張 淼，李丹丹，馬 民，金 宇，陳啟庭，殷惠軍

安德魯 · L · 霍普金斯首先提出了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念[1-2]。近年來，中醫(yī)中藥研究也開始與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)等多學(xué)科進(jìn)行融合，對中醫(yī)藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一比較新興的交叉學(xué)科的形成以及推廣應(yīng)用起到了助力的作用[3]。中醫(yī)講究整體論治，而大多數(shù)的中醫(yī)藥制劑成分結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，靶點作用機制尚不清晰。目前，中醫(yī)中藥對疾病的治療大多認(rèn)為是一個復(fù)雜且涉及多靶點、多組分的過程，中醫(yī)藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以對上述中醫(yī)中藥在治療臨床疾病中的有關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)的多靶點復(fù)雜協(xié)同作用進(jìn)行初步的評價及分析，通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫的信息，構(gòu)建、識別以及分析疾病/藥物相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)及其有關(guān)信號通路，這對進(jìn)一步探討和研究傳統(tǒng)醫(yī)藥治療疾病時的具體作用機制有重要意義[4]。冠心病心絞痛的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與、多階段、多因素的復(fù)雜過程，該病的病理機制主要有異常血管狀態(tài)、血栓形成、血液黏度增高、血小板活化及聚集等[5]，氣虛血瘀證是冠心病心絞痛在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)臨床中最常見的一種證候類型，治以益氣活血，此法應(yīng)用廣泛、療效明確[6]。益氣活血常用中藥中，丹參活血化瘀，黃芪益氣補養(yǎng)心氣，川芎行氣活血止痛，三藥合用活血而不耗氣，益氣而不壅滯，在中醫(yī)臨床上作為防治冠心病心絞痛的有效藥物被廣泛配伍使用，但益氣活血類中藥的有效活性組分以及這些組分的效應(yīng)靶點、藥理學(xué)機制目前仍然不明確。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測和分析丹參-黃芪-川芎配伍發(fā)揮治療冠心病心絞痛作用的可能靶點、活性成分以及信號通路，為深入探討丹參-黃芪-川芎改善冠心病心絞痛的分子機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 潛在靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)搜索丹參、黃芪、川芎的靶點及其所有活性成分。設(shè)置丹參、川芎的篩選條件為類藥性(DL)>0.18以及口服利用度(OB)>30%；黃芪的篩選條件為DL>0.18和OB>40%。使用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。

1.2 構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò) Cytoscape 3.7.0軟件具有Merge功能，利用該功能對疾病-藥物共同的靶點進(jìn)行分析。

1.3 構(gòu)建冠心病心絞痛靶點網(wǎng)絡(luò) 以“angina pectoris”為關(guān)鍵詞，分別在DrugBank、TTD(Therapeutic Target Database)和PharmgKb數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，得到疾病靶點，在Uniprot平臺上轉(zhuǎn)換基因蛋白名，對疾病靶點的可視化網(wǎng)絡(luò)采用Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建。

1.4 京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集通路可視化分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫，分析疾病-藥物的共同靶點的KEGG富集途徑。

2 結(jié) 果

2.1 丹參、黃芪、川芎成分潛在靶點網(wǎng)絡(luò) 通過檢索以及對相關(guān)指標(biāo)的設(shè)置，將得到85個藥物效用活性組分進(jìn)行構(gòu)建，獲得包含了243個節(jié)點的丹參-黃芪-川芎的靶點可視化網(wǎng)絡(luò)。用長方形代表靶點，菱形代表成分，丹參的活性組分使用紅色表示，黃芪的活性組分使用黃色表示，川芎的活性組分則使用綠色表示。詳見圖1。

圖1 黃芪-丹參-川芎配伍的成分-潛在靶點網(wǎng)絡(luò)

2.2 冠心病心絞痛靶點網(wǎng)絡(luò) 通過檢索關(guān)鍵詞“angina pectoris”，獲得疾病的直接靶點共有30個，在UniProt平臺將蛋白名轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名，再進(jìn)行構(gòu)建，之后得到可視化網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)，冠心病心絞痛的30個直接靶點具體包括：FGF4、TBXA2R、ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、F10、PDE5A、ADRB3、CPT1B、ITGB3、ITGA2B、SCN3A、KCNA5、SLC29A1、KCNH2、ADRB1、CACNA1H、F8、TBXAS1、SLC9A1、ADRB1、HGF、DRD2、P2RY12、PON1、HCN1、SLC9A3、NOS3、CACNA1C、VEGFD。詳見表1。

