王 靜王彥鈞王 悠 鄧天偉 曾瑋瑋 梁華平 王建民 陳東風(fēng) 張 健 陳陽(yáng)美 楊 敏&

陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院消化內(nèi)科1(400042) 戰(zhàn)傷感染與特需藥品研究室4 武器殺傷生物效應(yīng)評(píng)估研究室5 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2 重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院消化內(nèi)科3 空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室6

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder,PTSD)是指突發(fā)性、威脅性或?yàn)?zāi)難性生活事件導(dǎo)致個(gè)體延遲出現(xiàn)和長(zhǎng)期持續(xù)存在的精神障礙[1]。女性創(chuàng)傷暴露率為51.2%，PTSD的終生患病率為10.4%；男性創(chuàng)傷暴露率為60.7%，PTSD的患病率為5%[2]。既往已證實(shí)，在PTSD應(yīng)激和內(nèi)臟傷害性疼痛刺激下，存在廣泛的內(nèi)臟高敏感-痛覺(jué)敏化現(xiàn)象[3]。內(nèi)臟高敏感是功能性胃腸病(functional gastrointestinal disorders,FGIDs)的最重要病理生理學(xué)機(jī)制。全球超過(guò)40%的人群患有FGIDs[4]，現(xiàn)有藥物的治療效果差，患者依從性差，目前尚缺乏阻止PTSD應(yīng)激下內(nèi)臟高敏感-中樞敏化發(fā)展的有效干預(yù)措施。

N-Myc下游調(diào)控基因2(N-Myc downstream-regulated gene 2,NDRG2)是2003年首次被克隆并報(bào)道的一個(gè)新抑癌基因，在不同模型和組織中發(fā)揮著截然不同的作用[5]。有研究表明，在中樞水平上NDRG2對(duì)神經(jīng)病理性疼痛、炎性疼痛、心理社會(huì)應(yīng)激和創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用[5-7]。過(guò)表達(dá)NDRG2可明顯影響谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(glutamate transporter-1,GLT-1)的功能活性，參與內(nèi)臟高敏感-中樞敏化的形成與維持[7]。頭孢曲松(ceftriaxone,CTX)是β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物，可選擇性誘導(dǎo)編碼GLT基因的轉(zhuǎn)錄，從而特異性增加GLT-1表達(dá)，發(fā)揮抗內(nèi)臟傷害性刺激的效應(yīng)[8-9]。目前有關(guān)PTSD狀態(tài)下腸道NDRG2參與內(nèi)臟高敏感-外周敏化的作用鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)制備PTSD動(dòng)物模型，并分析PTSD狀態(tài)下腸道NDRG2對(duì)內(nèi)臟高敏感的作用以及CTX的干預(yù)作用，旨在為PTSD應(yīng)激下相關(guān)內(nèi)臟高敏感的FGIDs臨床診療的研究提供新思路。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)成年Sprague-Dawley(SD)大鼠81只，體質(zhì)量180～200 g；C57BL/6小鼠16只，體質(zhì)量20～25 g；均由陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。NDRG2-/-基因敲除小鼠16只由空軍軍醫(yī)大學(xué)(第四軍醫(yī)大學(xué))基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室張健教授贈(zèng)送，進(jìn)行鑒定后使用[10]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫21～25 ℃的動(dòng)物室，自由進(jìn)食、飲水。飼養(yǎng)箱內(nèi)鋪以柔軟鋸末，以減少動(dòng)物足底刺激。實(shí)驗(yàn)前嚴(yán)格給予12 h/12 h光控時(shí)間，適應(yīng)環(huán)境1周。

