馬 彬 夏良育 楊紫霞 寧美英

1.國家衛(wèi)生健康委科學技術(shù)研究所(北京，100081)；2.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院

黃體功能不全是不孕不育的重要原因，其可導(dǎo)致卵發(fā)育和子宮內(nèi)膜發(fā)育不同步以及孕激素下降，從而造成不孕和自然流產(chǎn)[1]。對于黃體支持(LPS)，臨床上多采用不同劑型的黃體酮、小劑量人絨毛膜促性腺激素(hCG)等。而黃體酮安全性更高，是目前LPS的首選藥物[2-3]，目前市售黃體酮主要通過口服、注射、陰道給藥。黃體酮陰道制劑既可以避免口服給藥的首過效應(yīng)，在子宮局部發(fā)揮藥效，有效減少副作用，相比于黃體酮肌內(nèi)注射劑無創(chuàng)傷、更方便，患者依從性更優(yōu)[4]。本課題組將設(shè)計出一種以乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)為載體材料的黃體酮儲庫型陰道環(huán)[5]用于LPS，但目前對于黃體酮陰道環(huán)用于LPS的釋放劑量尚無參考標準，考慮到陰道給藥制劑黃體酮凝膠制劑-雪諾同(Crinone 8%)的臨床應(yīng)用效果已得到認可，故以雪諾同為參比制劑，對比兩者藥代動力學特點，以期為處方工藝優(yōu)化以及自制陰道環(huán)體外釋放量的初步確定提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-20AD 液相色譜儀(日本島津公司)；Triple Quad 6500三重四級桿質(zhì)譜儀(美國AB Sciex 公司)；ST40R 離心機(美國Thermo Fisher 公司)；88600V -80 ℃冰箱(美國Thermo Fisher 公司)；Brand Handystep electronic連續(xù)分液器(德國Brand 公司)；96 孔板(美國AXYGEN 公司)；VG3.2渦旋振蕩器(德國IKA 公司)。

1.2 材料

黃體酮原料藥(含量99.7%，批號：100027-201209，中國食品藥品檢定研究院)；黃體酮陰道緩釋凝膠(雪諾同8%，90 mg/支，批號：C18124Y/B，進口藥注冊證號：H20140552，美國MERCK公司)；黃體酮陰道環(huán)(1000 mg/個，自制批號：2019-12-10)；乙腈(批號：178503，美國Fisher公司)；二甲基亞砜(批號：14070312，美國TEDIA公司)；醋酸甲地孕酮原料藥(內(nèi)標，含量99.2%，批號：100171-201204，中國食品藥品檢定研究院)；甲醇(批號：WXBC2212V，美國Sigma公司)。

1.3 實驗動物

巴馬小型豬，普通級，23～35 kg，10～24月齡，雌性，購買于北京實創(chuàng)世紀小型豬飼養(yǎng)基地，許可證號：SCXK(京)2018-0011。

1.4 色譜條件與質(zhì)譜條件

流動相A：水(含0.1%甲酸)；流動相B：乙腈(含0.1%甲酸)；采用梯度洗脫；色譜柱：Kinetex C18(50mm×3 mm，2.6 μm)；進樣量：10 μl；柱溫：40℃；流速：0.7 ml/min。

去簇電壓(DP)：80 V(黃體酮)，60 V(醋酸甲地孕酮)；離子源：電噴霧電離源(ESI)，正離子化方式；32 V(黃體酮)，18 V(醋酸甲地孕酮)；離子源溫度：600℃；離子源電壓：5500 V；碰撞能量(CE)：入口電壓(EP)：10 V(黃體酮)，10 V(醋酸甲地孕酮)；碰撞氣壓力(CAD)：10 psi；加熱氣壓力(GS1)：60 psi；輔助氣壓力(GS2)：60 psi；用于定量分析的離子反應(yīng)：m/z 315.2 →m/z 108.9(醋酸甲地孕酮)、m/z 385.3→m/z 325.5(醋酸甲地孕酮)；多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)；氣簾氣壓力(CUR)：30 psi。

1.5 體內(nèi)檢測方法

本實驗室前期已開發(fā)出一種簡單、快速的LC-MS/MS方法，并驗證了該方法的有效性，適合于定量分析去卵巢型豬血漿中孕酮(PGT)[6]。見表1。

表1 測定血漿中孕酮LC-MS/MS的方法

1.6 給藥方式及樣品采集

在實驗周期內(nèi)對6只巴馬小型豬進行體檢，保證動物在實驗周期內(nèi)機體狀況良好。實驗周期：3d空白對照期；3d參比制劑給藥期(雪諾同凝膠8%，90 mg)，每日相同時間給藥1次；7d黃體酮陰道環(huán)給藥期，給藥1次持續(xù)7d。

采用自身對照法，在實驗開始前對巴馬小型豬進行去勢操作，摘除子宮和卵巢，避免內(nèi)源性黃體酮對實驗結(jié)果的干擾。去勢操作之后對巴馬小型豬進行身體健康觀察14d，確?；謴?fù)正常。14d后在小型豬恢復(fù)正常條件下，麻醉巴馬小型豬，以K2EDTA抗凝管靜脈取全血1 ml，采血3d為1周期，每日相同時間采血1次用于觀察自身黃體酮濃度。當自身黃體酮未檢出表明去勢手術(shù)成功。