圖2 疾病靶點可視化網(wǎng)絡(luò)圖

表1 30個疾病直接靶點

2.3 成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò) 對丹參-黃芪-川芎的 “疾病靶蛋白-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)” 以及 “組分潛在靶點網(wǎng)絡(luò)”進(jìn)行進(jìn)一步的分析，生成 “成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)”圖(見圖3，橢圓表示效用活性組分，菱形則表示靶點)，成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)的靶點有13個，其中包括7個活性成分(分別為 MOL000098、MOL007145、MOL000371、MOL000378、MOL007049、MOL007122、MOL007154)以及6個疾病靶點(分別為 ADRB1、ITGB3、PON1、ADRA2B、ADRA2A、ADRA2C)。

圖3 有效成分靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 KEGG富集通路信息 對13個靶點進(jìn)行富集分析獲得3條信號通路(見表2)，作用于這3條信號通路的活性成分共有11個(見表3)。

表2 共同靶點KEGG富集信息

表3 作用于活化通路靶點的活性成分

3 討 論

整體觀念和辨證論治是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要特點，中藥基于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的以上特點在分子水平上通過多靶點、多組分達(dá)到治療目的。作為中醫(yī)藥與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的交叉學(xué)科，中醫(yī)藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成為一種相對比較新的研究范式，廣泛應(yīng)用于對中藥作用機制的探索、解釋[7]。它可通過生物網(wǎng)絡(luò)以及分子層面對中醫(yī)藥的作用機制進(jìn)行深入的探討，推進(jìn)中醫(yī)藥的科學(xué)化、國際化以及現(xiàn)代化。臨床治療冠心病心絞痛的常用中藥為丹參、黃芪、川芎，三藥合用較單獨使用能協(xié)同增強益氣和活血的功效。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，篩選分析得到85個活性成分以及243個靶點，與冠心病心絞痛的30個直接靶點進(jìn)行相互映射，得到共同靶點13個，再通過對這13個共同靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析，獲得了3條相關(guān)的信號通路，共有11個活性組分可以作用于這3條相關(guān)信號通路。充分體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療疾病的系統(tǒng)性、整體性、多靶點、多途徑、多成分的優(yōu)勢特點，同時發(fā)現(xiàn)，在治療疾病過程中，同一有效成分可以激活不同的信號通路和靶點，不同的有效成分也可以激活同一靶點，從而起到治療作用，這對中醫(yī)治療的異病同治、同病異治的作用機制進(jìn)行了科學(xué)客觀的解釋[8]。

益氣活血類中藥被傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)廣泛應(yīng)用于冠心病心絞痛的防治中。叢敬等[9]研究表明，益氣活血類中藥對冠心病心絞痛病人預(yù)后的改善以及治療效果的提高均有顯著的影響；蔡常青等[10]深入探討了益氣活血中藥治療冠心病心絞痛的具體作用機制，發(fā)現(xiàn)可能與減弱病人血液黏滯度、抑制血栓形成、降低炎性因子的釋放以及對抗血小板聚集等相關(guān)。本研究篩選出丹參-黃芪-川芎配伍治療冠心病心絞痛的關(guān)鍵活性成分有4-亞甲丹參新酮、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇、丹參酮ⅡA、丹參新酮、3，9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、鼠尾草酚酮和槲皮素等。魏星等[11]研究表明，能作用于信號通路的槲皮素(來源于黃芪的有效組分)也具有明顯的改善炎癥反應(yīng)和抑制細(xì)菌的作用。Wang等[12]研究表明，丹參新酮(來源于丹參中的有效組分)也已被證明具有降低炎癥反應(yīng)的作用。

