劉桂英，王旭達(dá)，葛 坤，胡超魁，吳金浩，李 愛(ài)，鄭 杰，周遵春

( 1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧 大連 116023； 2.大連海洋學(xué)校，遼寧 大連 116023 )

仿刺參(Apostichopusjaponicus)是食用海參中經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的海參之一，具有多種藥理活性成分。研究表明，海參皂苷是主要的活性物質(zhì)[1]，自1952年Nigrelli等[2]報(bào)道了一種從海參體內(nèi)的居維氏管中分離得到的毒素——海參皂苷以來(lái)，已發(fā)現(xiàn)并確定結(jié)構(gòu)的海參皂苷有100多種。海參皂苷在體外被證實(shí)具有不同程度的抗真菌作用、溶血作用、細(xì)胞毒作用、抑制新生血管、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育等生物活性[3-8]，可作為新型藥物的候選化合物和先導(dǎo)化合物，具有巨大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

海參皂苷的提取方法有索氏提取法、溶劑浸提法、水煮法、超聲波提取法[9]等。于林芳等[10]通過(guò)60%乙醇加熱回流提取海參皂苷，需要3～5 h完成提取；利用大孔吸附樹脂對(duì)革皮氏海參(Pearsonothriagraeffei)中總皂苷進(jìn)行吸附、解吸試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)樹脂的純化，得到較高純度的總皂苷[11]。叢日山等[12]采用水煮法提取海參皂苷，提取時(shí)間較長(zhǎng)。傳統(tǒng)的提取方法在提取率、耗時(shí)、耗能等方面具有很大的改進(jìn)和提升空間。微波輔助提取法是近年來(lái)新興的提取方法，具有加熱速度快，提取時(shí)間較短，提取效率高等優(yōu)點(diǎn)。趙麗蓉等[13]采用微波輔助萃取提取黃精藥材中的總皂苷，提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，料液體積比為1∶16，提取時(shí)間為40 s。蘭艷素等[14]采用微波輔助萃取提取廣豆根中的總黃酮，提取時(shí)間僅需3 min，提取率較高。微波輔助萃取技術(shù)主要應(yīng)用于中草藥中皂苷的提取，尚未見(jiàn)采用微波萃取技術(shù)提取仿刺參中海參皂苷的研究報(bào)道。因此，筆者結(jié)合微波輻射所具有的特點(diǎn)，采用單因素與響應(yīng)面優(yōu)化相結(jié)合的方法[15]對(duì)海參皂苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，考察微波萃取的最佳提取條件，建立仿刺參中海參皂苷的提取工藝，為仿刺參資源的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仿刺參取自遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院引育種中心，均為3齡參。乙醇、甲醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán))；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；固相萃取柱(美國(guó)Waters公司，Oasis HLB，6 cc，500 mg)；皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Cladoloside A(CA)由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器設(shè)備

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)、配有二極管陣列檢測(cè)器(DAD)、氮吹濃縮儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)、Milli-Q超純水儀(美國(guó)Milliopore公司)、微波萃取儀(美國(guó)CEM公司)、超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、高速組織搗碎機(jī)(德國(guó)IKA公司，T18 digital)、固相萃取儀(美國(guó)色譜科公司)、真空冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Marin Christ公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品液的制備

取3～5頭仿刺參置于冰盤中，取出內(nèi)臟，將體壁切成小塊，放入真空冷凍干燥機(jī)，冷凍干燥48 h。取出搗碎成粉末, 取粉末約0.5 g，加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液25 mL，微波輔助萃取儀萃取，萃取時(shí)間為10 min，爬坡時(shí)間為5 min，溫度為45 ℃，萃取功率為400 W，微波萃取3次，將萃取液合并，50 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)乙醇味，加水至10 mL，將含有皂苷的待測(cè)溶液全部轉(zhuǎn)入活化后的固相萃取柱(活化過(guò)程為先用2.0 mL甲醇活化，再用5.0 mL純凈水平衡，保持濕潤(rùn))，保證2滴/s的流速，抽干小柱，用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醇溶液5.0 mL進(jìn)行淋洗，最后用純甲醇5.0 mL作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，抽干小柱，收集全部流出液，50 ℃水浴濃縮，氮吹儀氮吹至液面高度恒定，用甲醇定容1.0 mL，上清液經(jīng)有機(jī)相濾膜0.22 μm過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.3.2 色譜條件