在3d參比制劑給藥期間，分別將巴馬小型豬麻醉后給雪諾同凝膠，并在第1天給藥0 h、給藥1.5 h采血(采血時間根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果)，第2，3天重復(fù)以上操作。觀察小型豬健康狀況，清洗7d，避免參比制劑黃體酮對后續(xù)陰道環(huán)黃體酮體內(nèi)檢測產(chǎn)生影響。

在第3階段，將小型豬麻醉后于陰道置入自制黃體酮陰道環(huán)，給藥0，6，12，24，36，48，72，96，120，144，168 h分別采血。取血漿(2 h內(nèi))并轉(zhuǎn)移至離心管，儲存在-20 ℃冰箱，待樣品采集完畢-80 ℃保存。

1.7 臨床觀察

在實驗周期間，觀察巴馬小型豬的健康狀況變化(包括死亡、行為、精神、飲食、糞便性狀)、動物的陰道物理狀態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

去勢手術(shù)后，恢復(fù)狀況欠佳的有1號小型豬；除此之外，其它小型豬恢復(fù)良好。1～6號小型豬在空白樣品采集過程中均無異常。1～6號小型豬在參比制劑黃體酮凝膠給藥期間，第1天和第2天均無異常情況，第3天除2號小型豬的陰道有白色分泌物，其它無異常。黃體酮緩釋陰道環(huán)給藥期間有脫落現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)脫落后立即塞回陰道，陰道環(huán)置于小型豬陰道7d后統(tǒng)一取出。

2.2 體內(nèi)黃體酮血藥濃度分析結(jié)果

在去勢空白對照期，測得小型豬黃體酮血藥濃度均為0 ng/ml，以證明去勢手術(shù)成功。在放置黃體酮陰道環(huán)前，檢測小型豬血漿中黃體酮血藥濃度為0 ng/ml，證明參比制劑已不會影響黃體酮陰道環(huán)的檢測。各個時間點參比制劑給藥期的血藥濃度，如圖1所示。各個時間點陰道環(huán)給藥期的血藥濃度，如圖2所示。由藥代動力學實驗結(jié)果可知，1次/日，總計3日的黃體酮凝膠藥代動力學參數(shù)：Cmax=10.818 ng/ml，Tmax=1.5 h，AUC0～49.5 h=327.983 ng/(ml·h)，CAVG=6.626 ng/ml；1次/7日，總計7日的黃體酮陰道環(huán)的藥代動力學參數(shù)：Cmax=7.054 ng/ml，Tmax=12.0 h，AUC0～168 h=821.913 ng/(ml·h)，CAVG=4.892 ng/ml。

圖1 雪諾同凝膠給藥后小型豬的血藥濃度曲線(n=6)

圖2 自制黃體酮陰道環(huán)給藥后小型豬的血藥濃度曲線(n=6)

2.3 體內(nèi)外相關(guān)性

同批黃體酮陰道環(huán)的數(shù)據(jù)顯示：7d平均釋放量(MDR)為17.906 mg，體外釋放曲線的r=0.9879，近似零級釋放。圖3為7d內(nèi)，同一批自制黃體酮陰道環(huán)體外釋放結(jié)果。將黃體酮陰道環(huán)體外釋放量進行零級釋放方程擬合，得到體外零級釋放方程累積釋放量CR=14.852t+25.559，r=0.9879，7d平均每日釋放量MDR=17.906 mg。6只巴馬小型豬體內(nèi)黃體酮平均血藥濃度-時間曲線與體外釋放曲線對比見圖4。

圖3 自制黃體酮陰道環(huán)體外釋放曲線(n=6)

圖4 自制黃體酮陰道環(huán)中黃體酮在體內(nèi)外釋放曲線

從圖4可見，前3d黃體酮血藥濃度均緩慢下降，但第3天體內(nèi)吸收后略有升高，是因為有部分陰道環(huán)脫落，導(dǎo)致本應(yīng)該在前幾天的吸收累積在后幾天?？傮w而言，體內(nèi)吸收呈下降趨勢。

3 討論

在LPS中，黃體酮作為內(nèi)源性物質(zhì)可以起到保胎和穩(wěn)定子宮內(nèi)膜的作用[7-8]。黃體酮陰道制劑使用方便，副作用小，藥效好，來自臨床實踐的證據(jù)表明，陰道孕酮制劑是輔助生殖技術(shù)中LPS的首選方法[9]。但是黃體酮凝膠會導(dǎo)致陰道出血或乳房觸痛，易怒和局部發(fā)熱等不良反應(yīng)[10]。陰道環(huán)相對于陰道凝膠在安全性和有效性方面無差異，同時具有取放自給、無創(chuàng)傷、較少不良反應(yīng)的優(yōu)勢。文獻報道，陰道環(huán)材料一般采用硅橡膠[11]、EVA等[12]，目前國外已上市的產(chǎn)品大多采用硅橡膠，如Progering、Annovera等。硅橡膠陰道環(huán)制作復(fù)雜，且不能回收利用，易造成環(huán)境污染[13-14]。EVA是一類經(jīng)美國食品和藥物管理局(FDA)批準的生物材料，具有生物相容性好、機械性能好、理化性質(zhì)穩(wěn)定等特點，并且已有商品化的以EVA為基質(zhì)的藥物控制釋放體系用于臨床[15-17]。因此本課題組嘗試以EVA為載體材料，設(shè)計出一種黃體酮陰道環(huán)用于LPS，本文針對黃體酮陰道環(huán)用于輔助生殖的釋放劑量尚無參考的問題進行初步藥代動力學比較研究。

