邱裕明，林 旺，郭紅會，張 策，李 莉，李大鵬

( 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)養(yǎng)殖國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，湖北 武漢 430070 )

草魚(Ctenopharyngodonidella)作為我國四大家魚之一，在水產(chǎn)行業(yè)中占有重要的地位，根據(jù)2019年中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒數(shù)據(jù)，草魚以5.5043×106t的產(chǎn)量位居淡水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量第一[1]。相對來說，草魚與其他水產(chǎn)動物一樣，在個(gè)體發(fā)育的早期階段，其死亡率最高。然而，在自然條件或人工飼養(yǎng)條件下，常常會發(fā)生由天氣變化、給排水、活魚運(yùn)輸?shù)仍蛞鸬臏囟润E變，對魚類胚胎的發(fā)育和存活、幼魚生長等造成嚴(yán)重的影響。在研究水溫對異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)“中科3號”[2]胚胎發(fā)育的影響中發(fā)現(xiàn)，孵化溫度變化對于胚胎孵化過程影響較大，若水溫過低會減緩胚胎發(fā)育速度，當(dāng)孵化溫度高于28 ℃，不僅會使孵化率顯著降低，胚胎畸形率也顯著升高，當(dāng)水溫達(dá)到32 ℃時(shí)胚胎發(fā)育最差，孵化率僅為(2.3±1.0)%。亦有報(bào)道稱，胚胎不同發(fā)育階段對溫度的敏感程度不同。于歡歡等[3]認(rèn)為，原腸中期可能是雜交子代胚胎發(fā)育過程中一個(gè)受溫度影響的重要敏感期。周鑫等[4]發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)當(dāng)水溫超過28 ℃時(shí)，草魚幼魚體內(nèi)氧自由基增加，極大影響其免疫應(yīng)答，最終將導(dǎo)致草魚幼魚的大規(guī)模死亡。可見，適宜的溫度對魚類維持正常的生理活動具有重要作用，其對胚胎發(fā)育的影響也會進(jìn)一步影響到仔魚的孵化率和存活率。早在20世紀(jì)80年代就有一些有關(guān)水溫對魚類胚胎發(fā)育影響的研究[5-9]。如薛家驊[8]將胚胎置于14～15、24～27、32～33 ℃孵化，發(fā)現(xiàn)溫度可影響胚胎發(fā)育時(shí)間；郭永燦[9]分析認(rèn)為，草魚胚胎發(fā)育最適溫度為23～28 ℃。然而上述研究大部分停留在表觀指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)上，如孵化率、畸形率、死亡率、胚胎各階段發(fā)育歷時(shí)、胚胎形態(tài)等，缺乏對不同溫度下魚類胚胎潛在的適應(yīng)或影響機(jī)制的研究。

熱休克蛋白(hsp)家族具有協(xié)助變性蛋白復(fù)性以應(yīng)對機(jī)體產(chǎn)生的不良影響的作用[10]，是對溫度極為敏感的分子標(biāo)記[11-12]。這其中，hsp70是最主要、最保守、細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的一類，它廣泛地參與了穩(wěn)定新生多肽過程[13]，具有幫助蛋白質(zhì)進(jìn)入線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[14]等功能。已有研究證明，熱應(yīng)激會誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)hsp70基因相對表達(dá)量的上升[15-17]，不僅可以協(xié)助魚類抵御高溫應(yīng)激，也有助于耐受其他應(yīng)激源的刺激[18]。盡管生物體內(nèi)存在調(diào)控機(jī)制以應(yīng)對外界環(huán)境變化，但一旦超過其承受限度，將有可能會對機(jī)體造成不可逆的傷害。