二、方法

1.PTSD模型的建立：參照He等[11]的方法誘導(dǎo)PTSD內(nèi)臟高敏感模型。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放入束縛裝置中禁錮2 h；取出后放入高50 cm、直徑20 cm、水深30 cm的水桶中強(qiáng)迫游泳20 min；游泳結(jié)束后休息15 min，再用乙醚將其麻醉至意識(shí)喪失。最后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放回飼養(yǎng)籠，無(wú)干擾喂養(yǎng)7 d，常規(guī)飲食。將SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組，正常大鼠腹腔注射0.9% NaCl溶液200 mg/kg；CTX組，正常大鼠腹腔內(nèi)注射CTX 200 mg/kg(Sigma公司)；PTSD組，PTSD大鼠腹腔注射0.9% NaCl溶液200 mg/kg；PTSD+CTX組：PTSD大鼠建模前后立即予CTX 200 mg/kg腹腔注射；均連續(xù)腹腔注射7 d。將小鼠分為4組：正常對(duì)照組，C57BL/6小鼠不予處理；PTSD組，C57BL/6小鼠建立PTSD模型；NDRG2-/-組，NDRG2-/-基因敲除小鼠不予處理；NDRG2-/-+PTSD組，NDRG2-/-小鼠建立PTSD模型。

2.記錄電極的植入方法：參照He等[3]的研究方法，給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg進(jìn)行麻醉，剃去實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右側(cè)腹股溝和頸部皮膚的毛發(fā)并消毒，切開(kāi)腹股溝韌帶上方處的皮膚，將2根消毒電極的一端埋植于腹外斜肌處，兩電極的間距為0.5～1 cm，針線縫合固定電極。電極另一端經(jīng)皮下隧道牽引至頸部穿出并固定于背部皮膚，術(shù)后1周傷口恢復(fù)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.內(nèi)臟敏感性的測(cè)定：采用結(jié)直腸擴(kuò)張(colorectal distention,CRD)法檢測(cè)動(dòng)物內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)反射(visceromotor reflex,VMR)[12]。造模后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用乙醚吸入麻醉，由肛門(mén)插入前端接有球囊的結(jié)直腸擴(kuò)張導(dǎo)管。氣囊末端距肛門(mén)口約1 cm，導(dǎo)管固定于鼠尾根部，動(dòng)物置于不能轉(zhuǎn)身的透明塑料籠子中。采用泰盟軟件BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄在不同壓力下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹外斜肌肌肉的放電活動(dòng)，壓力梯度分別為10、20、40、60 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，每次20 s，間隔4 min。計(jì)算平均曲線下面積(area under the curve,AUC)以定量腹壁肌電圖(EMG)，并計(jì)算擴(kuò)張期與基線AUC差值，以代表不同擴(kuò)張壓力下CRD誘導(dǎo)的VMR。

4.免疫熒光法：大鼠用戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔麻醉，取結(jié)腸和小腸組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，脫水透明包埋，切片，厚4 μm。切片經(jīng)脫蠟至水，抗原修復(fù)；4.5% BSA封閉15 min，室溫下滴加NDRG2一抗(工作濃度1∶150；英國(guó)Abcam公司)4 ℃過(guò)夜；滴加Alexa 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG(工作濃度1∶150；英國(guó)Abcam公司)37 ℃孵育1 h，PBS漂洗后加入DAPI，在熒光顯微鏡下觀察腸道NDRG2分布和表達(dá)，Image J圖像分析系統(tǒng)測(cè)定NDRG2的相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、NDRG2-/-基因敲除小鼠的內(nèi)臟高敏感改變

CRD壓力為40、60 mm Hg時(shí)，與正常對(duì)照小鼠相比，PTSD小鼠VMR顯著增加(0.213±0.004對(duì)0.199±0.006，P=0.033；0.327±0.005對(duì)0.309±0.005，P=0.021)，NDRG2-/-小鼠VMR顯著降低(0.185±0.002對(duì)0.199±0.006，P=0.023；0.287±0.005對(duì)0.309±0.005，P=0.005)；而壓力為10、20 mm Hg時(shí)，PTSD小鼠和NDRG2-/-小鼠內(nèi)臟敏感性與正常對(duì)照小鼠相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CRD壓力為40、60 mm Hg時(shí)，與PTSD小鼠相比，NDRG2-/-小鼠VMR顯著降低(0.185±0.002對(duì)0.213±0.004，P=0.000；0.287±0.005對(duì)0.327±0.005，P=0.000)；NDRG2-/-+PTSD小鼠VMR顯著降低(0.197±0.004對(duì)0.213±0.004，P=0.015；0.303±0.005對(duì)0.327±0.005，P=0.002；圖1)。

