張婧怡，姜仁平，孟祥龍，黃 成，劉茂松

( 1.南京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023； 2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017 )

互花米草(Spartinaalterniflora)原產(chǎn)于美洲大西洋西海岸以及墨西哥灣[1]，20世紀(jì)引入我國后迅速蔓延，目前已成為我國海岸灘涂濕地生態(tài)系統(tǒng)最主要的外來入侵植物[2]。植物群落凈第一性生產(chǎn)力的大部分是以凋落物的形式流入土壤并進(jìn)入食物鏈[3]?！董h(huán)境再生設(shè)計》[4]一書中曾推薦“鏨式犁耕作”技術(shù)，即將植物殘體埋入土中，作為一項對擾動后的土壤進(jìn)行恢復(fù)的有效技術(shù)。但互花米草凋落物殘體大量輸入土壤中，對底棲動物和濕地生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)均有很大影響。

為探究鹽城濱海灘涂上凋落物流入土壤對底棲動物的影響，以及適當(dāng)干預(yù)后的響應(yīng)，設(shè)計了本次試驗。前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)為鹽城濱海灘涂淡水潮溝及兩側(cè)潮坪上常見的優(yōu)勢底棲動物之一[5]，該物種原本也是外來物種，但是經(jīng)過多年繁育養(yǎng)殖，已成為我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物，故而本試驗選擇克氏原螯蝦幼苗作為底棲動物的考察目標(biāo)。EM菌(Effective Microorganisms)是一種常見且成熟的混合菌劑，能處理水體中有害廢物，同時被動物攝入后可以增強動物免疫力，有利于動物生長和提高動物飼料轉(zhuǎn)化率等[6]。筆者以EM菌作為改良底質(zhì)的功能菌群，對比在4種不同基質(zhì)下克氏原螯蝦幼苗的存活和生長情況，以及不同土壤基底中微生物群落結(jié)構(gòu)[7]、土壤有機(jī)碳和總氮含量的差異，旨在探究增強克氏原螯蝦對凋落物土壤混合基質(zhì)的適應(yīng)性措施，為其在沿海灘涂養(yǎng)殖的推廣提供技術(shù)支持。

試驗采樣地為列入《世界遺產(chǎn)名錄》中的中國黃(渤)海候鳥棲息地，同樣也是全球第二塊潮間帶濕地遺產(chǎn)、江蘇省首項自然遺產(chǎn)，該研究將對鹽城濱海灘涂濕地生態(tài)系統(tǒng)的功能提升及適應(yīng)性管理有一定的實踐應(yīng)用意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗樣地位于江蘇鹽城濱海濕地(N 32°34′～34°28′、E 119°48′～120°56′)，用采泥器收集江蘇鹽城灘涂淤泥，帶回后干燥處理；收集互花米草凋落物，帶回后晾干脫水并打碎；EM菌原液(光合細(xì)菌、乳酸菌、酵母菌等多種高效活性菌)由愛睦樂環(huán)保生物技術(shù)(南京)有限公司提供。

克氏原螯蝦幼苗，體長(2.2±0.2) cm，體質(zhì)量(600±100) mg，采自鹽城灘涂潮溝咸淡水區(qū)域。試驗水體采用充分曝氣的自來水, 水溫約25 ℃。飼養(yǎng)容器為高8 cm、直徑8 cm的圓柱形透明塑料盒(圖1)。

圖1 飼養(yǎng)盒示意Fig.1 Schematic diagram of a feeding box

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)基底制備

清水基底：容器中加入100 mL水，此為清水組；

泥土基底：容器中添加1 cm的干燥土，加水保持100 mL上清液，此為泥土組；

互花米草基底：互花米草和干燥土按1∶24的質(zhì)量比例均勻混合制成混合土。容器中添加1 cm厚的混合土，加水保持100 mL上清液，此為草泥組；

EM菌+互花米草基底：參照說明書，將EM菌液100 mL、水1000 mL、紅糖100 g混合，恒溫22 ℃置搖床間歇搖晃，培養(yǎng)10 d后制成發(fā)酵液，發(fā)酵液按1 mL∶1000 mL稀釋1000倍。容器中添加1 cm厚的上述混合土，并加入稀釋后的發(fā)酵液充分浸潤，然后加水，保持100 mL上清液，此為EM組；

每組基底常溫下靜置3 d后投入克氏原螯蝦幼苗。

1.2.2 分組、飼養(yǎng)與測定數(shù)據(jù)