筆者以草魚胚胎為研究對象，通過設(shè)置不同溫度梯度，探究溫度對草魚胚胎孵化耗時(shí)、孵化率、畸形率、初孵仔魚體長等生物學(xué)指標(biāo)的影響，并測定初孵仔魚hsp70基因的表達(dá)動態(tài)，旨在為草魚的發(fā)育生物學(xué)提供基礎(chǔ)資料，同時(shí)為生產(chǎn)上草魚苗種繁育以及資源增殖提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在湖南省岳陽市華容縣田家湖水產(chǎn)場進(jìn)行。選用基地馴化多年的草魚親本，人工催產(chǎn)后，采集干法人工授精的草魚胚胎作為試驗(yàn)對象。水源為曝氣24 h以上的自來水，孵化容器為圓筒形塑料桶，每個(gè)桶內(nèi)裝有1 L曝氣水，通過水浴控制桶內(nèi)水溫。

1.2 試驗(yàn)方案

設(shè)置22、25、28、31 ℃ 4個(gè)溫度組，每組3個(gè)平行，溫差不超過±0.5 ℃。每個(gè)孵化桶內(nèi)置剛孵化的草魚卵150個(gè)，孵化過程中微曝氣，保證魚卵在水中翻動且卵膜不會被氣流沖破。為準(zhǔn)確地統(tǒng)計(jì)胚胎受精率，每個(gè)溫度組另設(shè)3個(gè)孵化桶，各置100個(gè)草魚卵，待胚胎發(fā)育至原腸胚期后測定受精率。孵化過程中定期選擇不同溫度一定數(shù)目的胚胎在顯微鏡下觀察其發(fā)育情況，待魚苗全部孵化記錄孵化時(shí)長，并統(tǒng)計(jì)孵化率、畸形率，計(jì)算有效積溫和溫度系數(shù)Q10。每組隨機(jī)選取30尾初孵仔魚，記錄體長。收集不同溫度組的初孵仔魚樣品，立即凍存于液氮中直至檢測。

試驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)按下式計(jì)算：

F=n1/n2×100%

(1)

H=n3/(n2×F)×100%

(2)

M=n4/n3×100%

(3)

K=N(T-C)

(4)

(5)

(6)

式中，F(xiàn)為受精率(%)，H為孵化率(%)，M為畸形率(%)，n1為受精卵數(shù)(個(gè))，n2為觀察卵子總數(shù)(個(gè))，n3為孵出仔魚數(shù)(尾)，n4為畸形仔魚數(shù)(尾)；K為胚胎發(fā)育的有效積溫(℃·h)，N為胚胎完成發(fā)育所需要的時(shí)間(h)，T為胚胎發(fā)育的水溫(℃)，C為胚胎發(fā)育的生物學(xué)零度(℃)；n為試驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度梯度個(gè)數(shù)，V為胚胎發(fā)育所需要時(shí)間的倒數(shù)(1/N)，即發(fā)育速率；Q10[5]表示溫度改變10 ℃時(shí)發(fā)育速度加快的倍數(shù)，Z0和Za分別表示溫度t0和ta時(shí)胚胎孵化持續(xù)的時(shí)間(h)。

1.3 熒光定量PCR

使用TRIzol試劑盒提取胚胎樣品總RNA，利用NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢查總RNA濃度和完整性。取1 μg總RNA，用PrimeScriptTMRT Reagents反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA(TaKaRa)，并保存于-20 ℃冰箱直至檢測。

使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物(表1)。在LighrCycler?480實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)(Roche, Basel, Switzerland)上檢測hsp70基因相對表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系總量20 μL：2 μL cDNA模板，10 μL iQTMSYBR?Green Supermix，上下游引物(0.25 μmol/L)各0.8 μL，6.4 μL雙蒸水。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。本次試驗(yàn)以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量比(R)。qPCR分析中使用6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 熒光定量PCR所用引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 20.0對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和LSD多重比較，并數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=6)。采用字母標(biāo)記法表示每個(gè)數(shù)值之間的差異顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 溫度對草魚孵化率和畸形率的影響