*與正常對(duì)照組比較，P<0.05；#與PTSD組比較，P<0.05

二、PTSD大鼠模型內(nèi)臟敏感性的改變

CRD壓力為40、60 mm Hg時(shí)，與正常對(duì)照大鼠相比，PTSD大鼠VMR顯著增加(0.681±0.022對(duì)0.570±0.024，P=0.003；0.842±0.033對(duì) 0.670±0.016，P<0.001)，CTX組VMR顯著降低(0.483±0.018對(duì)0.570±0.024，P=0.022；0.569±0.021對(duì)0.670±0.016，P=0.012)；而CRD壓力為10、20 mm Hg時(shí)，PTSD組、CTX組與正常對(duì)照大鼠相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。壓力為40、60 mm Hg時(shí)，與PTSD組相比，PTSD+CTX組的VMR顯著降低(0.566±0.035對(duì)0.681±0.022，P=0.003；0.680±0.029對(duì)0.842±0.033，P<0.001；圖2)。

*與正常對(duì)照組比較，P<0.05；#與PTSD組比較，P<0.05

三、各組大鼠腸道NDRG2表達(dá)

免疫熒光分析顯示NDRG2主要分布于腸道上皮細(xì)胞、黏膜下神經(jīng)叢和肌間神經(jīng)叢(圖3、圖4)。與正常對(duì)照組相比，CTX組大鼠結(jié)腸NDRG2表達(dá)顯著降低(93.390±2.411對(duì)105.750±2.306，P=0.001)，PTSD大鼠NDRG2表達(dá)顯著上升(115.127±3.062對(duì)105.750±2.306，P=0.007)。與PTSD組相比，PTSD+CTX大鼠NDRG2表達(dá)顯著降低(98.840±2.082對(duì)115.127±3.062，P<0.001)。

討 論

內(nèi)臟高敏感主要表現(xiàn)為痛覺(jué)過(guò)敏、痛覺(jué)超敏、自發(fā)痛等反應(yīng)性增強(qiáng)或敏化過(guò)程，對(duì)疼痛和不適的閾值明顯降低，呈多部位、彌漫性分布，易被正?；虍惓４碳ひ蜃蛹と?，當(dāng)存在心理壓力和癥狀?lèi)夯瘯r(shí)高敏感性可增強(qiáng)[13-14]。既往研究表明，在PTSD應(yīng)激狀態(tài)下，存在廣泛的內(nèi)臟高敏感-痛覺(jué)敏化現(xiàn)象，如PTSD后FGIDs、跨器官敏化相關(guān)疾病的發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，PTSD應(yīng)激可觸發(fā)或加重FGIDs患者的臨床癥狀[15]。

既往研究[16]表明，在炎癥和氧葡萄糖剝奪/再氧合狀態(tài)下，NDRG2不同片段可從胞質(zhì)移至胞核內(nèi)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變，并在維持腸道穩(wěn)態(tài)、結(jié)腸炎及其相關(guān)腫瘤發(fā)展中起有重要作用。利用NDRG2-/-基因敲除小鼠建立的葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型證明NDRG2在維持腸道穩(wěn)態(tài)和結(jié)腸炎相關(guān)腫瘤的發(fā)展中起有重要作用，推測(cè)腸道NDRG2在PTSD內(nèi)臟高敏感形成中亦發(fā)揮了重要作用[17]。既往有關(guān)PTSD應(yīng)激狀態(tài)下痛覺(jué)敏化/去敏感的研究主要聚焦于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其在腸道水平的分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究結(jié)果顯示，NDRG2-/-基因敲除小鼠對(duì)傷害性?xún)?nèi)臟刺激，即在40 mm Hg、60 mm Hg壓力下行CRD時(shí)內(nèi)臟敏感性顯著降低；同時(shí)NDRG2-/-基因敲除的PTSD小鼠內(nèi)臟敏感性較PTSD小鼠亦顯著降低，提示NDRG2可能參與了PTSD內(nèi)臟高敏感的調(diào)控作用。

