郭寶琴，魏 暢，李 強(qiáng)

( 1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023； 2.鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051 )

鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyprinidherpesvirusⅡ,CyHV-2)，又稱為皰疹造血器官壞死病毒(或金魚造血器官壞死病毒)，屬皰疹病毒目、皰疹病毒科、鯉皰疹病毒屬(Cyprinivirus)。由于是第二個(gè)分離自鯉科魚類的皰疹病毒，該病毒被國際病毒系統(tǒng)分類委員會命名為鯉皰疹病毒Ⅱ型[1-2]。該病毒為雙鏈DNA病毒，無囊膜包被的核衣殼呈六角形或球形，囊膜包被下的病毒粒子成橢圓形，大小為175～200 nm[3]。該病毒在中國、日本、美國、澳大利亞、新西蘭及歐洲一些國家均有報(bào)道，可造成養(yǎng)殖鯽魚(Carassiusauratus)和金魚大量死亡。現(xiàn)階段針對鯉皰疹病毒Ⅱ型的感染尚無有效的防控措施，不能有效地控制該病的暴發(fā)，因此，早診斷、早隔離、早防控是控制該病蔓延的有效手段。筆者基于國內(nèi)外的相關(guān)研究進(jìn)展，就鯉皰疹病毒Ⅱ型的免疫學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測、細(xì)胞培養(yǎng)分離等檢測技術(shù)進(jìn)行了詳細(xì)的分析與梳理，以期為鯉皰疹病毒Ⅱ型的及早診斷及防控提供借鑒和思路。

1 研究機(jī)構(gòu)分布

隨著鯉皰疹病毒Ⅱ型在世界范圍內(nèi)傳播，并對金魚、鯽魚養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，國內(nèi)外研究人員對鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測技術(shù)開展了多方面的研究，以期做到病毒的早診斷、早隔離、早防控。目前國內(nèi)外關(guān)于鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測方法的相關(guān)報(bào)道共有60余篇，國內(nèi)授權(quán)相關(guān)發(fā)明專利10余項(xiàng)。國內(nèi)的研究機(jī)構(gòu)主要有上海海洋大學(xué)、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)、蘇州大學(xué)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、南京師范大學(xué)、西南大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)等(圖1、表1)。世界范圍內(nèi)，除我國外，日本、美國、德國、英國、捷克、法國、波蘭、意大利、澳大利亞以及印度等對鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測方法也進(jìn)行了相關(guān)研究(圖2)。

圖1 國內(nèi)研究鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測技術(shù)研究機(jī)構(gòu)分布(以發(fā)表論文數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì))Fig.1 Distribution of research institutions which have investigated CyHV-2 detection technology in domestic (based on the number of published papers)

表1 國內(nèi)研究鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測技術(shù)研究機(jī)構(gòu)分布(以授權(quán)的發(fā)明專利進(jìn)行統(tǒng)計(jì))

圖2 國內(nèi)外關(guān)于鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測技術(shù)相關(guān)論文發(fā)表統(tǒng)計(jì)Fig.2 Statistics of the number of published papers on CyHV-2 detection technology in the worldwide

2 免疫學(xué)檢測方法

2.1 酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)技術(shù)是利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法，是免疫學(xué)中的經(jīng)典檢測技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單、適用于基層等優(yōu)點(diǎn)。目前，已建立的鯉皰疹病毒Ⅱ型的酶聯(lián)免疫吸附測定檢測技術(shù)主要有兩種：雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測定和間接酶聯(lián)免疫吸附測定。徐曄等[4]以抗ORF90單克隆抗體作為捕獲抗體，酶標(biāo)抗ORF90多克隆抗體為檢測抗體，建立了鯉皰疹病毒Ⅱ型雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測定檢測技術(shù)。該檢測方法具有良好的特異性，與鯉春病毒血癥病毒、流行性造血器官壞死病毒、傳染性造血器官壞死癥病毒、錦鯉皰疹病毒、傳染性胰腺壞死病毒、鮭魚傳染性貧血病毒、草魚出血病病毒等無交叉反應(yīng)；檢測靈敏度高，對40份無臨床癥狀的樣本檢測發(fā)現(xiàn)，夾心酶聯(lián)免疫吸附測定方法的陽性檢出率為45%，而PCR技術(shù)的陽性檢出率僅為37.5%。此外，以抗ORF25單克隆抗體為檢測抗體，以酶標(biāo)羊抗鼠IgG為二抗，建立了鯉皰疹病毒Ⅱ型間接酶聯(lián)免疫吸附測定檢測技術(shù)。利用該技術(shù)對無感染和感染鯉皰疹病毒Ⅱ型銀鯽(Carassiusauratusgibelio)的脾臟、鰓、腎臟的總蛋白進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)鯉皰疹病毒Ⅱ型感染魚的脾臟、鰓和頭腎樣品中，酶聯(lián)免疫吸附測定結(jié)果為陽性(P/N值>2.1)，而未感染鯉皰疹病毒Ⅱ型魚組織檢測為陰性(P/N值<2.1)[5]。