根據(jù)文獻(xiàn)[16]及試驗(yàn)結(jié)果，確定如下液相色譜儀的色譜條件。色譜柱：Zobax SB-CN色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；波長(zhǎng)：205 nm；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A為純凈水，B為乙腈；流速：1.0 mL/min；梯度洗脫程序：起初1～5 min為70% A，5～30 min為50% A，35 min為70% A；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取適量海參皂苷CA(精確至2.0 mg)標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純乙腈溶解，配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃保存，臨用時(shí)稀釋成所需用量。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在相同條件下，選用微波萃取儀對(duì)同一樣品設(shè)置不同功率進(jìn)行提取，微波功率的設(shè)置為400、600、800 W。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相同條件下，600 W和800 W的功率較高，樣品經(jīng)過(guò)萃取之后，海參皂苷基本被破壞，未檢出皂苷含量。這是由于隨著微波功率的增大，電磁波發(fā)射出的頻率越大，物質(zhì)內(nèi)部產(chǎn)生的熱能越大，提取率逐漸增大；而功率過(guò)高，有效成分破壞，提取率減小；因此，選擇微波功率為400 W。

參照文獻(xiàn)[17-19]以及預(yù)試驗(yàn)，最終確定考察乙醇體積分?jǐn)?shù)，溶劑體積、時(shí)間、溫度4個(gè)因素，按上述條件進(jìn)行樣品制備：(1)固定時(shí)間為10 min、微波功率為400 W、溶劑體積為25 mL、溫度為45 ℃，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90% 5個(gè)水平；(2)固定提取時(shí)間為10 min、微波功率為400 W、溶劑體積為25 mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，設(shè)置提取溫度為35、45、55、65、75、85 ℃ 6個(gè)水平；(3)固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、微波功率為400 W、溶劑體積為25 mL、溫度為45 ℃，設(shè)置時(shí)間為5、10、15、 20、25 min 5個(gè)水平；(4)固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、微波功率為400 W、時(shí)間為10 min、溫度為45 ℃，設(shè)置溶劑體積為10、15、20、25、30 mL 5個(gè)水平。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以時(shí)間(A)、溫度(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)3個(gè)因素為自變量，海參皂苷CA提取率為因變量，海參皂苷CA含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，以優(yōu)化海參皂苷CA的提取方法。因素水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.3.6 海參皂苷得率的計(jì)算方法

樣品中總皂苷含有量以海參皂苷CA計(jì)。海參皂苷CA為本實(shí)驗(yàn)室自制，利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、紅外光譜以及核磁共振儀確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，經(jīng)高效液相法檢測(cè)，確定純度大于95%。海參皂苷CA自仿刺參體壁提取純化獲得，含量較高，具有一定的代表性，因此，選擇海參皂苷CA提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算公式如下：

式中，wCA為海參皂苷CA提取率(‰)，m1為提取海參皂苷CA質(zhì)量(mg)，m為仿刺參樣品質(zhì)量(mg)。

1.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取仿刺參樣品粉末約0.5 g，按響應(yīng)面法優(yōu)化的提取方法進(jìn)行海參皂苷CA的提取測(cè)定，平行3次，以驗(yàn)證提取方法的可行性及重現(xiàn)性。稱取不同規(guī)格的雌、雄仿刺參樣品進(jìn)行海參皂苷的測(cè)定，以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，并進(jìn)一步討論海參皂苷提取率在不同規(guī)格仿刺參中的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜檢測(cè)方法的建立

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.3.3)若干體積，用色譜純甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.005、0.015、0.050、0.150、0.500、1.000 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度(x，mg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到目標(biāo)化合物的線性回歸方程y=1264x+2.917和相關(guān)系數(shù)r=0.9990。結(jié)果表明，海參皂苷CA在0.005～1.000 mg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，以3倍和10倍信噪比確定該化合物的儀器檢出限和定量限，分別為0.0015 mg/mL和0.005 mg/mL。向樣品中分別添加10、20、50 μg/g的海參皂苷CA，每個(gè)水平測(cè)定5份平行樣品，考察方法的回收率和精密度，平均回收率分別為63.7%、89.3%和94.4%，精密度分別達(dá)到3.5%、1.3%和2.2%。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

