王家新，蘇 宏，王衛(wèi)兵，許永忠，郭晨宇，顧小朵，王洪斌

( 1.江蘇海洋大學(xué) 海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222005； 2.江蘇省徐州市水族展覽館，江蘇 徐州 221006； 3.江蘇省宿遷市大江飼料有限公司，江蘇 宿遷 223900 )

已有研究表明，海水小球藻(Chlorellapacifica)中的生物活性成分包括多酚類、多肽、多糖等。海藻多糖具有極高的營養(yǎng)價(jià)值，并且能提高機(jī)體免疫力，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織已將其列入21世紀(jì)健康食品名單[1-4]。海藻多糖除了傳統(tǒng)的應(yīng)用價(jià)值以外，還具有多種生物活性及醫(yī)用價(jià)值，如抗病毒、抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、抗菌抗炎、金屬離子絡(luò)合作用、增強(qiáng)生物體的免疫活性等；有研究表明，海藻多糖可以通過對機(jī)體的免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮這些作用[5-6]。海水小球藻取材方便，易培養(yǎng)，因此海水小球藻的研究開發(fā)近年來備受關(guān)注。

日本蟳(Charybdisjaponica)屬節(jié)肢動物門、甲殼綱，廣泛分布于我國各個海域。日本蟳生長快、移動性小、成活率高，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是重要的海產(chǎn)養(yǎng)殖蟹類[7]。日本蟳肉質(zhì)中含量最高的氨基酸為谷氨酸，另外天冬氨酸、精氨酸、亮氨酸含量也比較高，而半胱氨酸和甲硫氨酸含量較少；其中有9種氨基酸是必需氨基酸，占總氨基酸的37%[8]。水生甲殼類動物的血清中免疫活性酶活性是評價(jià)機(jī)體免疫系統(tǒng)狀態(tài)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)，血清中的溶菌酶活性升高，其免疫力也會提高[9]。溶菌酶能夠溶解革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，而在水產(chǎn)養(yǎng)殖中引起嚴(yán)重疾病的病原菌大多屬于革蘭氏陰性菌，因此溶菌酶可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖生物病害防治，同時能夠減少化學(xué)藥品對水環(huán)境的污染[9]。筆者自海水小球藻中提取粗多糖，研究其對日本蟳部分免疫活性酶(超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和溶菌酶)活性的影響，旨在開發(fā)海洋微藻潛在應(yīng)用價(jià)值及探索其在水生動物免疫機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海水小球藻由江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院藻類生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；試驗(yàn)用海水采自連云港海域[鹽度(28.00±1)]，過濾后于121 ℃滅菌20 min，備用；健康日本蟳于2019年5月取自連云港市水產(chǎn)品批發(fā)市場，個體規(guī)格均勻(約150 g)，活力強(qiáng)，暫養(yǎng)于0.6 m×0.4 m×0.3 m玻璃水族箱中，室溫 24 h通氣；試驗(yàn)用超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和溶菌酶活性檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；其他化學(xué)試劑均為分析純；海水小球藻培養(yǎng)液采用f/2培養(yǎng)液。

主要儀器：智能光照培養(yǎng)箱(ZGX-300C)、紫外可見分光光度計(jì)(T6新世紀(jì))、全波長酶標(biāo)儀(Synergy HT)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 海水小球藻的培養(yǎng)及多糖提取

無菌條件下，將活化的海水小球藻按1∶10接種至盛有3000 mL滅菌f/2海水營養(yǎng)鹽溶液的滅菌錐形瓶中，光照培養(yǎng)[光照度3000 lx，光暗比12 h∶12 h，溫度(23±1) ℃]。每日定時搖瓶3次，搖瓶時可隨機(jī)調(diào)整錐形瓶的放置位置，以減少誤差[10]。

1.2.2 海水小球藻生長量的測定

每一批次的海水小球藻中，隨機(jī)選擇一瓶作為監(jiān)測樣品，從接種之日開始，每隔24 h，混勻樣液后從樣品中取3 mL藻液移入比色皿中，以該批次的滅菌海水營養(yǎng)鹽溶液作為空白對照，測定其在680 nm的光密度(D680)。