試驗分4組，每組30個平行。每盒放置1只克氏原螯蝦幼苗。投喂餌料為江蘇省淡水水產(chǎn)研究所配制的克氏原螯蝦專用餌料，蛋白水平35%，隔2 d投喂1粒，每粒40 mg，殘餌不除。室溫飼養(yǎng)持續(xù)30 d后，統(tǒng)計克氏原螯蝦幼苗存活率及體長(L)和體質(zhì)量(m)生長指標(biāo)，對體長和體質(zhì)量的關(guān)系進(jìn)行擬合，計算肥滿度(CF=m/L3)。肥滿度又稱豐滿系數(shù)，是體長和體質(zhì)量關(guān)系的另一種表達(dá)式，可衡量克氏原螯蝦的肥瘦程度[8]。

試驗結(jié)束后采用16S rDNA法來測定基底土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)、采用重鉻酸鉀容量法—外加熱法測定土壤總有機(jī)碳(TOC)、采用半微量凱式法測定總氮(TN)[9]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 26.0統(tǒng)計分析，采用卡方檢驗對存活率等數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗，采用單因子方差分析對體長增長量和體質(zhì)量增加量等數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 存活率比較

根據(jù)各組存活率及卡方檢驗結(jié)果(表1)得出，相較于只有互花米草底泥的草泥組，經(jīng)EM菌活化底泥后的EM組克氏原螯蝦幼苗的存活率顯著提高，與清水組和泥土組無顯著差異。該結(jié)果表明底泥中混入互花米草凋落物對克氏原螯蝦幼苗的存活有顯著抑制作用，經(jīng)EM菌活化后能抵消這一抑制。

表1 各組存活率及顯著性檢驗

2.2 體長、體質(zhì)量的比較

試驗結(jié)束后，克氏原螯蝦的體長排序為EM組>草泥組>泥土組>清水組(圖2)。EM組的克氏原螯蝦幼苗平均體長最大，平均增長量顯著高于其他3組，而其他3組間的平均增長量無顯著差異(表2)。試驗結(jié)果表明，經(jīng)EM菌活化后的互花米草底泥對克氏原螯蝦幼苗的體長有顯著促進(jìn)效果。

試驗結(jié)束后，體質(zhì)量分布規(guī)律與體長一致，即分布排序為EM組>草泥組>泥土組>清水組(圖2)。EM組的克氏原螯蝦幼苗平均體質(zhì)量最大，平均增加量顯著高于泥土組和清水組，與草泥組之間差異不顯著(表2)。草泥組雖稍高于泥土組和清水組，但差異不顯著。清水組和泥土組差異不顯著。

圖2 各組終末體長及終末體質(zhì)量的分布Fig.2 Distribution of final body length and body mass in each group

表2 各組終末平均體長和體長增長量、平均體質(zhì)量和質(zhì)量增加量及顯著性檢驗

2.3 體長和體質(zhì)量的關(guān)系

2.3.1 體長與體質(zhì)量關(guān)系式

體長與體質(zhì)量關(guān)系式一般用冪函數(shù)m=aLb表示。將各組克氏原螯蝦幼苗體長和體質(zhì)量關(guān)系進(jìn)行擬合，得出各組體長—體質(zhì)量冪函數(shù)關(guān)系式如下：

清水組：m=5.8361×L1.5222(r2=0.8439)

泥土組：m=4.7033×L1.5834(r2=0.7506)

草泥組：m=1.3536×L1.9796(r2=0.8681)

EM組：m=1.0555×L2.0473(r2=0.7541)

Paulyt-檢驗法檢驗結(jié)果表明，各組b值均小于3，均與3存在顯著差異，說明各組體長和體質(zhì)量的生長不對等，均為異速生長類型。

2.3.2 肥滿度比較

肥滿度計算結(jié)果見圖3，肥滿度為清水組>草泥組>泥土組>EM組。EM組肥滿度顯著低于清水組，與其他2組差異顯著；草泥組與其他3組均差異不顯著(表3)。

圖3 各組肥滿度分布Fig.3 The distribution of condition factor in each group

表3 各組肥滿度及顯著性檢驗

2.4 底泥土壤性質(zhì)比較

2.4.1 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較

選擇物種豐度>1%的優(yōu)勢門，作相對豐度分布柱狀圖(圖4)。各組土壤基質(zhì)中細(xì)菌主要包括變形菌門、浮霉菌門、放線菌門、擬桿菌門及厚壁菌門，各組主要優(yōu)勢門占比略有差異。屬水平上的細(xì)菌類群比較及卡方檢驗見表4，結(jié)果表明，在已命名的10個屬中，相較于泥土組，互花米草組有3個屬的菌群與其差異顯著，EM菌組有4個屬與其差異顯著，而互花米草和EM菌組之間也有1個屬的菌群差異顯著。結(jié)合門水平物種分布及屬水平顯著性檢驗結(jié)果可知，在土壤中加入互花米草和加入添加EM菌的互花米草均會改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

