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        通痹顆粒對膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)及MMP-3、TIMP-1表達的影響*

        2021-11-23 06:05:00柳玉佳歐慧萍吳伊瑩王莘智范伏元
        中醫(yī)藥導報 2021年10期
        關(guān)鍵詞:劑量模型

        柳玉佳,歐慧萍,吳伊瑩,王莘智,范伏元

        (1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007;2.湖南中醫(yī)藥高等??茖W校,湖南 株洲 412012)

        類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以對稱性、慢性破壞性關(guān)節(jié)炎為主要臨床特征的自身免疫疾病[1]。其主要病理生理學特征為滑膜的慢性炎癥,并可出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的破壞[2]。如果不積極治療,可能會導致關(guān)節(jié)損傷和不可逆轉(zhuǎn)的殘疾。隨著對RA發(fā)病機制的深入研究及早期診斷、早期治療重要性認識的加強,其治療策略也發(fā)生了重大改變[3]。

        RA骨免疫穩(wěn)態(tài)依賴于破骨細胞和成骨細胞之間的平衡。在RA滑膜微環(huán)境中,各種促炎因子的分泌與釋放,促進了破骨細胞的分化能力,并經(jīng)由骨免疫微環(huán)境募集破骨前體轉(zhuǎn)化為成熟的破骨細胞,參與骨破壞進程[4]。核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κB Ligand,RANKL)/核因子κB受體(receptor activator of nuclear factor κB,RANK)/骨保護素(osteoprotegerin,OPG)系統(tǒng)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)作為骨穩(wěn)態(tài)維持的重要信號,與RA的進程密切相關(guān)。前期研究[5-7]發(fā)現(xiàn),通痹顆粒能夠發(fā)揮多靶點調(diào)控作用,可有效緩解RA關(guān)節(jié)炎癥及骨質(zhì)破壞,然其具體機制尚未完全明確。本實驗通過研究通痹顆粒對膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)及MMP-3、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinase,TIMP)-1表達的影響,進而揭示通痹顆粒對RA骨破壞的干預(yù)作用及分子機制,以更好地指導臨床。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物SPF級健康雌性SD大鼠60只,體質(zhì)量200~250 g,由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2019-0004。大鼠飼養(yǎng)于通風良好的環(huán)境,室溫恒定在20~25℃,相對濕度40%~60%,標準光照。本實驗已通過湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查,批準號:20201010-35,并嚴格按照倫理要求進行研究。

        1.2 藥物與試劑 通痹顆粒,方藥組成:當歸,黃芪,白芥子,血竭,僵蠶,甘草等,由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑科提供,并由煎藥室制備濃縮為含生藥1 g/mL。雷公藤多苷片(湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司,國藥準字Z43020138,規(guī)格:10mg/片);牛Ⅱ型膠原(德國Biofroxx公司,批號:2275);完全弗氏佐劑(美國Sigma公司,批號:SA-F5881);兔抗鼠RANKL試劑盒(美國proteintech公司,貨號:23408-1-AP);兔抗鼠RANK試劑盒(美國proteintech公司,貨號:111860);兔抗鼠OPG試劑盒(美國proteintech公司,貨號:ab73400);蛋白分子量標準Marker(美國Sigma公司,貨號:V900372);RIPA裂解液(武漢菁禾生物科技有限公司,貨號:P0013B);BCA蛋白定量試劑盒(武漢菁禾生物科技有限公司,貨號:P1260);RNA提取試劑盒(美國Thermo公司,貨號:15596026);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京康為世紀公司,貨號:CW2569);MMP-3 ELISA試劑盒(武漢菁禾生物科技有限公司,貨號:10374-1-AP);TIMP-1 ELISA試劑盒(武漢菁禾生物科技有限公司,貨號:12899-1-AP)。

        1.3 主要儀器PIKOREAL96型熒光定量RCP儀(美國Thermo公司);1658033型電泳儀(美國Biorad公司);DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀(北京六一生物科技有限公司);BioPrep-24型生物樣品均質(zhì)儀(杭州奧盛儀器有限公司)。

        1.4 造模與分組 將60只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組,每組12只。除空白組外,其余4組大鼠行CIA造模,具體如下:牛Ⅱ型膠原蛋白冰浴后溶解在冰醋酸中,并用完全弗氏佐劑乳化,制備成牛Ⅱ型膠原。取制備好的牛Ⅱ型膠原0.2 mg于大鼠尾根部多點皮下注射進行初始免疫,2周后同前法以0.1 mg進行增強免疫,4周后進行CIA模型評判。保證注射免疫后大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分≥6分,則為造模成功。