按照1.3.1中樣品的制備方法，通過(guò)加標(biāo)回收率考察萃取溶劑體積分?jǐn)?shù)、溫度、時(shí)間和溶劑體積等因素對(duì)海參皂苷CA提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。采用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取海參皂苷CA，海參皂苷CA提取率較高。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，海參皂苷CA的提取率逐漸降低，由于海參皂苷CA的極性較大，根據(jù)相似相溶的原理，海參皂苷CA的溶解率降低，因此選擇體積分?jǐn)?shù)70%乙醇作為提取溶劑為最佳。由于微波萃取罐的最大體積為30 mL，由10 mL逐漸增加溶劑體積，直至30 mL。當(dāng)溶劑體積為25 mL時(shí)，海參皂苷CA的提取率較高。當(dāng)時(shí)間為10 min的時(shí)候，海參皂苷CA的提取率較高，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，海參皂苷CA提取率反而降低，但在25 min時(shí)，提取率升至10 min時(shí)的水平，這可能是提取時(shí)間長(zhǎng)，部分皂苷發(fā)生了降解，生成了海參皂苷CA的緣故，但不是仿刺參體內(nèi)的已有海參皂苷，因此選用10 min較為合適。微波設(shè)置溫度在35～85 ℃內(nèi)，45 ℃時(shí)，海參皂苷CA提取率較高，隨著溫度的升高，提取率逐漸下降，可能是溫度高，海參皂苷發(fā)生了降解的緣故，選擇45 ℃為最佳提取溫度。

圖1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Fig.1 The results of single factor experiment

2.3 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取時(shí)間(A)、溫度(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)3個(gè)因素進(jìn)行Box-Benhken響應(yīng)面優(yōu)化。其中1～12組試驗(yàn)為析因設(shè)計(jì)，13～17組試驗(yàn)為中心設(shè)計(jì)；零點(diǎn)試驗(yàn)共設(shè)計(jì)5組，用以估算試驗(yàn)誤差；響應(yīng)面設(shè)計(jì)以A、B、C為自變量，以海參皂苷CA提取率(y)為因變量，設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表2。

表2 微波提取海參皂苷CA的響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

通過(guò)對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得出回歸方程為：y=15.08+0.65A-0.20B-1.65C-1.10AB+0.30AC-3.00BC-4.19A2-2.94B2-3.34C2，并作出響應(yīng)面圖和等值線圖，對(duì)該模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得出二次響應(yīng)回歸模型的方差分析，分析結(jié)果見(jiàn)表3。

響應(yīng)曲面三維圖能夠直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度和因素間交互作用的強(qiáng)弱。等高線的形狀反映出交互作用影響效應(yīng)的強(qiáng)弱與大小[24]。采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)固定時(shí)，海參皂苷CA提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的升高而增加(圖2)。提取時(shí)間由5 min增至15 min，海參皂苷CA的提取率增加。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，海參皂苷CA提取率先升后降。微波使細(xì)胞壁破裂，增加了海參皂苷CA的溶解度，而溫度過(guò)高，海參皂苷CA發(fā)生降解，導(dǎo)致提取率降低。當(dāng)溫度固定時(shí)(圖3)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，海參皂苷CA提取率明顯增大，但時(shí)間較短或較長(zhǎng)均導(dǎo)致海參皂苷CA的提取率降低。當(dāng)時(shí)間固定時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度的升高，海參皂苷CA提取率提高至最大值，但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大和溫度的升高，海參皂苷CA提取率有所降低(圖4)。因此，模型顯示，在適當(dāng)條件下，海參皂苷CA的提取率最高。

圖4 微波提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)海參皂苷CA提取率交互作用的響應(yīng)面立體圖和等高線圖Fig.4 Response surface stereogram and contour map of the interaction between microwave temperature and different concentration of ethanol on sea cucumber saponin CA yield

2.4 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)所得到的模型，經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件處理的最優(yōu)工藝條件：微波功率400 W，溶劑為體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，溫度為45 ℃，次數(shù)為3次，時(shí)間為10 min。在此條件下，海參皂苷CA理論上的含量達(dá)150.8 μg/g，實(shí)際進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果分別為153.6、149.5、152.3 μg/g，取其平均值為151.8 μg/g，與理論值較為接近，表明數(shù)學(xué)模型對(duì)優(yōu)化海參皂苷CA的提取工藝可行。

