劉 斌，瞿昊宇，陳光宇，謝夢(mèng)洲

（1.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點(diǎn)研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

酵素是指選取一種或多種新鮮水果、蔬菜、食用菌、中草藥為基礎(chǔ)原料，經(jīng)乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多種有益菌發(fā)酵而使原材料生物活性增強(qiáng)或產(chǎn)生新的生物活性的物質(zhì)[1]。關(guān)于酵素的研究最早于20世紀(jì)初起源于日本，后來(lái)發(fā)展到歐美地區(qū)，成為了成熟的產(chǎn)業(yè)，有上千萬(wàn)消費(fèi)者每天服用酵素產(chǎn)品[2]。近30年來(lái)，中國(guó)人群的血脂水平逐步升高，血脂異?；疾÷拭黠@增加。2012年全國(guó)調(diào)查結(jié)果顯示[3]，中國(guó)成人血脂異?？傮w患病率高達(dá)40.40%，較2002年呈大幅度上升[4]。高脂血癥是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)而形成心腦血管事件的主要因素之一，有效防治血脂異常是預(yù)防心腦血管疾病的重要途徑[5-8]。目前的治療藥物對(duì)肝臟有一定損害及副作用，故不適合長(zhǎng)期服用，患者順應(yīng)性差。因此選取藥食同源中藥,開(kāi)發(fā)具有防治高脂血癥的保健食品具有廣闊的市場(chǎng)前景和重要的社會(huì)意義。山苓荷甘酵素處方來(lái)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥膳學(xué)及藥食同源功能性食品研究專家謝夢(mèng)洲創(chuàng)制的藥食同源中醫(yī)藥膳方[9]，由山楂、山藥、茯苓、荷葉、甘草5味具有降血脂作用的藥食同源中藥組成，經(jīng)提取、濃縮、植物乳酸桿菌發(fā)酵、干燥制成。前期研究[3]發(fā)現(xiàn)本方中具有降血脂作用的多糖類成分發(fā)酵后含量明顯高于發(fā)酵前，而同樣具有降血脂作用的總黃酮、荷葉堿、金絲桃苷、熊果酸幾種成分發(fā)酵前后含量變化不明顯，發(fā)酵過(guò)程對(duì)降血脂藥效的影響無(wú)法僅從測(cè)定降血脂活性成分的含量結(jié)果推斷。為闡明發(fā)酵對(duì)降血脂藥效的影響及發(fā)酵的意義，本研究選用高脂高糖模型SD大鼠對(duì)山苓荷甘酵素發(fā)酵前低劑量（臨床劑量）和中劑量（臨床劑量×2）與發(fā)酵后低劑量和中劑量進(jìn)行降血脂藥效（TC、TG、LDL-L、HDL-C）及降血糖（GLU）藥效比較，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材 料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2020-0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：1107271911005758，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004；在湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心屏障環(huán)境飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2015-0016。實(shí)驗(yàn)期間環(huán)境溫度20～26℃，濕度40%～70%。

1.2 材料與試劑 辛伐他汀片（批號(hào)：201006，默沙東公司）；山楂（批號(hào)：191203831）、荷葉（批號(hào)：20200510）、甘草（批號(hào)：20200105）、山藥（批號(hào)：191204751）、茯苓（批號(hào)：20191226）藥材飲片均購(gòu)自康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)王智教授鑒定符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》有關(guān)規(guī)定；植物乳酸桿菌CICC21790（中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）；MRS肉湯培養(yǎng)基BS1137（杭州百思生物技術(shù)有限公司）；山苓荷甘酵素發(fā)酵前后4個(gè)樣品由本實(shí)驗(yàn)室制備。GLU測(cè)定試劑盒（批號(hào)：208085）、TG測(cè)定試劑盒（批號(hào)：205015）、TC測(cè)定試劑盒（批號(hào)：208074）、LDL-C試劑盒（批號(hào)：208085）、HDL-C試劑盒（批號(hào)：208093）均購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。