        1.5 實驗給藥 造模成功后,藥物均按照人-大鼠體表面積換算為等效劑量,通痹顆粒低劑量組為換算后等效人臨床劑量,通痹顆粒高劑量組為等效人臨床劑量的2倍。換算后雷公藤多苷組大鼠灌胃雷公藤多苷溶液,給藥劑量為0.024 g/(kg·d);通痹顆粒低、高劑量組大鼠灌胃給予通痹顆粒溶液,給藥劑量分別為9.600、19.200 g/(kg·d);空白組、模型組大鼠予等體積生理鹽水灌胃,1次/d,連續(xù)2周。

        1.6 觀察指標 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和關(guān)節(jié)腫脹度測量分別于治療第0、7、14天進行。治療第14天后所有大鼠脫頸處死,腹主動脈采血,3 000 r/min離心20 min,取上層血清-80℃條件封存,用于血清MMP-3、TIMP-1水平檢測;左膝關(guān)節(jié)滑膜組織剝離,福爾馬林液固定,用于滑膜組織病理形態(tài)學觀察;右膝關(guān)節(jié)滑膜組織剝離,放入液氮中速凍,-80℃條件下封存,用于滑膜RANKL、RANK、OPG的mRNA和蛋白檢測。

        1.6.1 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分 根據(jù)大鼠關(guān)節(jié)受累情況進行評分,具體如下:關(guān)節(jié)無任何紅腫為0分,紅腫僅累及足趾關(guān)節(jié)為1分,紅腫累及足底及足趾為2分,紅腫累及踝關(guān)節(jié)以下為3分,紅腫蔓延至全部足踝關(guān)節(jié)為4分。4個關(guān)節(jié)的評分累加即為大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù),最大值為16分。

        1.6.2 關(guān)節(jié)腫脹度測量 各組大鼠雙后踝關(guān)節(jié)同一位置做浸水線標記,采用足跖腫脹度測量儀測量大鼠的足跖容積,以其變化情況來估測關(guān)節(jié)腫脹度。

        1.6.3 滑膜組織病理學觀察 取固定好的大鼠左膝滑膜組織,EDTA溶液脫鈣,梯度酒精脫水,石蠟包埋,切片厚度約5 μm,并行組織HE染色,中性樹脂封片,光學顯微鏡下(×200)觀察其組織病理學形態(tài)。

        1.6.4 滑膜組織RANKL mRNA、RANK mRNA、OPG mRNA表達檢測 取右膝滑膜組織,使用Trizol法提取總RNA,行RNA濃度及純度測定,并以組織總的mRNA為模板用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取互補的cDNA,后使用RT-PCR技術(shù)進行基因擴增和檢測。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 min,95℃15 s→60℃30 s,擴增40個循環(huán)。收集熒光得到的曲線圖,以β-actin為內(nèi)參,用實時熒光定量PCR程序分析,采用2-△△ct法計算目的RNA的相對表達量。引物序列見表1。

        表1 引物序列

        1.6.5 滑膜組織RANKL、RANK、OPG蛋白表達檢測 將低溫保存的滑膜組織粉碎,采用Western blotting法,加入RIPA冰上裂解后勻漿離心取上清,嚴格按照BCA法測定各樣品蛋白濃度,并行SDS-PAGE電泳,恒流轉(zhuǎn)印于NC膜后封閉過夜,加入一抗室溫孵育90 min,PBST洗膜3次;二抗室溫孵育90 min,PBST洗膜3次,ECL顯色曝光。曝光后底片掃滿,以β-actin為內(nèi)參,用Quantity one專業(yè)灰度分析軟件分析條帶分子量及灰度值。

        1.6.6 血清中MMP-3、TIMP-1水平檢測 離心好的血清室溫靜置,使用ELISA法測定血清中MMP-3、TIMP-1水平,具體操作按照說明書進行。

        1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以(±s)表示,并行正態(tài)分布和單因素方差分析。若方差齊則以LSD檢驗進行比較;方差不齊則采用Tamhane’T2法。不同時間點的比較采用重復(fù)測量方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較 治療前,模型組、雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分不同時間比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=7.512,P=0.000),即存在時間效應(yīng),雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組均如此;各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分整體比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=33.709,P=0.000),即存在分組效應(yīng);與空白組比較,模型組、雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠治療第0、7、14天關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分均升高(P<0.05);與模型組比較,雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠治療第7、14天關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分均降低(P<0.05);通痹顆粒低劑量組大鼠治療第14天關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分與雷公藤多苷組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),通痹顆粒高劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分低于雷公藤多苷組(P<0.05)。時間因素與分組因素存在交互效應(yīng)(F=9.214,P=0.000)。(見表2、圖1)