2.4.2 EM組與草泥組的有機(jī)碳及總氮的比較

土壤有機(jī)碳和總氮結(jié)果見表5，EM組有機(jī)碳和總氮含量顯著低于草泥組。該結(jié)果表明，草泥組因互花米草腐解導(dǎo)致元素富集，從而積累了更多碳和氮。而EM組各指標(biāo)含量較低，證明EM菌能加快互花米草的分解速度，釋放出更多的碳源和氮源供克氏原螯蝦幼苗生長所需。

圖4 各組土壤樣品在門分類水平上細(xì)菌類群比較Fig.4 Comparison of bacterial communities in soil samples in different groups at phylum level

3 討 論

3.1 互花米草凋落物腐解對克氏原螯蝦幼苗生存的影響

互花米草直接混入底泥的草泥組克氏原螯蝦存活率顯著低于其他3組，說明隨著時間的延長，互花米草枯落物在底泥中慢慢腐解，造成土壤基質(zhì)中缺氧，土壤生存環(huán)境嚴(yán)重惡化，導(dǎo)致克氏原螯蝦無法存活。這與葉春等[10]的研究結(jié)果植物腐爛分解會營造厭氧環(huán)境，引發(fā)缺氧，及陳婷等[11]克氏原螯蝦不喜歡污水的環(huán)境，幼蝦甚至能被毒死的結(jié)論一致。本試驗結(jié)果表明，底泥中混入互花米草凋落物不利于克氏原螯蝦幼苗的存活，需要適當(dāng)干預(yù)來改善其適應(yīng)能力。

表5 草泥組和EM組土壤總有機(jī)碳、總氮的比較及顯著性檢驗

Moriarty[12]發(fā)現(xiàn)，在斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)的養(yǎng)殖池中施用芽孢桿菌(Bacillus)后，斑節(jié)對蝦成活率提高。本試驗嘗試添加EM菌來改善土壤環(huán)境，EM菌能加快植物秸稈的發(fā)酵，改良土壤[13]，還能凈化養(yǎng)殖水體[14]。添加EM菌后克氏原螯蝦幼苗存活率顯著高于草泥組，與清水組和泥土組無顯著差異，證明EM菌改善了互花米草在底泥中腐解造成的生境惡化現(xiàn)象，提高了蝦苗存活率。

3.2 互花米草的流入對克氏原螯蝦幼苗生長的影響

3.2.1 添加EM菌后對克氏原螯蝦幼苗生長的促進(jìn)

Wang[15]發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)飼料中添加光合細(xì)菌和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)能促進(jìn)其生長。本試驗中，嘗試添加EM菌，結(jié)果表明，添加EM菌后的互花米草組克氏原螯蝦終末體長和體質(zhì)量均高于其他3組，體長增長量顯著高于其他3組，體質(zhì)量增加量顯著高于清水組和泥土組，與草泥組無顯著差異。該結(jié)果表明，EM菌組克氏原螯蝦的生長速度快于其他3組。這說明添加EM菌后不僅改善了惡化的環(huán)境，還加快了互花米草的分解過程，釋放出更多養(yǎng)分到土壤系統(tǒng)中，再經(jīng)食物鏈傳遞給消費者，克氏原螯蝦幼苗通過攝食提高了自身的體質(zhì)量。

3.2.2 單一互花米草底泥對克氏原螯蝦幼苗生長的影響

由各組體長和體質(zhì)量比較結(jié)果可知，單一互花米草底泥中的克氏原螯蝦幼苗體長和體質(zhì)量均高于清水組和泥土組，與EM組無顯著差異，而EM組的克氏原螯蝦幼苗已有顯著的增長，所以一定程度上證明了互花米草底泥中存活者體質(zhì)量的增長速度快于清水組和泥土組。這說明互花米草凋落物提供的高生產(chǎn)力直接增加了食物來源，進(jìn)而通過營養(yǎng)級聯(lián)作用在次級代謝過程中支撐了底棲動物。雖然互花米草凋落物在底泥中因腐解自身流失了部分養(yǎng)分，但依然能為克氏原螯蝦幼苗提供營養(yǎng)支持?；セ撞輰俣嗄晟鶦4草本植物，其凋落物作為食物鏈中基礎(chǔ)食物資源，能夠提升底泥對克氏原螯蝦幼苗的支持能力，這也側(cè)面證明了它的生態(tài)利用價值。