2.2 免疫熒光檢測技術(shù)

3 分子生物學(xué)檢測方法

3.1 普通PCR檢測技術(shù)

3.2 雙重PCR檢測技術(shù)

雙重PCR是指在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過程與普通PCR相同，但更為高效、快捷和準(zhǔn)確。羅丹等[17]針對鯉皰疹病毒Ⅱ型三聯(lián)體蛋白基因的兩段保守序列作為擴(kuò)增靶標(biāo)合成引物，建立了雙重PCR檢測技術(shù)，可特異性擴(kuò)增出218 bp和369 bp兩條目的片段，對鯉皰疹病毒Ⅱ型最低檢測限為3×102拷貝/μL，與基于相同基因而建立的普通PCR檢測技術(shù)(檢測限為2×104拷貝/μL)[14]相比，雙重PCR檢測的靈敏度更高。謝亞君等[18]針對鯉皰疹病毒Ⅱ型解旋酶基因建立的雙重PCR檢測技術(shù)，可特異性擴(kuò)增出800 bp和250 bp兩條目的片段，對鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測限為1.4×104拷貝/μL。對不同地區(qū)采集的54尾異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)組織樣本進(jìn)行鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測，檢出率為72.2%。由此可見，鯉皰疹病毒Ⅱ型三聯(lián)體蛋白基因保守序列更適合作為雙重PCR檢測技術(shù)的擴(kuò)增標(biāo)靶。

3.3 巢式PCR檢測技術(shù)

3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

3.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法是一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，是指針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件保溫30～60 min，完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。目前，已建立的鯉皰疹病毒Ⅱ型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)主要聚焦于病毒基因序列中較為保守的解旋酶基因[32-36]，不同學(xué)者建立的方法、檢測時(shí)間和靈敏度有所不同，其檢測時(shí)間最短可在30 min內(nèi)完成[33-34]，檢測靈敏度最高可達(dá)10-3拷貝/μL[35]。此外，還建立了針對鯉皰疹病毒Ⅱ型末端酶基因、DNA聚合酶基因和三聯(lián)體蛋白基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，經(jīng)驗(yàn)證均具有良好的特異性和靈敏度[18,37-39]。Li等[40]針對鯉皰疹病毒Ⅱ型建立了一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增與橫向流動試紙條相結(jié)合的一種新穎的檢測技術(shù)。該檢測需在64 ℃下反應(yīng)60 min，最低的檢測限為4.93×104拷貝/μL；特異性強(qiáng)，對鯉皰疹病毒Ⅰ型、錦鯉皰疹病毒、傳染性脾腎壞死病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒、對蝦白斑綜合征病毒以及青蟹呼腸孤病毒等多種病毒無交叉反應(yīng)。該方法耗時(shí)相對較長，且靈敏度相對不高，但操作簡單，可實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的現(xiàn)場操作。郝貴杰等[41]也建立了一種結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和核酸橫向測流的檢測方法，經(jīng)驗(yàn)證，此方法對低拷貝病毒樣本、保存條件較差的鯉皰疹病毒Ⅱ型DNA也有良好的檢測效果，對凍融次數(shù)多達(dá)20次的帶毒樣本依然具有100%的檢出率。

3.6 其他分子檢測技術(shù)