        表2 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較s,分)

        表2 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較s,分)

        注:F時間主效應(yīng)=7.512,P時間主效應(yīng)=0.000;F分組主效應(yīng)=33.709,P分組主效應(yīng)=0.000;F交互效應(yīng)=9.214,P交互效應(yīng)=0.000;與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與雷公藤多苷組比較,cP<0.05

        組別 動物數(shù)(只)給藥劑量[g/(kg·d)]治療第0天 治療第7天 治療第14天 F P空白組 12 - 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 1.352 0.721模型組 12 - 8.67±1.07a 8.93±0.60a 8.75±0.17a 3.738 0.383雷公藤多苷組 12 0.024 8.69±0.76a 7.58±0.56a b 6.07±0.65a b 14.512 0.000通痹顆粒低劑量組12 9.600 8.67±0.97a 7.62±0.79a b 6.11±0.49a b 11.764 0.000通痹顆粒高劑量組12 19.200 8.66±0.84a 7.53±0.76a b 5.31±0.28a b c 17.043 0.000 F 15.961 30.118 36.732 P 0.633 0.002 0.000

        2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度比較 大鼠關(guān)節(jié)腫脹度不同時間比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=4.373,P=0.000),即存在時間效應(yīng),雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組均如此;各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度整體比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=26.728,P=0.000),即存在分組效應(yīng);與空白組比較,模型組、雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠治療第0、7、14天關(guān)節(jié)腫脹均升高(P<0.05);與模型組比較,雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠治療第7、14天關(guān)節(jié)腫脹度均降低(P<0.05);通痹顆粒低劑量組大鼠治療第14天關(guān)節(jié)腫脹度與雷公藤多苷組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),通痹顆粒高劑量組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度低于雷公藤多苷組(P<0.05)。時間因素與分組因素存在交互效應(yīng)(F=7.921,P=0.000)。(見表3、圖2)

        表3 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度比較±s,mL)

        表3 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度比較±s,mL)

        注:F時間主效應(yīng)=4.373,P時間主效應(yīng)=0.000;F分組主效應(yīng)=26.728,P分組主效應(yīng)=0.000;F交互效應(yīng)=7.921,P交互效應(yīng)=0.000;與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與雷公藤多苷組比較,cP<0.05

        組別 動物數(shù)(只)給藥劑量[g/(kg·d)]治療第0天 治療第7天 治療第14天F P空白組 12 - 3.21±0.15 3.19±0.32 3.22±0.55 1.142 0.564模型組 12 - 4.27±0.28a 4.35±0.13a 4.13±0.57a 5.871 0.293雷公藤多苷組 12 0.024 4.25±0.17a 3.91±0.51ab 3.68±0.36ab 12.057 0.000通痹顆粒低劑量組12 9.600 4.28±0.18a 3.96±0.29ab 3.71±0.49ab 9.549 0.000通痹顆粒高劑量組12 19.200 4.26±0.23a 3.83±0.37ab 3.49±0.12abc 16.374 0.000 F 35.682 63.947 78.673 P 0.761 0.002 0.000

        2.3 各組大鼠滑膜組織病理學改變情況 空白組大鼠滑膜形態(tài)正常,細胞排列整齊,未見滑膜增厚及血管新生;模型組大鼠滑膜重度增生,可見缺損及血管翳形成;雷公藤多苷組大鼠滑膜稍厚,可見輕度血管新生及少量炎癥細胞浸潤;通痹顆粒低劑量組大鼠滑膜中度增厚,可見輕度血管新生及少量炎癥細胞浸潤;通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜輕度增厚,血管新生不明顯,但可見少量炎癥細胞浸潤。提示經(jīng)過治療后,CIA大鼠滑膜病變有所改善,雷公藤多苷組和通痹顆粒高劑量組優(yōu)于通痹顆粒低劑量組。(見圖3)

        圖3 各組大鼠滑膜組織病理學比較(HE,×200)

        2.4 各組大鼠滑膜組織RANKL mRNA、RANK mRNA、OPG mRNA相對表達量比較 與空白組比較,模型組、雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織RANKL mRNA、RANK mRNA相對表達量明顯升高(P<0.05),OPG mRNA相對表達量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織RANKL mRNA、RANK mRNA相對表達量明顯降低(P<0.05),OPG mRNA相對表達量明顯升高(P<0.05);且通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織RANKL mRNA、RANK mRNA相對表達量明顯低于雷公藤多苷組(P<0.05),OPG mRNA相對表達量明顯高于雷公藤多苷組(P<0.05)。(見表4)