草魚胚胎的孵化率隨著溫度升高先上升，在28 ℃達(dá)到最高[(97.00±1.81)%]，而31 ℃條件下孵化率顯著降低，僅為(31.51±1.84)%(P<0.05)(圖1)。溫度對畸形率的影響更為明顯，隨著溫度升高畸形率顯著降低(P<0.05)，在28 ℃達(dá)到最低值[(2.08±1.06)%]，31 ℃，大部分不能正常發(fā)育，畸形率達(dá)(90.00±5.79)%。通過回歸分析，得到孵化率(y)同溫度(x)之間的回歸方程：y=-0.0192x2+0.9695x-11.246(r2=0.872)；畸形率(y)同溫度(x)之間的回歸方程：y=0.0271x2-1.3608x+17.035(r2=0.931)。

圖1 不同溫度條件下草魚胚胎孵化率和畸形率Fig.1 The hatching rate and malformation rate of grass carp C. idella embryos at different temperatures數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n=6)，不同小寫字母表示有顯著性差異(P<0.05)；下同.Data are expressed as mean±standard error (n=6), and means with different letters are significant difference (P<0.05)；et sequentia.

2.2 溫度對胚胎孵化耗時(shí)和有效積溫的影響

隨著孵化溫度的升高，孵化耗時(shí)顯著降低(P<0.05)(表2)。相對的，草魚胚胎孵化的有效積溫在22～28 ℃隨溫度的升高而顯著增加(P<0.05)，28 ℃時(shí)達(dá)到最大值，為(351.48±4.04) ℃·h，隨后在31 ℃顯著下降(P<0.05)。

表2 不同溫度條件下草魚胚胎發(fā)育時(shí)間和有效積溫

試驗(yàn)溫度為22～31 ℃，Q10變化為1.77～2.27，其中25～31 ℃溫度帶內(nèi)的Q10值為2.05，接近2(表3)。

2.3 溫度對初孵仔魚體長的影響

隨著孵化溫度的上升，初孵仔魚的體長呈現(xiàn)先增后降的趨勢，其中22 ℃組體長最小，28 ℃體長最大，25 ℃和28 ℃之間無顯著差異，其他組之間差異顯著(P<0.05)(圖2)。通過回歸分析，得到初孵仔魚體長(y)同溫度(x)之間的回歸方程：y=-0.0357x2+1.9394x-21.138(r2=0.999)。

2.4 溫度對初孵仔魚hsp70基因相對表達(dá)水平的影響

對初孵仔魚體內(nèi)hsp70基因的檢測發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的上升，其相對表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，且在28 ℃達(dá)到最高，28 ℃和31 ℃之間差異不顯著(圖3)。

圖3 不同溫度條件下草魚仔魚hsp70基因相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression level of hsp70 gene of grass carp C. idella larvae at different temperatures