Ding等[42]針對鯉皰疹病毒Ⅱ型建立了基于寡核苷酸探針的鯉皰疹病毒Ⅱ型熒光原位雜交(FISH)檢測技術(shù)，此技術(shù)具有良好的特異性，經(jīng)驗(yàn)證在43 ℃時(shí)熒光強(qiáng)度最大，探針質(zhì)量濃度在5 ng/μL時(shí)獲得足夠特異的熒光，但探針質(zhì)量濃度過高(50 ng/μL)，會導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增高而特異性降低。Wang等[43]通過制備鯉皰疹病毒Ⅱ型感染魚樣品的外周血細(xì)胞涂片，建立了原位雜交技術(shù)(ISH)，發(fā)現(xiàn)探針與感染鯉皰疹病毒Ⅱ型的魚樣品相結(jié)合呈藍(lán)色反應(yīng)，而與未感染魚樣品不結(jié)合。Yang等[44]根據(jù)GenBank中公布的鯉皰疹病毒Ⅱ型和鯉春病毒血癥病毒的核苷酸序列信息設(shè)計(jì)引物，建立了可同時(shí)檢測鯉皰疹病毒Ⅱ型和鯉春病毒血癥病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，此方法對兩種病毒的最低檢測限約為88個(gè)拷貝，且具有良好的特異性。齊立斐等[45]以鯉皰疹病毒Ⅱ型基因保守區(qū)域片段為靶序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了一種集核酸快速提取和競爭性互補(bǔ)介導(dǎo)核酸恒溫?cái)U(kuò)增(CAMP)微流控芯片于一體的檢測方法，其對鯉皰疹病毒Ⅱ型最低檢測限為10 拷貝/μL，與鯉皰疹病毒Ⅲ型無特異性擴(kuò)增，特異性良好，對89批次樣本進(jìn)行檢測，檢出率為100%。郝中香等[46-47]分別通過設(shè)計(jì)合成ORF6基因和DNA聚合酶基因特異性引物及TaqMan探針，建立了鯉皰疹病毒Ⅱ型微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)檢測技術(shù)，對鯉皰疹病毒Ⅱ型最低檢測限為3.77拷貝/μL。徐進(jìn)等[48]根據(jù)鯉皰疹病毒Ⅱ型的helicase基因編碼序列設(shè)計(jì)交叉引物，建立了一種交叉引物擴(kuò)增檢測技術(shù)，此技術(shù)對鯉皰疹病毒Ⅱ型具有良好的特異性；最低檢測限為10 拷貝/μL。Wang等[49]針對鯉皰疹病毒Ⅱ型建立了一種基于重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)與側(cè)向流動免疫層析(LFD)技術(shù)相結(jié)合的檢測方法。此方法在38 ℃水浴中反應(yīng)10 min，通過肉眼便可觀察到檢測結(jié)果，對鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測限高達(dá)5 pg，比常規(guī)PCR技術(shù)靈敏度高近百倍，且均不與傳染性皮下及造血組織壞死病毒、對蝦白斑綜合征病毒、草魚出血病病毒、鯉春病毒血癥病毒、錦鯉皰疹病毒等水生病毒發(fā)生反應(yīng)，具有良好的特異性。此外，利用終點(diǎn)PCR技術(shù)和重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增(RAA)技術(shù)對鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測，也表現(xiàn)出良好的特異性和靈敏度[50-53]。

4 細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)

5 展 望

眾所周知，鯉皰疹病毒Ⅱ型為引起金魚和鯽魚造血器官壞死病的病原，此病原給我國鯽魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，針對鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測國內(nèi)外建立了免疫學(xué)檢測技術(shù)、分子生物學(xué)檢測技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)等，這些技術(shù)均具有較好的靈敏度和特異性，但需要昂貴的儀器設(shè)備以及熟練的技能，比較適用于高技能的實(shí)驗(yàn)人員操作，對養(yǎng)殖場等公開場合具有一定的局限性，因此急需建立操作簡單、檢測快速、適用于現(xiàn)場檢測的方法。膠體金免疫層析檢測試紙條(CGIS)是一種具有檢測速度快、穩(wěn)定性好、操作簡單以及用肉眼即可判斷出檢測結(jié)果的檢測方法，其在水生動物多種病原檢測中已表現(xiàn)出良好的優(yōu)越性，但目前仍未有關(guān)于鯉皰疹病毒Ⅱ型膠體金免疫層析試紙條相關(guān)的技術(shù)報(bào)道，下一步本實(shí)驗(yàn)室將致力于鯉皰疹病毒Ⅱ型膠體金免疫層析試紙條的開發(fā)。