        表4 各組大鼠滑膜組織RANKL mRNA、RANK mRNA、OPG mRNA相對表達量比較

        表4 各組大鼠滑膜組織RANKL mRNA、RANK mRNA、OPG mRNA相對表達量比較

        注:與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與雷公藤多苷組比較,cP<0.05

        組別 動物數(shù)(只)給藥劑量[g/(kg·d)]RANKL mRNA RANK mRNA OPG mRNA空白組 12 - 1.12±0.05 1.05±0.14 2.72±0.05模型組 12 - 2.78±0.12a 3.28±0.21a 1.31±0.17a雷公藤多苷組 12 0.024 1.79±0.16ab 1.67±0.17ab 1.85±0.07ab通痹顆粒低劑量組12 9.600 2.18±0.09ab 2.17±0.19ab 1.67±0.15ab通痹顆粒高劑量組12 19.200 1.46±0.07abc 1.31±0.08abc 2.18±0.12abc

        2.5 各組大鼠滑膜組織RANKL、RANK、OPG蛋白相對表達量比較 與空白組比較,模型組、雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織RANKL、RANK蛋白相對表達量明顯升高(P<0.05),OPG蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織RANKL、RANK蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05),OPG蛋白相對表達量明顯升高(P<0.05);且通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織RANKL、RANK蛋白相對表達量明顯低于雷公藤多苷組(P<0.05),OPG蛋白相對表達量明顯高于雷公藤多苷組(P<0.05)。(見圖4、表5)

        圖4 各組大鼠滑膜組織蛋白Western blotting條帶

        表5 各組大鼠滑膜組織RANKL、RANK、OPG蛋白相對表達量比較)

        表5 各組大鼠滑膜組織RANKL、RANK、OPG蛋白相對表達量比較)

        注:與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與雷公藤多苷組比較,cP<0.05

        組別 動物數(shù)(只)給藥劑量[g/(kg·d)] RANKL RANK OPG空白組 12 - 1.65±0.13 0.14±0.02 0.76±0.03模型組 12 - 4.73±0.17a 0.59±0.04a 0.11±0.06a雷公藤多苷組 12 0.024 3.54±0.09ab 0.27±0.05ab 0.47±0.07ab通痹顆粒低劑量組12 9.600 3.61±0.14ab 0.31±0.01ab 0.41±0.05ab通痹顆粒高劑量組12 19.200 3.22±0.08abc 0.24±0.06abc 0.56±0.01abc

        2.6 各組大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平比較 與空白組比較,模型組、雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平明顯降低(P<0.05);且通痹顆粒高劑量組大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平低于雷公藤多苷組(P<0.05)。(見表6)

        表6 各組大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平比較(s,pg/mL)

        表6 各組大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平比較(s,pg/mL)

        注:與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與雷公藤多苷組比較,cP<0.05

        組別 動物數(shù)(只) 給藥劑量[g/(kg·d)] MMP-3 TIMP-1空白組 12 - 73.57±1.98 69.38±2.26模型組 12 - 87.35±2.23a 83.16±2.07a雷公藤多苷組 12 0.024 81.05±2.08ab 75.96±1.95ab通痹顆粒低劑量組12 9.600 83.72±1.52ab 79.44±2.06ab通痹顆粒高劑量組12 19.200 80.87±2.54abc 72.63±2.14abc

        3 討 論

        類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)的病理特征為滑膜組織中過量促炎因子的產(chǎn)生,包括TNF-α、IL-1β和IL-6等。這些促炎因子不僅可以誘發(fā)MMPs的產(chǎn)生引起關(guān)節(jié)破壞,還可以經(jīng)由RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)激活成骨細胞或基質(zhì)細胞生成RANKL,進而出現(xiàn)炎癥性骨侵蝕[8]。