1.2.3 海水小球藻粗制多糖提取

熱水浸提法并經(jīng)乙醇沉淀得到多糖，將醇沉完的溶液8000 r/min(離心半徑8.0 cm)離心20 min，棄上清液，沉淀連同移液管一起放入干燥箱中烘干6 h。采用蒽酮比色法測定多糖含量[11-13]。

1.2.4 日本蟳血清取樣[14]

選擇健康、規(guī)格均勻的日本蟳，設(shè)試驗(yàn)組和對照組(每組6只，雌雄各半)。試驗(yàn)組每只日本蟳用無菌微量注射器從第三步足基部向腹腔注入200 μL海水小球藻多糖溶液，生理鹽水對照組6只按同樣方法注射等量生理鹽水，無注射對照組6只則不注射任何物質(zhì)。每組設(shè)置3個平行。

注射后的日本蟳在5、24、48、72、96 h(3組每時間點(diǎn)每平行隨機(jī)取1只日本蟳)分別用無菌藍(lán)芯注射器自第三步足基部采血300 μL,置于1.5 mL無菌Eppendorf離心管中(加EDTA抗凝劑500 μL),混勻，4 ℃冰箱保存24 h，將血漿于4 ℃、8000 r/min(離心半徑8.0 cm)離心10 min，去沉淀，上層血清保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.5 日本蟳血清中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、溶菌酶活性測定

黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定超氧化物歧化酶活性；磷酸銨法測定過氧化氫酶活性；比濁法測定溶菌酶活性。具體操作方法根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行成組t檢驗(yàn)分析，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，設(shè)差異顯著性水平為0.05，各組間差異顯著(P>0.05)用不同字母表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 海水小球藻的生長狀況及粗多糖提取

取5 mL保藏藻液接種至150 mL滅菌海水f/2營養(yǎng)鹽中，每隔24 h取3 mL混勻藻液測D680，得到海水小球藻生長曲線(圖1)。海水小球藻藻體量自第2天起呈快速上升趨勢，活性很強(qiáng)。蒽酮法測定提取的粗多糖含量，多糖含量為58.99%。

圖1 海水小球藻生長曲線Fig.1 Growth curve of green alga C. pacifica

2.2 粗多糖對日本蟳血清中免疫活性酶的影響

2.2.1 粗多糖對超氧化物歧化酶活性的影響

試驗(yàn)組注射海水小球藻多糖后的日本蟳血清中，超氧化物歧化酶在24 h時出現(xiàn)上升趨勢，注射后48 h即高于生理鹽水組21.8%和未注射組23.1%，與2個對照組相比均差異顯著(P<0.05)，而生理鹽水組與未注射組差異不顯著(P>0.05)；72 h達(dá)最高點(diǎn)，比生理鹽水組高43.3%，比未注射組高45.2%，與2個對照組相比，差異性均極顯著(P<0.01)，同樣，生理鹽水組與未注射組差異不顯著(P>0.05)；72 h后超氧化物歧化酶活性迅速下降，到96 h恢復(fù)至對照組水平，72 h后3組無顯著差異(圖2)。24 h生理鹽水組與未注射組相比超氧化物歧化酶的活性有小幅升高，其他無變化。

圖2 海水小球藻多糖對日本蟳超氧化物歧化酶活性的影響Fig.2 Influence of green alga C. pacifica polysaccharides on the SOD activity in Japanese stone crab C. japonica

2.2.2 粗多糖對過氧化氫酶活性的影響

試驗(yàn)組注射海水小球藻多糖后的日本蟳血清中，過氧化氫酶在5 h時出現(xiàn)上升趨勢，24 h即有明顯升高，分別高于生理鹽水組和未注射組76.6%、77.4%，與2個對照組相比均差異極顯著(P<0.01)，而生理鹽水組與未注射組無顯著性差異(P>0.05)；48 h達(dá)到最高，比注射生理鹽水的對照組高79.3%，比未注射的對照組高80.8%，與2個對照組相比，均差異極顯著(P<0.01)，而生理鹽水組與未注射組無顯著性差異(P>0.05)；48 h后過氧化氫酶活性開始下降，72 h仍明顯高于2個對照組，具有極顯著性差異(P<0.01)，96 h恢復(fù)至對照組水平(圖3)。24、48 h和72 h的結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與2個對照組相比差異極顯著，注射多糖的日本蟳過氧化氫酶活性有顯著增強(qiáng)，具有強(qiáng)烈應(yīng)答。