通過(guò)本試驗(yàn)建立的優(yōu)化方法對(duì)不同規(guī)格的雌、雄仿刺參進(jìn)行海參皂苷的測(cè)定，進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，其結(jié)果見(jiàn)表5。雌、雄仿刺參體壁海參皂苷CA含量相似，大規(guī)格海參皂苷CA含量變化不大。

表5 仿刺參不同規(guī)格海參皂苷CA的含量

3 討 論

3.1 方法學(xué)討論

方法學(xué)考察的結(jié)果表明，當(dāng)海參皂苷CA質(zhì)量濃度為0.005～1.000 mg/mL，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品線性關(guān)系良好，儀器和樣品溶液的精密度和重復(fù)性較高，且加樣回收率較佳，所優(yōu)選的高效液相色譜測(cè)定皂苷成分的色譜條件和提取方法符合試驗(yàn)要求。

3.2 提取方法的比較

為了考察不同提取方法對(duì)提取效果的影響，筆者分別采用微波輔助提取法、索氏提取法和超聲波提取法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，索氏提取法和微波輔助提取法的提取率相當(dāng)，但是索氏提取法消耗時(shí)間長(zhǎng)，每批次檢測(cè)樣品量少。相同條件下，超聲波提取法的提取率較低。微波輔助萃取法采用了微波的輻射功能，增加了溶劑的穿透力，加深了需提取成分在溶液中的釋放擴(kuò)散，提高了物質(zhì)的提取速度和工作效率，具有高效性和強(qiáng)選擇性，且適合大批量樣品提取分析。因此，本試驗(yàn)選擇微波輔助提取法進(jìn)行提取。

3.3 響應(yīng)面優(yōu)化討論

采用單因素法對(duì)皂苷微波輔助提取方法中、乙醇體積分?jǐn)?shù)和體積、溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上采用Box-Benhken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法進(jìn)一步優(yōu)化，以提高海參皂苷CA的提取率。響應(yīng)面法是集試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)和計(jì)算機(jī)科學(xué)為一身的優(yōu)化方法，不僅可以搜尋出各因素的最優(yōu)水平區(qū)域，而且可以考察各因素對(duì)響應(yīng)值及各因素之間的交互作用，其為全局性優(yōu)化，試驗(yàn)點(diǎn)數(shù)少，試驗(yàn)信息量大，已廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、生物和農(nóng)業(yè)等研究領(lǐng)域的工藝優(yōu)化[25-29]。采用Box-Benhken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以較少的試驗(yàn)次數(shù)獲得提取條件與海參皂苷CA成分之間的相關(guān)信息，多元二次回歸分析模型及響應(yīng)曲面能較好地描述提取條件與海參皂苷CA提取率之間的相關(guān)性以及提取條件之間的交互作用。通過(guò)響應(yīng)面分析，優(yōu)化了海參皂苷的提取工藝，試驗(yàn)值與模型理論預(yù)測(cè)值僅相差0.1%。因此采用響應(yīng)面分析優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際操作。王琴等[30]用該方法對(duì)金柚幼果總黃酮進(jìn)行提取優(yōu)化，蘭艷素等[14]用該方法對(duì)廣豆根中總黃酮進(jìn)行了優(yōu)化，均獲得了較高的提取率，說(shuō)明該方法切實(shí)可行。

4 結(jié) 論

采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化微波輔助萃取法，以海參皂苷CA的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定時(shí)間、溫度和溶劑體積分?jǐn)?shù)3個(gè)自變量，建立了微波輔助提取仿刺參中海參皂苷CA的提取率與影響因素之間的模型關(guān)系，并最終確立微波輔助提取海參皂苷CA的最佳工藝條件：在微波功率為400 W的條件下，采用70%乙醇25 mL對(duì)樣品進(jìn)行提取，微波加熱時(shí)間為10 min，溫度為45 ℃，在此條件下的海參皂苷的提取含量可達(dá)到151.8 μg/g。試驗(yàn)結(jié)果可為該技術(shù)的應(yīng)用提供參考和依據(jù)，為合理開發(fā)利用仿刺參提供科學(xué)依據(jù)。