        RA骨免疫重塑異常會導致吸收增加,從而引起骨質(zhì)流失和骨化減少,并進一步抑制骨修復(fù)而出現(xiàn)骨破壞[9]。破骨細胞是RA患者骨重塑失衡的主要細胞群,而作為其產(chǎn)生及活化的重要調(diào)控途徑,RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)發(fā)揮了重要作用。RANK的表達主要發(fā)生在破骨細胞中,而其活化因子配體RANKL則以跨膜蛋白形式廣泛表達于不同的骨細胞(成骨細胞和破骨細胞)及免疫系統(tǒng)的不同細胞亞群中,主要來源于RA的滑膜組織[10]。一旦RANKL與其受體RANK結(jié)合,破骨細胞的生成就會增加,從而發(fā)生骨免疫重塑異常導致骨質(zhì)流失,進一步引起RA骨侵蝕。OPG是一種由基質(zhì)細胞和破骨細胞分泌的RANKL可溶性受體,它可以抑制RANKL與RANK的結(jié)合,從而妨礙破骨細胞生成和骨吸收[11]。因此,RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)是調(diào)節(jié)RA骨免疫代謝的重要途徑,抑制RANKL可能是預(yù)防RA骨侵蝕的潛在治療靶點[12]。MMPs是由成纖維樣滑膜細胞分泌的一組內(nèi)肽酶,可以降解細胞外基質(zhì)蛋白,并對RA具有直接降解軟骨和骨質(zhì)的作用[13]。其中,MMP-3作為MMPs的重要組成成分,除了積極廣泛參與RA的關(guān)節(jié)破壞外[14],還能夠準確預(yù)測RA早期階段的關(guān)節(jié)損傷情況,并能監(jiān)測疾病的活動[15]。另外,MMP-3還可與其特異性產(chǎn)物TIMP-1結(jié)合,繼而通過MMP-3的活化發(fā)揮對血管侵襲和滑膜炎癥細胞浸潤的調(diào)控作用,兩者的一致性對于RA臨床預(yù)后有著顯著影響[16]。

        RA屬中醫(yī)學“歷節(jié)病”“鶴膝風”等范疇,現(xiàn)多以“尫痹”命名。《黃帝內(nèi)經(jīng)》云:“邪之所湊,其氣必虛”,《濟生方》亦載:“皆因體虛,腠理空疏,受風寒濕氣而成痹也”。正虛是尫痹發(fā)病的內(nèi)在原因,正氣不足,腠理疏松,則易感邪而為痹[17]?!夺t(yī)級·雜病》曰:“痹非三氣,患在痰瘀”,外邪痹阻經(jīng)脈關(guān)節(jié),氣血運行失暢,久則化為痰濁、瘀血,以致筋骨肌肉失于濡養(yǎng),甚則僵硬強直、屈伸不利,最終形成疑難頑疾。本課題組結(jié)合前期研究[18],提出了從“虛、瘀、痰”論治RA。據(jù)此研制出益氣養(yǎng)血、化痰逐瘀的協(xié)定方劑通痹顆粒,由當歸、黃芪、血竭、白芥子、僵蠶、甘草等組成。方中重用當歸為君,溫筋止痛,養(yǎng)血活血。黃芪甘溫為臣,大補肺脾元氣;與當歸相伍,共資氣血生化之源。僵蠶治風化痰,散結(jié)通經(jīng);血竭散瘀定痛,散滯和血;白芥子利氣豁痰,暖中散腫;三者皆為佐藥。以甘草為使,益氣健脾,調(diào)和諸藥。本實驗研究發(fā)現(xiàn),時間與組別的交互效應(yīng)對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和關(guān)節(jié)腫脹度均有影響,經(jīng)過治療后,雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和關(guān)節(jié)腫脹度均降低,治療第14天通痹顆粒高劑量組優(yōu)于雷公藤多苷組;經(jīng)治療后雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜病變均有改善,雷公藤多苷組和通痹顆粒高劑量組優(yōu)于通痹顆粒低劑量組。另外,本實驗對CIA大鼠骨代謝的進一步研究發(fā)現(xiàn),與模型組比較,雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織RANK、RANKL的mRNA和蛋白相對表達量明顯降低,OPG mRNA和蛋白相對表達量明顯升高,且通痹顆粒高劑量組優(yōu)于雷公藤多苷組,提示通痹顆粒可以通過下調(diào)RANK、RANKL,上調(diào)OPG的表達來發(fā)揮對RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。同時,與模型組比較,雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平明顯降低,且通痹顆粒高劑量組優(yōu)于雷公藤多苷組,提示通痹顆粒能有效平衡CIA大鼠血清中MMP-3和TIMP-1的異常表達。

        綜上所述,通痹顆粒能夠減輕CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥,并對關(guān)節(jié)破壞具有一定的緩解作用,其機制可能與經(jīng)由RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)和MMPs調(diào)控骨代謝的作用有關(guān)。另外,本研究還發(fā)現(xiàn)通痹顆粒對于CIA大鼠的治療呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,即通痹顆粒高劑量組優(yōu)于通痹顆粒低劑量組,但其臨床應(yīng)用中是否也存在一定的劑量相關(guān)性,將是我們接下來重點研究的內(nèi)容。下一步我們將進一步結(jié)合臨床,并從細胞分子水平探討通痹顆粒對RA的治療作用及其相關(guān)機制。

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