圖3 海水小球藻多糖對日本蟳過氧化氫酶活性的影響Fig.3 Influence of green alga C. pacifica polysaccharides on the CAT activity in Japanese stone crab C. japonica

2.2.3 粗多糖對溶菌酶活性的影響

試驗(yàn)組注射海水小球藻多糖后的日本蟳血清中，溶菌酶活性自5 h出現(xiàn)明顯升高，但與對照組差異不顯著(P>0.05)；24 h比生理鹽水組及未注射組分別高28.8%、29.1%，與生理鹽水組相比差異不顯著(P>0.05)，但與未注射組相比具顯著性差異(P<0.05)，生理鹽水組比未注射組略有升高，但無顯著性差異(P>0.05)；直至48 h達(dá)到最高，比生理鹽水組及未注射組分別高42.1%、46.1%，與2個對照組相比均差異極顯著(P<0.01)；48 h后溶菌酶活性開始下降，但仍明顯高于2個對照組，96 h恢復(fù)至對照組水平(圖4)。48 h的結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與2個對照組相比差異極顯著，注射多糖的日本蟳溶菌酶活性有明顯增強(qiáng)，表明海水小球藻多糖能夠激活日本蟳的免疫系統(tǒng)，使之產(chǎn)生強(qiáng)烈生理應(yīng)答。

圖4 海水小球藻多糖對日本蟳溶菌酶活性的影響Fig.4 Influence of green alga C. pacifica polysaccharides on the LZM activity in Japanese stone crab C. japonica

3 討 論

3.1 日本蟳的非特異性免疫

研究證實(shí)，多糖對甲殼動物具有免疫調(diào)節(jié)作用，甲殼動物循環(huán)血細(xì)胞具有吞噬和包囊入侵異物的作用。如凝集素和酚氧化物酶原激活系統(tǒng)能對入侵的細(xì)菌、真菌表面脂多糖或真菌細(xì)胞壁成分1,3-β-D-葡聚糖進(jìn)行識別結(jié)合，促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬[15-16]。楊福剛等[17]報(bào)道，凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)免疫系統(tǒng)中存在著識別β-葡聚糖的結(jié)合蛋白，當(dāng)兩者相結(jié)合時，結(jié)合物可與顆粒細(xì)胞膜的受體相結(jié)合，從而激活免疫系統(tǒng)。甲殼動物屬于無脊椎動物中的一個大類，并且其中很多都是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的養(yǎng)殖種類，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖甲殼動物的病蟲害防治成為一項(xiàng)艱巨而重要的任務(wù)。傳統(tǒng)的水生養(yǎng)殖動物病害防治主要依靠抗生素及化學(xué)藥物，不但污染水源，而且長時間使用抗生素及化學(xué)藥物還會使水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的體內(nèi)蓄積大量有害物質(zhì)，通過食物鏈進(jìn)入人體從而威脅人類健康[18]。因此，對甲殼動物免疫力的研究，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物自身的免疫活性就成為一個重要的研究方向。

