甲基糠醛含量測定結果可以看出，不同廠家酒萸肉飲片的炮制工藝存在較大差異，且同一廠家其炮制工藝的穩(wěn)定性也值得商榷。目前對于酒萸肉飲片炮制工藝的研究文獻報道較多，但對最佳的工藝或者炮制的終點仍沒有統(tǒng)一的定論，需要結合生物活性評價進行進一步的研究。

本研究采用UPLC指紋圖譜結合多成分同時定量有效地分析了市售酒萸肉飲片的質量差異性，可為市售酒萸肉飲片的質量評價提供有益的參考。