1.3 儀器與設(shè)備 IMaik酶標(biāo)儀（伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司）；ATX124型電子天平（東京島津儀器有限公司）；HTP-312型電子天平（上?；ǔ彪娖饔邢薰荆?；LABOSPECT003型自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)MD公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 山苓荷甘提取物和酵素的制備方法 山苓荷甘提取物的制備：山楂、荷葉、甘草混勻，加入70%乙醇浸泡后回流提取2次，分別過(guò)濾，合并2次濾液[10]，50 ℃減壓濃縮至無(wú)醇味；山藥、茯苓混勻，加水浸泡1 h，提2次，分別過(guò)濾，濾液與醇提濃縮液合并[11]，50 ℃減壓濃縮至每1 mL相當(dāng)于藥材2 g，-80 ℃冰箱保存。山苓荷甘酵素的制備：提取濃縮方法同山苓荷甘提取物，將每1 mL相當(dāng)于藥材2 g的濃縮液121 ℃滅菌25 min，無(wú)菌條件下在滅菌液中加入2%的雙歧桿菌菌粉，在37 ℃培養(yǎng)72 h發(fā)酵，發(fā)酵液置-80 ℃冰箱保存[12-13]。

2.2 動(dòng)物分組及給藥劑量 將70只SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為7組：山苓荷甘發(fā)酵前中、低劑量組，山苓荷甘發(fā)酵后中、低劑量組，空白對(duì)照組，高脂血癥模型組，辛伐他汀陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。高脂血癥模型組及山苓荷甘發(fā)酵前后各劑量組大鼠給予高脂飼料（78.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽），并按5 mL/kg劑量給予生理鹽水。山苓荷甘發(fā)酵前后低劑量組大鼠分別按2.5 mL/kg（相當(dāng)于給藥量5 g/kg）給予相應(yīng)的藥液灌胃，山苓荷甘發(fā)醇前后中劑量組大鼠分別按5 mL/kg（相當(dāng)于給藥量10 g/kg）給予相應(yīng)的藥液灌胃，辛伐他汀陽(yáng)性對(duì)照組大鼠灌胃量為5 mg/kg，空白對(duì)照組按5 mL/kg劑量給予生理鹽水。

2.3 造模與給藥 大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周，禁食12 h，眼眶采血2 mL，檢測(cè)基礎(chǔ)血脂，造模前各組大鼠血脂比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。1周后開(kāi)始高脂飼料（78.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉和10%豬油、0.2%膽鹽）造模，自正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，除空白對(duì)照組喂基礎(chǔ)飼料，其余各組大鼠換用高脂飼料喂養(yǎng)10 d，禁食12 h，眼眶采血2 mL，測(cè)定血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、葡萄糖（GLU）。與喂飼高脂飼料前比較，TC、TG、GLU顯著升高（P<0.05），可確定已形成高脂血癥模型。造模第11天開(kāi)始大鼠灌胃，連續(xù)給藥30 d，各組大鼠均自由飲水和進(jìn)食?？瞻讓?duì)照組大鼠給藥期間喂基礎(chǔ)飼料，其余各組大鼠給藥期間繼續(xù)喂高脂飼料。

2.4 觀察指標(biāo) 末次給藥后禁食12 h以上，麻醉后從腹主動(dòng)脈取血，放置2 h，凝固后3 000 r/min離心15 min。血樣離心后取上層血清，按照試劑盒說(shuō)明書采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），往預(yù)先包被TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU抗體的包被微孔中依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），代入各項(xiàng)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)的濃度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)，各組每只大鼠每項(xiàng)指標(biāo)所有數(shù)據(jù)先通過(guò)狄克松法（Dixson）、格拉布斯法（Grubbs）、指數(shù)分布樣本法及專業(yè)知識(shí)進(jìn)行異常值檢驗(yàn)，舍去異常值，再進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)（Shapiro—Wilk），皆滿足正態(tài)性（P＞0.05），采用完全隨機(jī)單因素試驗(yàn)方差分析及LSD法進(jìn)行兩兩比較。