克氏原螯蝦幼苗的體長和體質(zhì)量關(guān)系符合m=aLb規(guī)律，且相關(guān)性較高[16]。而本試驗4組間生長模式均為異速生長，不符合等速生長模式；肥滿度比較中，EM組顯著最低，其次為草泥組。以上結(jié)果均反映EM組體長發(fā)育較快。而克氏原螯蝦幼苗在生長階段會優(yōu)先體長的生長，是其逃避捕食的重要生態(tài)適應(yīng)[17]，這說明添加EM菌的底泥中的克氏原螯蝦幼苗生存能力更強。

3.3 互花米草的流入對底泥土壤的影響

Gunther等[18]發(fā)現(xiàn)，在羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)飼料中添加芽孢桿菌不僅可促進(jìn)其生長，還可降低其死亡率。由各組微生物菌群比較結(jié)果可見，泥土組與草泥組、EM組之間菌群結(jié)構(gòu)存在差異，草泥組和EM組有更豐富的微生物菌群，能促進(jìn)克氏原螯蝦幼苗的生長。而草泥組和EM組之間也有1個屬的菌群占比差異顯著，通過進(jìn)一步測量草泥組和EM組中底泥的土壤有機(jī)碳和總氮含量發(fā)現(xiàn)，EM組土壤有機(jī)碳、總氮含量顯著偏低。土壤有機(jī)碳主要來源于植物凋落物、土壤腐殖質(zhì)等，且受總氮等多種環(huán)境因素的影響[19]。高建華等[20]認(rèn)為，互花米草群落地上生物量和植被蓋度最高，生成凋落物較多，植物凋落物分解緩慢，土壤有機(jī)碳大量積累使土壤有機(jī)碳含量最高。通常認(rèn)為凋落物的分解速率與氮含量呈正相關(guān)。這也證明了在底泥中加入EM菌后能加快互花米草的分解速度，釋放更多的碳源和氮源。土壤氮元素和碳元素作為生態(tài)系統(tǒng)中最主要的生源要素[21]，能為克氏原螯蝦提供更多生物支撐，從而促進(jìn)其生長。EM菌的加入進(jìn)一步改變了底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤理化性質(zhì)，而且EM菌能加快互花米草在底泥中的分解，改善了腐解造成的生境惡化現(xiàn)象。說明EM菌作為功能性菌群能保持各種菌間的協(xié)同作用，效果顯著。

朱麗葉等[22]研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌劑對水產(chǎn)動物生長的促進(jìn)作用可以從多個方面進(jìn)行探究，如細(xì)菌的代謝產(chǎn)物富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)入消化道后生長繁殖，促進(jìn)動物胃腸道消化酶分泌，同時自身分泌消化酶促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收等。鑒于本試驗中互花米草凋落物及其腐解產(chǎn)生的累積效應(yīng)，未來筆者將探索更加有效的微生物制劑，使其既能促進(jìn)底棲動物的生長情況，又能改善互花米草生長區(qū)底棲動物的生存環(huán)境，從而進(jìn)一步提高生境土壤的競爭力，增加互花米草的生態(tài)利用價值，以用代治。

4 結(jié) 論

互花米草有較高的生產(chǎn)力，而且入侵面積廣，與其治理，不如利用。互花米草凋落物作為食物鏈的基礎(chǔ)食物提供者，它的流入提升了土壤底泥對克氏原螯蝦的支持能力，而EM菌也能改善底泥中互花米草快速腐解累積所造成的生境惡化現(xiàn)象，并促進(jìn)其分解。本試驗方法效果顯著，豐富了EM菌協(xié)助克氏原螯蝦對凋落物與土壤混合基質(zhì)的響應(yīng)和適應(yīng)，不僅可以為其在沿海灘涂養(yǎng)殖的推廣提供技術(shù)支持，還可提高互花米草的生態(tài)利用價值，為灘涂濕地生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)與恢復(fù)提供參考。