NDRG2是1999年首次發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因[18]。該基因編碼一個(gè)由371個(gè)氨基酸組成的大小為40.7 kDa(1 Da=0.992 1 u)的蛋白，具有α/β水解酶催化結(jié)構(gòu)域。Myc通過(guò)與NDRG2基因的核心啟動(dòng)子區(qū)相互作用來(lái)抑制NDRG2的轉(zhuǎn)錄。NDRG2是一種應(yīng)激反應(yīng)基因，在心理社會(huì)應(yīng)激和創(chuàng)傷的應(yīng)激反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用，在細(xì)胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移中亦發(fā)揮作用[19]。Zhang等[16]的研究表明，NDRG2在腸道水平主要表達(dá)于腸神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞，在炎癥刺激和氧葡萄糖剝奪/再氧合暴露狀態(tài)下，NDRG2表達(dá)參與腸道炎癥和缺血/再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制。Shen等[20]的研究結(jié)果表明，NDRG2在腸上皮細(xì)胞中表達(dá)并調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞分化。NDRG2在脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)并參與神經(jīng)痛作用。Cheng等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)痛動(dòng)物模型鞘內(nèi)注射N(xiāo)DRG2-RNAi腺病毒抑制NDRG2表達(dá)后，可明顯緩解脊神經(jīng)結(jié)扎誘發(fā)的機(jī)械和熱超敏反應(yīng)，提示NDRG2在脊髓水平參與了神經(jīng)性疼痛的形成和維持，可能成為一種新穎的治療神經(jīng)痛的靶標(biāo)。然而，NDRG2在腸道水平參與應(yīng)激相關(guān)的內(nèi)臟高敏感的作用和機(jī)制鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究表明，PTSD大鼠模型腸道NDRG2表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高，CTX干預(yù)可明顯下調(diào)PTSD大鼠、正常對(duì)照大鼠腸道NDRG2表達(dá)，同時(shí)CTX干預(yù)后PTSD大鼠的內(nèi)臟敏感性顯著降低。提示CTX干預(yù)可通過(guò)下調(diào)NDRG2表達(dá)發(fā)揮抗內(nèi)臟傷害性刺激的作用。

A：正常對(duì)照組；B：PTSD組；C：CTX組；D：PTSD+CTX組

A：正常對(duì)照組；B：PTSD組；C：CTX組；D：PTSD+CTX組

有研究發(fā)現(xiàn)，NDRG2-/-小鼠表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)亢進(jìn)和細(xì)胞外液谷氨酸增多[21]，NDRG2可通過(guò)GLT-1對(duì)高濃度谷氨酸的攝取來(lái)降低細(xì)胞外液谷氨酸的濃度，提示在PTSD狀態(tài)下NDRG2可能通過(guò)GLT-1和谷氨酸參與內(nèi)臟高敏感的機(jī)制。本研究的前期研究[9]亦證實(shí)在PTSD狀態(tài)下，CTX可通過(guò)選擇性誘導(dǎo)編碼GLT-1基因的轉(zhuǎn)錄而上調(diào)GLT-1的表達(dá)。另有研究表明，NDRG2敲除小鼠中STAT3表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)NDRG2能激活STAT3，而JAK/STAT3與GLT-1功能活性異常有關(guān)[22]。因此，推測(cè)在PTSD內(nèi)臟高敏感狀態(tài)下，CTX干預(yù)不僅可通過(guò)上調(diào)GLT-1表達(dá)發(fā)揮抗內(nèi)臟傷害性刺激的作用，還可通過(guò)抑制NDRG2-JAK/STAT3信號(hào)通路共同發(fā)揮作用，為豐富腸道神經(jīng)系統(tǒng)的腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的NDRG2-JAK/STAT3-GLT-1信號(hào)通路調(diào)控PTSD內(nèi)臟高敏感和外周敏化的理論脈絡(luò)提供了科學(xué)依據(jù)，NDRG2可能是干預(yù)PTSD內(nèi)臟高敏感的新的分子靶標(biāo)。未來(lái)將進(jìn)一步探究NDRG2在中樞水平調(diào)控PTSD內(nèi)臟高敏感的作用及其分子機(jī)制。

總之，本研究表明PTSD狀態(tài)下，NDRG2在腸道水平參與了內(nèi)臟高敏感及其外周敏化的調(diào)控，揭示了CTX通過(guò)下調(diào)NDRG2表達(dá)發(fā)揮抗內(nèi)臟傷害性刺激作用的新機(jī)制，從而為應(yīng)激相關(guān)的內(nèi)臟高敏感的干預(yù)以及FGIDs的臨床診療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。