3 討 論

3.1 不同溫度對草魚胚胎發(fā)育的影響

魚類胚胎在發(fā)育過程中對水溫的變化較為敏感，高溫或低溫的刺激往往會導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形、滯育，甚至死亡[5]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著孵化溫度的上升，草魚胚胎的孵化率和初孵仔魚的體長先上升，而后在31 ℃組顯著下降；相反的，畸形率在22～28 ℃先下降，在31 ℃下顯著上升。姜禮燔等[19]將草魚卵在36 ℃下急性暴露1、5、10、40 min，或在10 ℃暴露5、10、15、30 min后，再將魚卵移至19～21 ℃水體內(nèi)孵化，發(fā)現(xiàn)高溫組內(nèi)4種處理時(shí)間均使孵化率降低，而在低溫下暴露超過30 min也會使胚胎發(fā)育遲緩或畸形。在對黑莓鱸(Pomoxisnigromaculatus)[5]、淇河鯽(Carassiusauratus)[6]、尖裸鯉(Oxygymnocyprisstewartii)[20]、四川華鳊(Sinibramataeniatus)[21]等魚類的研究中也有類似的結(jié)果，即在適宜的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，胚胎發(fā)育的孵化率增加，但是溫度過高或過低反而會影響孵化率，并導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形。事實(shí)上，作為胚胎發(fā)育過程中的主要營養(yǎng)來源，卵黃物質(zhì)一方面提供能量，一方面也為胚胎組織、器官的構(gòu)建提供物質(zhì)基礎(chǔ)，而這其中需要大量酶的參與[22]。在溫度較低的情況下，酶的活性被抑制，阻礙胚胎細(xì)胞的代謝，使發(fā)育時(shí)間延長，如在凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的研究中發(fā)現(xiàn)，水溫的降低會延長受精第一、第二極體的釋放時(shí)間，最終影響孵化耗時(shí)[23]。而在溫度較高時(shí)，酶活性亦有可能被抑制，甚至失活，導(dǎo)致胚胎細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生變化，分化過程紊亂，致使受精卵的正常發(fā)育嚴(yán)重受阻[24]。這可能是本試驗(yàn)中31 ℃下草魚胚胎幾乎全部畸形的原因之一。除此之外，也有研究認(rèn)為，胚胎某些結(jié)構(gòu)可能對高溫更加敏感[25]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，草魚胚胎孵化耗時(shí)隨著溫度的升高顯著下降，但有效積溫隨著溫度的升高顯著上升，在28 ℃達(dá)到最大值，隨后在31 ℃下顯著下降。有效積溫代表胚胎發(fā)育過程中累計(jì)所必需的熱量總數(shù)，理論上是個(gè)常數(shù)，但在異育銀鯽[2]、扁吻魚(Aspiorhynchuslaticeps)[26]、玫瑰無須鲃(Puntiusconchonius)[27]等研究中均發(fā)現(xiàn)，當(dāng)孵化溫度變化時(shí)，有效積溫會隨之出現(xiàn)波動。前期研究也證明，胚胎發(fā)育的不同階段對溫度變化的敏感性可能不同[5,26-28]。這或許說明溫度對胚胎的作用機(jī)制并不僅限于量的積累，還可通過參與調(diào)控胚胎發(fā)育過程中復(fù)雜的分子途徑，影響其代謝及器官分化等過程，因此有效積溫在一定范圍內(nèi)波動。一般認(rèn)為，溫度系數(shù)Q10越接近2，該溫度帶內(nèi)水溫變化對胚胎發(fā)育的影響越小，即該溫度范圍為所研究對象的最適溫度范圍。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25～31 ℃溫度帶內(nèi)的草魚胚胎發(fā)育Q10值為2.05，接近2，結(jié)合此溫度范圍內(nèi)孵化率和畸形率的變化，可進(jìn)一步認(rèn)為草魚胚胎發(fā)育最適溫度應(yīng)為25～28 ℃。

3.2 不同溫度對草魚胚胎hsp70基因表達(dá)的影響

溫度脅迫會導(dǎo)致機(jī)體活性氧增加，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)的錯誤折疊，使蛋白質(zhì)失活，影響機(jī)體生理過程。此時(shí)熱休克蛋白的大量轉(zhuǎn)錄翻譯可重折疊變性蛋白，阻止更多蛋白聚集，以維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)[29-31]。不僅如此，胚胎在發(fā)育過程中有大量蛋白質(zhì)合成，熱休克蛋白對新合成蛋白質(zhì)也具有一定的保護(hù)作用[13]。已有研究發(fā)現(xiàn)，高溫可誘導(dǎo)雞[32]、牛[33]、蜥蜴[34]等動物體內(nèi)hsp70基因mRNA水平上升。有關(guān)鮭魚的研究表明，水溫由15 ℃升至22 ℃時(shí)，鮭魚體內(nèi)hsp70基因水平急劇增加[35]。Mottola等[36]將斑馬魚(Daniorerio)在高于正常飼養(yǎng)水溫5 ℃或7 ℃ 暴露30 min后，發(fā)現(xiàn)斑馬魚體內(nèi)hsp70基因的相對表達(dá)量顯著上升，且在+7 ℃組內(nèi)hsp70水平也出現(xiàn)上調(diào)。Hallare等[37]在對斑馬魚胚胎所做的溫度—鎘聯(lián)合暴露試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，相對于低溫組(21 ℃)，對照組(26 ℃)和高溫組(33 ℃)胚胎中hsp70基因相對表達(dá)量上升，胚胎抵御鎘刺激的能力增強(qiáng)，從而使得死亡率降低、平均心率升高。類似的，低溫脅迫也可誘導(dǎo)hsp70基因的表達(dá)，如虎皮魚(Puntiustetrazona)腦、鰓和肌肉組織中hsp70基因mRNA水平隨溫度降低而逐漸升高，表現(xiàn)為溫度依賴性表達(dá)[38]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，孵化溫度的上升促使草魚初孵仔魚體內(nèi)hsp70基因相對表達(dá)量的上升，表明草魚可通過調(diào)節(jié)熱休克蛋白hsp70基因的表達(dá)量以適應(yīng)溫度的變化，保護(hù)胚胎的正常發(fā)育。

