常 亮 任妲妮 焦利萍 劉 娟 李 乾 劉 平*

1.北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，國家婦產(chǎn)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(北京大學(xué)第三醫(yī)院)，輔助生殖教育部重點實驗室(北京大學(xué))，北京市生殖內(nèi)分泌與輔助生殖技術(shù)重點實驗室(100191)；2.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所

妊娠期葉酸缺乏可導(dǎo)致妊娠期并發(fā)癥和不良妊娠結(jié)局的發(fā)生[1-2]。葉酸代謝障礙是導(dǎo)致妊娠期女性體內(nèi)葉酸缺乏的重要因素之一。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合酶還原酶(MTRR)是葉酸代謝通路中的兩個關(guān)鍵酶，其基因位點的多態(tài)性會影響機體的葉酸利用能力[3]。MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G是臨床上常用的葉酸代謝能力SNPs檢測位點。MTRR基因A66G位點的研究較少，但其單核苷酸多態(tài)性的改變同樣會影響酶的活性，導(dǎo)致血液中葉酸水平發(fā)生改變[4]。檢測葉酸代謝通路相關(guān)基因多態(tài)性，可以更好指導(dǎo)妊娠期女性調(diào)整葉酸的使用劑量，避免相關(guān)妊娠期并發(fā)癥和不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。20世紀80年代出現(xiàn)的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)是一種軟電離質(zhì)譜技術(shù)[5]，具有靈敏度高、準確度高、兼容性強、通量高、樣本質(zhì)量要求低、成本低以及操作簡便等特點[6]，在臨床分子診斷方面具有極大潛力。本研究以目前臨床上檢測葉酸代謝能力的主流方法實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR)的結(jié)果為參考，評價MALDI-TOF MS用于葉酸代謝相關(guān)基因多態(tài)性的檢測，為指導(dǎo)備孕人群和妊娠期女性合理服用葉酸提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

隨機選取2019年9月在本院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的不孕癥患者100例。研究對象要求進行葉酸代謝能力檢測，收集其EDTA抗凝外周血標本，用于后續(xù)基因組DNA提取和基因多態(tài)性檢測。本研究經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究倫理委員會批準(2019-431-02)。

1.2 基因組DNA 提取

使用全血基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，取200μl全血樣本進行全基因組提取。獲得的基因組DNA用NanoQ評估核酸濃度和質(zhì)量，取濃度20～50mg/L和A 260/280值在1.7～2.0范圍內(nèi)的樣本進行后續(xù)實驗。暫不用于實驗的DNA樣本保存于-20℃冰箱。操作按照試劑盒說明書。

1.3 RT-qPCR檢測葉酸代謝能力

使用葉酸代謝能力測定試劑盒(熒光法，江西諾德醫(yī)療器械有限公司)檢測MTHFR 677 C>T和1298 A>C。按試劑盒說明書，將熒光基團預(yù)混液加入反應(yīng)體系后，按順序加入陽性對照、陰性對照和待測樣本，置于熒光定量PCR儀(羅氏cobas 480,軟件版本號：LCS480 1.5.1.62 SP2.UDF V2.0.0)擴增檢測。MTHFR C677T的陽性對照對應(yīng)的基因型分別是純合突變(TT)、雜合突變(CT)和野生型(CC)，A1298C的陽性對照對應(yīng)的基因型分別是純合突變(CC)、雜合突變(AC)和野生型(AA)；陰性對照為超純水。RT-qPCR反應(yīng)程序：95℃10min，激活熒光基團。95℃5s，樣本變性；60℃40s，使熒光基團與樣本充分結(jié)合；該過程進行40個循環(huán)。室溫冷卻1min，完成反應(yīng)。60℃收集熒光信號，執(zhí)行程序，保存文件。檢測結(jié)果使用“Endpoint Genotyping”進行結(jié)果分析，將待測樣本的點和對照進行比較，判讀待測樣本MTHFR C677T和A1298C兩個位點的基因型。

1.4 MALDI-TOF MS檢測葉酸代謝能力

使用MTHFR和MTRR基因檢測試劑盒(PCR-飛行時間質(zhì)譜法，北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司)檢測?；蚪MDNA樣本進行PCR擴增后，加入蝦堿性磷酸酶消化，進行單堿基延伸反應(yīng)。將延伸產(chǎn)物純化后進行點樣，并應(yīng)用MALDI-TOF MS系統(tǒng)(Clin-ToF II，北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司)進行樣本的相關(guān)基因型分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS(IBM SPSS Statistics 22. lnk)對檢測結(jié)果進行分析。對研究對象進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，各基因型頻率和等位基因頻率采用擬合優(yōu)度χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Kappa檢驗用于比較組間檢測結(jié)果的一致性，Kappa值>0.95被認為具有很好的一致性。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR檢測結(jié)果