3 結(jié)果

（1）血清TC：高脂血癥模型組大鼠血清TC與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05），表明造模不成功，實(shí)驗(yàn)誤差太大，導(dǎo)致結(jié)果異常。

（2）血清TG：山苓荷甘發(fā)酵前中、低劑量組，山苓荷甘發(fā)酵后中、低劑量組，高脂血癥模型組，以及辛伐他汀陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清TG均高于空白對(duì)照組（P＜0.05），表明造模成功；山苓荷甘發(fā)酵前中、低劑量組，山苓荷甘發(fā)酵后中、低劑量組，以及辛伐他汀陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清TG與高脂血癥模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明辛伐他汀，發(fā)酵前中、低劑量山苓荷甘酵素，以及發(fā)酵后中、低劑量山苓荷甘酵素均無(wú)降低TG的藥效。

（3）血清HDL-L：高脂血癥模型組大鼠血清HDL-L與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05），表明造模不成功，實(shí)驗(yàn)誤差太大，導(dǎo)致結(jié)果異常。

（4）血清LDL-C：高脂血癥模型組大鼠血清LDL-C高于空白對(duì)照組（P＜0.05），表明造模成功；山苓荷甘發(fā)酵后中劑量組、辛伐他汀陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清LDL-C均低于高脂血癥模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明發(fā)酵后中劑量山苓荷甘酵素、辛伐他汀均可有效地降低高脂血癥大鼠血清LDL-C；而其他各組大鼠血清LDL-C與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05），表明無(wú)降低LDL-C作用。

（5）GLU：高脂血癥模型組大鼠血清GLU高于空白對(duì)照組（P＜0.05），表明造模成功；山苓荷甘發(fā)酵前中、低劑量組，山苓荷甘發(fā)酵后中、低劑量組，以及辛伐他汀陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清GLU均低于高脂血癥模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；山苓荷甘發(fā)酵前中、低劑量組，山苓荷甘發(fā)酵后中、低劑量組，以及辛伐他汀陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清GLU與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明辛伐他汀，發(fā)酵前中、低劑量山苓荷甘酵素，以及發(fā)酵后中、低劑量山苓荷甘酵素均有降低GLU的藥效，且能降低大鼠血清GLU至空白對(duì)照組水平。（見(jiàn)表1）

表1 各組大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU 比較（，ng/L）

表1 各組大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU 比較（，ng/L）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與高脂血癥模型組比較bP＜0.05

4 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山苓荷甘發(fā)酵后中劑量組和辛伐他汀陽(yáng)性對(duì)照組有降低LDL-C的作用，即具有降血脂作用；辛伐他汀陽(yáng)性對(duì)照組，山苓荷甘發(fā)酵前低、中劑量組，以及山苓荷甘發(fā)酵后低、中劑量組均有降低GLU的作用，即這5組皆具有降低血糖的作用。

本實(shí)驗(yàn)方法系參照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局2014年下發(fā)的保健食品9個(gè)功能檢驗(yàn)方法中附件6輔助降血脂功能評(píng)價(jià)方法，“用含有膽固醇、蔗糖、豬油、膽酸鈉的飼料喂養(yǎng)動(dòng)物可形成脂代謝紊亂動(dòng)物模型，再給予動(dòng)物受試樣品，可檢測(cè)受試樣品對(duì)高脂血癥的影響，并可判定受試樣品對(duì)脂質(zhì)的吸收、脂蛋白的形成、脂質(zhì)的降解或排泄產(chǎn)生的影響”。

TC測(cè)定數(shù)據(jù)中空白對(duì)照組與高脂血癥模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05），表明造模不成功，實(shí)驗(yàn)誤差太大，導(dǎo)致結(jié)果異常，故本實(shí)驗(yàn)相當(dāng)于探索性的預(yù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明山苓荷甘發(fā)酵后的降血脂作用優(yōu)于不發(fā)酵，發(fā)酵工序不可缺少，下一步按保健食品研究與開(kāi)發(fā)進(jìn)行功能試驗(yàn)時(shí)，必須在第三方認(rèn)證機(jī)構(gòu)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以減少操作誤差。