劉丹彤 姚海榮 李 倩 齊冰麗 張紀(jì)炎

河北省滄州市中心醫(yī)院(061000)

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，已有研究表明，miRNA在卵巢癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中扮演了非常重要角色[1]。miR-363-3p是近年來發(fā)現(xiàn)的一個miRNA，在卵巢癌中發(fā)揮抑癌作用[2]。SOX4基因是SOX(SRY-related HMG-box)的家族成員，可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[3-4]。生物信息學(xué)篩查發(fā)現(xiàn)，SOX4可能是miR-363-3p的靶基因。miR-363-3p與SOX4在卵巢癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中是否具有調(diào)控作用有待探究。本研究以卵巢癌SKOV3細(xì)胞為研究對象，初步探討miR-363-3p靶向調(diào)控SOX4對卵巢癌SKOV3細(xì)胞的生物學(xué)行為。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

正常卵巢IOSE80細(xì)胞及卵巢癌SKOV3細(xì)胞購于上海江林生物科技有限公司。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司。Transwell小室購自美國Corning公司，Matrigel膠購自美國B&D公司。Lipofectamine TM2000 購自美國Thermo Fisher公司。蛋白雙染marker、顯影液、5%脫脂奶粉、Trizol試劑、一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒及miR-363-3p、U6、SOX4、vimentin、E-cadherin和GAPDH引物購自上海生工生物科技有限公司。熒光素酶檢測報告系統(tǒng)試劑盒購于美國Promega公司。miR-363-3p mimics及陰性對照(mimics NC)購自上海吉瑪科技有限公司。兔抗SOX4單克隆抗體、兔抗vimentin單克隆抗體、兔抗E-cadherin單克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體及山羊抗兔IgG二抗購于艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 miR-363-3p和SOX4 mRNA的表達(dá)

收集生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期正常卵巢IOSE80細(xì)胞及卵巢癌SKOV3細(xì)胞，分別加入TRIzol提取RNA，參照一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒檢測miR-363-3p和SOX4的表達(dá)。miR-363-3p正向：5'-GGATTGCACGGTATCCA-3'，反向：5'-TTTGGCACTAGCACATT-3'；U6正向：5'-GCTTCG GCAGCA CA-3'，反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。SOX4正向5'- CAGCAAACCAACAATGCCGA-3'，反向：5'-GATCTGCGACCACACCATG-3'；GAPDH正向：5'-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3'，GAPDH反向：5'- GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

將生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞按照每孔2×105個接種至6孔細(xì)胞板上，置37℃、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜。制備終濃度為80 nmol/L miR-363-3p mimics。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine TM2000說明書步驟轉(zhuǎn)染，同時設(shè)置陰性對照mimcs NC組和空白對照組。通過RT-qPCR實驗檢測miR-363-3p轉(zhuǎn)染效率。

1.4 Transwell實驗檢測各組遷移和侵襲的能力

收集各組轉(zhuǎn)染48 h后的SKOV3細(xì)胞，每孔2×104個接種于Matrigel膠包被(未包被)的Transwell小室中，下室中加入含血清的培養(yǎng)液600μl，培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，棉簽擦掉小室上層細(xì)胞，顯微鏡觀察并拍照。

1.5 RT-qPCR實驗檢測各組SOX4、vimentin和E-cadherin mRNA的表達(dá)

收集各組轉(zhuǎn)染48 h后的SKOV3細(xì)胞，按照1.2步驟進(jìn)行操作。Vimentin正向5'-GAGCAGCAGAATAAGATCCTG-3'，反向5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGG-3'；E-cadherin正向5'-CATTTCTTGGTCTACGCCTG-3'，反向5'-GAGAGGAGTTGGGAAATGTG-3'。

1.6 Western Blot實驗檢測各組SOX4、vimentin和E-cadherin蛋白的表達(dá)

收集各組轉(zhuǎn)染48 h后的SKOV3細(xì)胞，分別加入RIPA裂解液并在冰上放置20min，4℃ 13000 rpm離心20 min，采用BCA試劑盒測定上清蛋白含量。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)PVDF膜，用2%BSA封閉液封閉，分別加入一抗4℃過夜，以GAPDH抗體為參照，再加入二抗室溫孵育1 h。ECL曝光成像，采用Alpha Imager HP凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.7 熒光素酶報告基因檢測miR-363-3p和SOX4結(jié)合

構(gòu)建野生型(SOX4-W)和突變型(SOX4-M)的SOX4 3’-UTR雙熒光報告質(zhì)粒。將對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞以每孔105個接種至12孔細(xì)胞板上，將SOX4-W、SOX4-M與miR-363-3p mimics或mimics NC陰性對照共轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞。每組實驗設(shè)置6個重復(fù)。培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒步驟檢測熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-363-3p和SOX4在細(xì)胞中的表達(dá)