100例葉酸代謝關(guān)鍵酶MTHFR C677T和A1298C兩個多態(tài)位點檢測結(jié)果見圖1(1541頁)。純合突變(綠色)、雜合突變(紅色)、野生型(藍色)和陰性對照(灰色)的分布如圖1a(1541頁)所示。根據(jù)檢測點的分布，可以判讀樣本中MTHFR C677T位點為純合突變(TT)、雜合突變(CT)和野生型(CC)(圖 1b，1541頁)；A1298C位點為純合突變(CC)、雜合突變(AC)和野生型(AA)(圖 1c，1541頁)。

2.2 MALDI-TOF MS檢測結(jié)果

MTHFR C677T檢測的質(zhì)譜圖分別展示了3種基因型，即野生型(CC)、雜合突變(CT)和純合突變(TT)(圖2a，1541頁)；A1298C的質(zhì)譜圖分別展示了3種基因型，即野生型(AA)、雜合突變(AC)和純合突變(CC)(圖2b，1541頁)。MTRR A66G位點的質(zhì)譜圖分別展示了3種基因型，即野生型(AA)、雜合突變(AG)和純合突變(GG)(圖2c，1541頁)。

2.3 RT-qPCR和MALDI-TOF MS檢測結(jié)果比較

本次實驗結(jié)果顯示， MALDI-TOF MS與RT-qPCR對MTHFR 677 C>T、1298 A>C檢測結(jié)果的符合率為100%(表1)。MALDI-TOF MS同時檢測MTRR 66 A>G位點的結(jié)果為AA型50例，AG型44例，GG型6例，G等位基因頻率為28.0%。Hardy-Weinberg平衡定律的檢驗結(jié)果驗證了MTHFR 677 C>T、1298 A>C和MTRR 66 A>G位點的分離平衡性，其中MTRR 66 A>G的χ2為0.52，P為0.77。

表1 MALDI-TOF MS與RT-qPCR對MTHFR 677 C>T、1298 A>C的檢測結(jié)果比較[例(%)]

3 討論

葉酸代謝能力的評估不僅對妊娠期女性有重要意義，對其他人群，尤其是備孕的人群也重要參考意義。有研究表明，MTHFR C677T和A1298C的多態(tài)性與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)[7-9]。葉酸代謝關(guān)鍵酶的多態(tài)性也有可能引起男性不育[10]。此外，MTHFR基因的突變可能會引起同胱氨酸水平升高，導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥，從而引起一系列疾病的發(fā)生。因此，快速準確評估葉酸代謝能力，科學(xué)指導(dǎo)葉酸補充，對于人群健康非常重要。

本研究采用MALDI-TOF MS檢測葉酸代謝關(guān)鍵酶基因基因多態(tài)性位點的體系，與RT-qPCR法進行比較，二者的檢測結(jié)果完全一致，說明MALDI-TOF MS檢測準確度高；此外，MALDI-TOF MS法能同時完成100份樣本2個葉酸代謝關(guān)鍵酶基因共3個SNP位點的檢測，具有通量高的特點。葉酸代謝關(guān)鍵酶具有多個多態(tài)位點。就MTHFR而言，目前已確定的SNPs位點有20余種，其中研究得較多的有5個位點，除了長期用于臨床診斷的677 C>T和1298 A>C, 還有1059T>C、1793G>A和203G>A[10]。MALDI-TOF MS具有通量高、成本低等優(yōu)點，可以覆蓋更多的檢測位點，也能夠針對不同人群選擇相應(yīng)的多態(tài)位點進行檢測，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前臨床上葉酸代謝能力檢測的主流方法是RT-qPCR法，該方法雖然準確度和特異性高，但是對樣本質(zhì)量有較高要求，RT-qPCR法每個反應(yīng)需要至少20ng DNA樣本量，而MALDI-TOF MS只需要10ng即可，說明后者靈敏度更高。另外，RT-qPCR法單次檢測量和檢測項目有限，因此成本相對較高；而MALDI-TOF MS直接檢測物質(zhì)的分子量，無熒光信號干擾，可一管同時擴增多個SNP位點，對于需要檢測多個項目的樣本而言，操作更加簡便，兼容性強，單個檢測項目的成本較低。本實驗結(jié)果表明，MALDI-TOF MS能準確檢測葉酸代謝關(guān)鍵酶SNPs位點。