然而，熱休克蛋白僅能在一定水平的應(yīng)激強(qiáng)度范圍內(nèi)保護(hù)機(jī)體[4,39,40]，如將文蛤(Meretrixmeretrix)長時(shí)間暴露于pH過高或過低的環(huán)境中，均會導(dǎo)致其機(jī)體內(nèi)hsp70基因表達(dá)量的下降[41]。Cardoso等[39]將北美鯧鲹(Trachinotuscarolinus)幼魚暴露于高溫環(huán)境下，檢測到魚體內(nèi)hsp70基因和p53基因相對表達(dá)量隨溫度升高而上升，在36 ℃組則顯著降低，并伴隨著行為失常，死亡率升高。周鑫等[4]在草魚幼魚急性溫度變化暴露試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，鰓和肌肉中的hsp70基因和hsp90基因的相對表達(dá)量隨溫度升高而升高，繼而在34 ℃組降低，死亡率也迅速提高。通過整合基因相對表達(dá)量、耗氧率及半致死溫度數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，草魚hsp基因的表達(dá)過程需要能量的支持，且同機(jī)體代謝顯著相關(guān)，并進(jìn)一步證實(shí)，草魚的生理臨界溫度為28 ℃[4]。事實(shí)上，由于hsp基因家族大多數(shù)成員沒有內(nèi)含子，在應(yīng)激條件下，hsp70基因的mRNA會優(yōu)先轉(zhuǎn)錄翻譯，而其他蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄翻譯則會受到抑制[11,41]。本試驗(yàn)中，28 ℃組hsp70基因相對表達(dá)量達(dá)到最高值后，31 ℃組沒有進(jìn)一步升高，這可能是由于胚胎發(fā)育過程中并沒有外源性營養(yǎng)，不斷合成熱休克蛋白勢必會影響其他蛋白的合成，導(dǎo)致機(jī)體組織細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組成異常，最終也會使胚胎發(fā)育受阻。本試驗(yàn)hsp70基因的mRNA水平的變化一方面說明28 ℃可能已達(dá)到草魚維持胚胎正常發(fā)育的極限溫度，另一方面，可能正是因?yàn)?1 ℃組熱休克蛋白合成量無法繼續(xù)升高，不足以抵御高溫侵襲，最終導(dǎo)致了孵化率的降低和畸形率的升高。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，水溫25～28 ℃時(shí)，草魚胚胎的受精率、孵化率、有效積溫和初孵仔魚體長均較高，而孵化耗時(shí)，畸形率較低，結(jié)合Q10數(shù)據(jù)分析，建議草魚胚胎孵化的最適溫度為25～28 ℃。同時(shí)，hsp70基因相對表達(dá)水平在25～31 ℃隨溫度升高先升后降，表明草魚可通過調(diào)節(jié)hsp70基因的表達(dá)量以適應(yīng)溫度的變化，保護(hù)胚胎的正常發(fā)育，且28 ℃可能是胚胎正常發(fā)育的極限溫度。