本研究結(jié)果表示，丹參-黃芪-川芎配伍治療冠心病心絞痛的關(guān)鍵靶點主要有ITGB3、ADRA2B、ADRA2C、ADRB1、ADRA2A、PON1。生物功能主要涉及細(xì)胞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡、對雌二醇的反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化等生物學(xué)過程?；騃TGB3(GPⅡb/Ⅲa整合素)為最豐富的血小板特異性糖蛋白，有兩個亞單位異二聚體(αIIB鏈和β3鏈)，影響血栓形成，ITGB3作為配體受體，在血管壁細(xì)胞外基質(zhì)與血小板相互結(jié)合的作用中至關(guān)重要，且能進(jìn)一步促進(jìn)血小板聚集[12]。血小板聚集是血管壁重塑以及形成血栓的關(guān)鍵步驟，在靜止血小板中，αIIbβ3糖蛋白的構(gòu)象不允許配體結(jié)合，血小板的激活會引發(fā)糖蛋白細(xì)胞質(zhì)的部分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使纖維蛋白原受體的結(jié)合部位被暴露，通過與其配體中的精氨酸、門冬氨酸、甘氨酸三肽發(fā)生結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致血小板聚集增加[13]。Kucharska-Newton等[14]研究表明，阿司匹林的低反應(yīng)性可以通過ITGB3 基因rs5918(PlA)單核苷酸的多態(tài)性來進(jìn)行預(yù)測。最常見的血小板多態(tài)性在GPⅢa蛋白(β3鏈)中，與RGD的結(jié)合序列位于同一區(qū)域，稱為PlA1/PlA2多態(tài)性或Leu33Pro多態(tài)性，這種遺傳變異與冠心病心絞痛終點之間的相關(guān)性已經(jīng)受到專家學(xué)者的重視與關(guān)注。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活性成分丹參酮ⅡA、4-亞甲丹參新酮可以直接作用于ITGB3，推測黃芪、丹參可能通過抗血栓功能發(fā)揮其治療作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信號通路、擴張型心肌病、神經(jīng)活性配體-受體相互作用這3條通路可能與丹參-黃芪-川芎改善冠心病心絞痛相關(guān)。苑曉燁等[15]研究提示cGMP-PKG信號通路在抑制血管鈣化、保護(hù)心肌等方面作用效果明確。ADRA2B、ADRA2C、ADRA2A、ADRB1分別是cGMP-PKG信號通路富集的4個靶點。ADRA2A(基因腎上腺素能受體基因)、ADRA2C以及ADRA2B均為G蛋白偶聯(lián)受體的亞家族成員，趙善德[16]研究表明，上述受體與有氧耐力有一定的相關(guān)性，且在調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面起到關(guān)鍵的作用，主要是影響腎上腺素能神經(jīng)元以及交感神經(jīng)相關(guān)遞質(zhì)的釋放。本研究中丹參酮ⅡA的DL以及OB均較高，并且可以直接作用于ADRA2A靶點，故推斷丹參酮ⅡA可能是發(fā)揮治療作用的一個主要組分。蘇梅等[17]研究表明，丹參酮ⅡA可升高血管內(nèi)皮生長因子A(VEGF-A)mRNA水平，促進(jìn)血管生成；可減少誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、白介素-6(IL-6)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)等炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，降低巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)的釋放和生成，從而減輕炎癥反應(yīng)；還能通過調(diào)控細(xì)胞自噬以及凋亡保護(hù)心肌細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，活性組分4-亞甲丹參新酮、丹參新酮、槲皮素、丹參酮ⅡA等能夠直接作用cGMP-PKG通路，說明這些活性成分也可能具有干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡、改善心肌供血、調(diào)控炎性因子表達(dá)等作用。由此可見，丹參-黃芪-川芎可能通過調(diào)控多個通路改善冠心病心絞痛的發(fā)生發(fā)展。

本研究系統(tǒng)地探討了丹參-黃芪-川芎改善冠心病心絞痛的分子機制，整體描述了中藥與疾病的相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)丹參-黃芪-川芎中的槲皮素、丹參酮ⅡA可能是發(fā)揮效用的物質(zhì)基礎(chǔ)，可通過調(diào)控多個靶點、通路發(fā)揮抑制血栓形成、對抗血小板活化、改善脂質(zhì)代謝、減輕炎癥反應(yīng)、減輕冠狀動脈微環(huán)境缺血缺氧狀態(tài)作用，進(jìn)而穩(wěn)定斑塊，從多角度、多層次參與到冠心病心絞痛的療效改善及組織修復(fù)。今后需補充完善相關(guān)的文獻(xiàn)，并設(shè)計相應(yīng)的體內(nèi)或體外實驗，以驗證本研究結(jié)果。

4 小 結(jié)

綜上所述，中醫(yī)藥組方的多靶點、多組分的特點在改善冠心病心絞痛等慢性復(fù)雜疾病方面凸顯出了其獨特的作用優(yōu)勢。藥物的發(fā)現(xiàn)通常是從傳統(tǒng)藥物和臨床常用藥物中獲得啟示以及資源，中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是對中醫(yī)藥中關(guān)鍵活性組分與疾病相關(guān)的靶點在細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)環(huán)境里的作用進(jìn)行科學(xué)的探索分析，可以為科研和臨床工作者更好地了解中藥的協(xié)調(diào)性、整體性以及互補性等特征提供極大的幫助。Kim等[18]的研究表明，了解天然化合物/活性成分與人體代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類似性有助于解釋中藥的作用方式，進(jìn)而提出并解釋了以天然化合物/活性成分為中心的觀點。希望這一鼓舞人心的工作能為中醫(yī)學(xué)研究帶來新的方法和新的見解，也希望中醫(yī)藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠為發(fā)現(xiàn)新的多靶點、多組分的傳統(tǒng)中藥以及聯(lián)合用藥提供更多有益的參考和啟示。