3.2 海水小球藻多糖對日本蟳抗氧化酶活性的增強(qiáng)效果

超氧化物歧化酶的活性與生物的免疫水平密切相關(guān)，對于增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的防御能力和整個機(jī)體的免疫功能有重大作用。當(dāng)酶活性較低時，生物體內(nèi)活性氧量過多，勢必會擾亂、破壞一些體內(nèi)重要的生物分子，導(dǎo)致代謝紊亂，生理功能失調(diào)，體內(nèi)免疫水平下降，潛在的病原被激活，使機(jī)體發(fā)病[19]。劉恒等[20]報(bào)道，用添加免疫多糖的飼料投喂凡納濱對蝦后，凡納濱對蝦肌肉中免疫酶的活性有一定的提高，表明口服多糖可以提高凡納濱對蝦的免疫力，而免疫水平的提高又會增強(qiáng)對蝦肌肉等部位的活力。過氧化氫酶主要生理作用就是將體內(nèi)代謝物H2O2催化分解為H2O和O2。劉樹青等[21]發(fā)現(xiàn)，對中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)注射免疫多糖后，血清中的過氧化氫酶活性比對照組明顯增高，表明通過提高動物血液中抗氧化酶活性，可以減少自由基對正常細(xì)胞的損傷，清除細(xì)胞生理代謝過程中產(chǎn)生的活性氧，從而提高機(jī)體的解毒免疫功能和防病抗病能力，因此認(rèn)為抗氧化酶的活性也可作為一項(xiàng)免疫指標(biāo)來衡量對蝦機(jī)體免疫機(jī)能。本試驗(yàn)設(shè)置了兩組對照試驗(yàn)，一組是注射等量生理鹽水的日本蟳，一組是未注射的日本蟳。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在注射海水小球藻粗多糖后，日本蟳的抗氧化酶的活性均有不同程度的提高，并且與對照組差異顯著。注射生理鹽水的日本蟳血清中抗氧化酶比較穩(wěn)定，在24 h后與未注射的對照組相比略有升高，其他時間無變化。說明海水小球藻多糖對日本蟳具有較強(qiáng)烈誘導(dǎo)免疫應(yīng)答作用。其中過氧化氫酶活性72 h后有明顯降低，但與對照組相比，其活性仍保持在一個較高水平上，并具有顯著性差異，與賈超艷[22]的試驗(yàn)結(jié)果有一定的差異，經(jīng)分析認(rèn)為，這可能與日本蟳的產(chǎn)地和養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān)，并且二者給日本蟳注射多糖的種類和劑量也有所不同，使得日本蟳的免疫反應(yīng)有差異。

3.3 海水小球藻多糖對日本蟳溶菌酶活性的增強(qiáng)效果

溶菌酶在多種動物的血液和血細(xì)胞中均廣泛存在，是非特異性免疫因子的主要成分，在免疫活動中發(fā)揮著重要作用。溶菌酶主要?dú)绲氖歉锾m氏陽性菌，能夠水解細(xì)菌細(xì)胞壁β-1,4糖苷鍵，從而使細(xì)菌的細(xì)胞壁破損，細(xì)胞崩解，而且溶菌酶還是吞噬細(xì)胞殺菌的物質(zhì)基礎(chǔ)[23]。王雷等[24]研究發(fā)現(xiàn)，正常中國明對蝦的血淋巴中溶菌酶活性較高，而在瀕死中國明對蝦血淋巴中未檢測到溶菌酶，說明溶菌酶活性也可以作為檢測對蝦機(jī)體免疫功能狀態(tài)的指標(biāo)之一。劉樹青等[25]報(bào)道，日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)經(jīng)注射1%海藻多糖和1%北蟲草多糖后，血淋巴中的溶菌酶活性大大增加。本試驗(yàn)結(jié)果表明，注射海水小球藻多糖后，日本蟳血清溶菌酶活性的變化最為明顯，升高較快，注射后5 h就出現(xiàn)明顯的升高，但與對照組差異不顯著；24 h接近最高值，并且能在較長時間里保持一個較高的水平，與生理鹽水組相比差異不顯著，但與未注射組差異顯著；注射后48 h溶菌酶活性達(dá)到最高，分別高于生理鹽水組和未注射組42.1%和46.1%。

4 結(jié) 論

給日本蟳進(jìn)行人工注射海水小球藻粗多糖能夠刺激其免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答，一定時間內(nèi)能提高其免疫酶活性，增強(qiáng)其免疫力。若在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，將海水小球藻粗多糖添加于甲殼動物養(yǎng)殖飼料中，結(jié)合動物口服途徑，將對病害防治和水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖以及發(fā)展綠色水產(chǎn)品等都具有深遠(yuǎn)的意義。本試驗(yàn)提取粗多糖，經(jīng)測定其中多糖含量為58.99%。本試驗(yàn)未涉及粗多糖中其他成分和養(yǎng)殖海水中其他環(huán)境因子對酶活性的影響。