在選擇實驗動物中，有以下幾個方面的考慮：小型豬逐漸取代狗和靈長類動物被許多國家用作毒理和藥理模型；此外，中國國家食品藥品監(jiān)督管理局宣布小型豬可以用于新化學品的臨床前藥代動力學研究[18-20]；小型豬遺傳穩(wěn)定，抗病能力強，生理學方面與人類有相似之處，這使得巴馬小型豬廣泛應(yīng)用于醫(yī)學研究，包括咽喉部反流研究以及人用藥物評價等[21-23]；同時考慮到本研究為陰道給藥，而常用的實驗動物如大鼠、家兔等體型太小，無法置入完整的陰道環(huán)，影響實驗結(jié)果的可靠性，因此選取雌性巴馬小型豬，由于要排除自身體內(nèi)黃體酮的干擾，本實驗將小型豬去勢后進行實驗。但是由于本研究是第一次以巴馬小型豬為動物模型開展黃體酮陰道環(huán)藥代動力學的研究，陰道后穹隆處放置陰道環(huán)經(jīng)驗不足，導(dǎo)致有黃體酮陰道環(huán)脫落，但是總體趨勢體內(nèi)與體外釋放呈現(xiàn)了較好的相關(guān)性，因此可以作為調(diào)整處方的科學依據(jù)。

國內(nèi)外報道黃體酮陰道環(huán)的藥代動力學的相關(guān)文獻較少，對于黃體酮陰道環(huán)用于輔助生殖的體外釋放量尚無定論。有PCT專利有報道用于治療黃體期缺陷的一體式PGT硅橡膠陰道環(huán)，含PGT 1.8 g，7d平均體外釋放量約為20.7 mg/d，可連續(xù)釋放1周[24]，并對該制劑進行了藥效學研究，結(jié)果顯示，17d內(nèi)陰道環(huán)組的平均孕酮水平CAVG為6.02 ng/ml，雪諾同組CAVG為14.18 ng/ml(90 mg，2次/d)，而陰道環(huán)組活產(chǎn)率高于Crinone凝膠組(60%>25%, n=5)[19]，雪諾同組的血漿水平(7.08 ng/ml, 按1次折算)與本研究中豬體內(nèi)的實驗結(jié)果非常接近，即CAVG為6.626 ng/ml。另一項專利描述了與上述類似的用于輔助生殖的外源性黃體酮硅橡膠陰道環(huán)，體外釋放量分別是5，10，15 mg/d，在血液循環(huán)中濃度為12～15 nmol/L，即3.78～4.73 ng/ml，在進行的臨床研究發(fā)現(xiàn)，與肌注100 mg黃體酮比較，15 mg/d陰道環(huán)組的臨床妊娠率(52.9%)遠高于肌注組(38.9%)，該制劑黃體酮的血漿水平與本研究中的EVA藥環(huán)在豬體內(nèi)的也是接近的，即CAVG為4.892 ng/ml[25]。

由以上文獻結(jié)合本次實驗可以初步推斷出，與黃體酮凝膠相比較，本課題組所制備的黃體酮陰道環(huán)在體內(nèi)血藥濃度更穩(wěn)定，但雪諾同凝膠的平均血藥濃度(CAVG=6.626 ng/ml)高于黃體酮陰道環(huán)(CAVG=4.892 ng/ml)，說明陰道環(huán)的黃體酮釋放量還需要進一步優(yōu)化提高，如要達到與雪諾同相同的血藥濃度，陰道環(huán)體外釋放量可能在20～25 mg/d。接下來需要結(jié)合藥效學進一步驗證。

4 結(jié)論

采用與人結(jié)構(gòu)類似的巴馬小型豬為實驗動物，通過已建立的LC-MS/MS法開展了自制黃體酮陰道環(huán)的體內(nèi)藥代動力學研究，結(jié)果顯示體內(nèi)外相關(guān)性良好，體外建立的方法科學可靠。以雪諾同為參比制劑，自制陰道環(huán)在體外釋放量為18 mg/d，巴馬小型豬體內(nèi)平均血藥濃度為4.892 ng/ml，初步估算黃體酮用于輔助生殖LPS的體外釋放量為20～25 mg/d。本研究對于自制黃體酮陰道環(huán)的處方工藝優(yōu)化及體外釋放劑量確定有重要科學和實踐意義。