RT-qPCR檢測結(jié)果表明，卵巢癌SKOV3細(xì)胞中miR-363-3p的相對表達(dá)量(1.57±0.01)低于正常卵巢IOSE80細(xì)胞(11.13±0.30)(t=30.85，P<0.001)，SOX4的相對表達(dá)量(7.43±0.02)高于正常卵巢IOSE80細(xì)胞(0.86±0.03)(t=148.20，P<0.001)。

2.2 miR-363-3p mimics轉(zhuǎn)染效率

miR-363-3p mimics組SKOV3細(xì)胞中miR-363-3p水平為3.43±0.06，mimics NC組SKOV3細(xì)胞中miR-363-3p水平為1.57±0.03，SKOV3 mimics的轉(zhuǎn)染效率為84.14±1.22%。

2.3 過表達(dá)miR-363-3p對卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell結(jié)果顯示，與mimics NC組和空白對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-363-3p mimics的SKOV3細(xì)胞侵襲及遷移能力降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量比較(個，

2.4 過表達(dá)miR-363-3p對卵巢癌SKOV3細(xì)胞中SOX4、vimentin和E-cadherin表達(dá)的影響

RT-qPCR和Western Blot實驗結(jié)果顯示，miR-363-3p mimics組SOX4和vimentin表達(dá)均低于mimics NC組和空白對照組(P<0.05)，而E-cadherin表達(dá)高于mimics NC組和空白對照組(P<0.05)。見表2和圖1(1539頁)。

表2 各組SKOV3細(xì)胞中SOX4、vimentin、E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)比較

2.5 SOX4是miR-363-3p的靶基

應(yīng)用starbase生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測SOX4 3’-UTR上存在miR-363-3p的結(jié)合位點(圖2，1539頁)。熒光素酶實驗結(jié)果顯示，在SOX4-W中，與mimics NC組相比，miR-363-3p mimics組熒光素酶活力值降低(t=19.60，P<0.001)。但在SOX4-M中熒光素酶的活性無明顯變化(表3)。miR-363-3p靶向結(jié)合SOX4的3’-UTR。

表3 各組熒光素酶的活性

3 討論

miRNA是新發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)來影響機(jī)體功能的一類小分子RNA，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。miR-363-3p是最近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制因子[2,5-8]。通過靶向PCNA、PIK3CA、NOTCH1、NOB1、PDZD2等關(guān)鍵因子來調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展。miR-363-3p在腫瘤中的調(diào)控機(jī)制較復(fù)雜。本研究發(fā)現(xiàn)miR-363-3p在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中表達(dá)量降低，在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-363-3p mimics后，可抑制SKOV3細(xì)胞的遷移和侵襲。提示miR-363-3p通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲在卵巢癌發(fā)揮抑癌作用，但調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

SOX4是一種與發(fā)育密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞分化、祖細(xì)胞發(fā)育，以及PI3K、Wnt和TGF-β等多種信號傳導(dǎo)。目前研究表明SOX4可在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，既可以發(fā)揮原癌基因的功能，也可以發(fā)揮抑癌基因的功能[9-10]。Li[3]和Xi[4]等結(jié)果表明在卵巢癌細(xì)胞上調(diào)SOX4可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。因此SOX4在卵巢癌是一種潛在的促癌基因。在本研究中，SOX4在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中表達(dá)量升高，在miR-363-3p mimics轉(zhuǎn)染后下調(diào)。另外，本研究應(yīng)用雙熒光素酶實驗驗證了miR-363-3p對SOX4有靶向調(diào)控作用。以上結(jié)果表明，SOX4是miR-363-3p的靶基因，miR-363-3p可能通過下調(diào)SOX4實現(xiàn)其功能。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。波形蛋白(vimentin)高表達(dá)和鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)的缺失被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞EMT的典型分子標(biāo)記物[11]。目前發(fā)現(xiàn)Snail、Twist、ZEB1、ZEB2等多種轉(zhuǎn)錄因子，抑制E-cadherin、促進(jìn)vimentin的表達(dá)而誘導(dǎo)EMT發(fā)生，提高細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力[12-14]。本研究結(jié)果表明，miR-363-3p mimics轉(zhuǎn)染后，下調(diào)SOX4的同時也下調(diào)vimentin和上調(diào)了E-cadherin的活性。我們推測miR-363-3p可以直接抑制SOX4的表達(dá)，從而抑制EMT發(fā)生。該推測已在Zhang[15]等研究中得到證實，該研究表明SOX4是一個新的EMT誘導(dǎo)因子，通過激活TGF-β通路啟動EMT程序促進(jìn)乳腺癌進(jìn)程。

綜上所述，miR-363-3p在卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲過程中發(fā)揮重要抑癌作用，上調(diào)表達(dá)可有效抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，其作用機(jī)制可能與靶向抑制SOX4表達(dá)有關(guān)。