付怡茗，魏曉彤，柏寒，王翠平，楊繼國

（山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種以持續(xù)或間歇性腹痛并伴有大便性狀異常為特征的功能性胃腸疾病，臨床以腹瀉型（IBS-D）患者最為多見。IBS發(fā)病機制復雜，病程較長且遷延難愈，常給患者帶來嚴重的生活困擾。近年來，針刺治療IBS-D以其獨特的治療優(yōu)勢引起了國內(nèi)外的廣泛關注[1]。研究發(fā)現(xiàn)，精神異常與心理障礙是導致IBS發(fā)生的重要因素，其作用機制可能與“腦-腸軸”有關[2]?；谶@一特點，臨床研究發(fā)現(xiàn)以“健脾調(diào)神”法針刺治療IBS-D能顯著改善胃腸功能，降低疾病復發(fā)率[3]。穴位注射與電針作為針刺的常規(guī)治療方式，目前廣泛應用于臨床IBS患者的治療當中，現(xiàn)代研究中鮮有二者的治療效果對比的相關報道。故本研究以“健脾調(diào)神”針刺法為基礎，觀察穴位注射與電針治療IBS-D模型小鼠的效果差異，以期為臨床治療IBS-D提供方案選擇的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物4個月齡SPF級KM孕鼠5只，體質(zhì)量80～120 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK（魯）2019-0003。實驗在山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心進行，實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）2017-0022，實驗前將孕鼠適應性飼養(yǎng)1周，自由進食與飲水，室溫（24±2）℃，濕度（50±5）%。實驗動物所有操作經(jīng)山東中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理審查委員會批準，批號：SDUTCM20200907003。

1.2 藥物與試劑0.5%乙酸水溶液（安徽雷根生物技術(shù)有限公司，批號：0917A20）；番瀉葉水煎液（山東中醫(yī)藥大學中藥房）；黃芪注射液（神威藥業(yè)集團有限公司，批號：Z13021000）；75%醫(yī)用消毒酒精（湖南廣盛源醫(yī)藥科技有限公司，批號：20180722）；10%福爾馬林中性固定液（南昌雨露實驗器材有限公司，批號：200904）；碳素墨汁（北京一得閣公司，批號：20201011）；甲苯胺藍染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：G3663）。

1.3 主要儀器SDZ-V型華佗牌電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；YH-A3001型電子天平（五鑫衡器有限公司）；華佗牌0.18 mm×13 mm一次性使用無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，批號：200135）；一次性無菌注射器（江蘇治宇醫(yī)療器械有限公司，醫(yī)療器械注冊證編號：國械標準20173150338）；2.7 mm雙腔球囊導尿管（浙江優(yōu)特格爾醫(yī)療用品有限公司，醫(yī)療器械注冊證編號：浙械標準20192140251）；0.5 mm×1 mm毛細硅膠管（上海深輝橡塑五金有限公司，批號：200510）；EG1160型生物組織包埋機（德國徠卡公司）；RM2135型石蠟切片機（德國徠卡公司）；E400型生物顯微鏡（日本尼康公司）；BX40型顯微鏡照相系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.4 造模與分組5只KM孕鼠在適應性飼養(yǎng)1周后生產(chǎn)幼鼠共56只，篩選體質(zhì)量10～20 g、雌雄各半的新生幼鼠32只，按隨機原則選取8只作為空白組，不予干預，正常飼養(yǎng)。剩余24只采用母嬰分離、乙酸灌腸、番瀉葉灌胃及夾尾刺激聯(lián)合制備實驗所需IBS-D模型小鼠[4-5]。造模新生幼鼠于出生后第2天開始進行不可預測性[6]母嬰分離，每日持續(xù)3 h；從第12天開始疊加0.5%乙酸灌腸刺激，具體實驗劑量見表1，以上均持續(xù)至第26天結(jié)束。其后正常飼養(yǎng)至第50天，同日開始對造模小鼠進行番瀉葉水煎液灌胃（29.4 g/100 mL），并在自制束縛袋中對小鼠尾外側(cè)1/3處行夾尾刺激，每日持續(xù)夾尾5 min，持續(xù)至第57天結(jié)束。造模后，模型小鼠出現(xiàn)符合中醫(yī)辨證的肝郁脾虛證候的情況，如精神抑郁（情緒敏感度增高、易怒易嘶叫，日常倦怠懶臥，毛發(fā)枯黃無光澤），排便異常（稀便率增加、排便次數(shù)增多），胃腸道功能紊亂（腸道敏感度增加、飲食減少、體質(zhì)量增長速度減緩）。

表1 小鼠結(jié)腸0.5%乙酸灌腸量（mL）

造模結(jié)束后，24只模型小鼠按隨機原則分為模型組、穴位注射組和電針組，每組8只，并在空白組、模型組、穴位注射組和電針組中分別隨機選取2只小鼠，取結(jié)腸組織行HE染色，以結(jié)腸組織無明顯病理性改變作為造模成功的依據(jù)。

1.5 實驗給藥造模成功后，第60天開始進行針刺干預刺激。取穴參考《實驗針灸學》[7]中定位標準：“足三里”位于膝關節(jié)外側(cè)，腓骨小頭下約3 mm，皮下直刺6 mm；“百會”位于頂骨正中，向前平刺2 mm。采用棉繩捆綁小鼠四肢并系于解剖板進行固定，電針組小鼠常規(guī)穴區(qū)消毒后，應用0.18 mm×13 mm針灸針快速進針，連接電針儀，采用疏密波（2/100 Hz），調(diào)整強度為1，穴位單側(cè)取用次日輪換，每日持續(xù)15 min。穴位注射組采用1 mL無菌注射器給予各穴位0.05 mL黃芪注射液，并按電針組相同束縛方法束縛15 min。模型組小鼠以相同的束縛方法束縛15 min，此外不給予任何刺激?？瞻捉M正常飼養(yǎng)，不給予任何刺激。以6 d為1個療程，中間休息1 d，共治療4個療程。

1.6 觀察指標

1.6.1 一般情況觀察 每日觀察各組小鼠的精神行為狀態(tài)、毛發(fā)色澤狀況、活動情況、排便情況及糞便性狀等。

1.6.2 Bristol糞便性狀評分 參考Bristol糞便性狀7級評分標準[8]（見表2），針刺干預結(jié)束后當日，收集各組小鼠16:00:00—18:00:00的糞便并對各組小鼠糞便情況進行評分。

表2 Bristol糞便性狀量表

1.6.3 腹壁回縮反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）于造模結(jié)束后、針刺干預結(jié)束后當日，依據(jù)AWR評分標準[5]（見表3），分別測定各組小鼠在AWR評價達到3分時的最小容量閾值。實驗前禁食不禁水12 h，用棉繩將小鼠四肢綁在解剖板上固定，將涂抹石蠟油的帶擴張球囊的硅膠導尿管輕柔地插入小鼠肛門，使球囊末端深入肛門約5 mm，將導管與小鼠尾部用無菌膠布固定牢固。待小鼠適應20 min后，經(jīng)導管向球囊勻速注入24℃溫水，使腸道擴張，擴張時間持續(xù)20 s，觀察并記錄引起小鼠腹部抬起（AWR評價為3分）的最小注水量。用注射器將球囊內(nèi)的水吸凈，待10 min后進行下一次球囊擴張實驗，重復擴張3次，取3次所得最小注水量的均值代表該小鼠的最小容量閾值，評價小鼠對直腸擴張刺激的敏感性。

表3 腹壁回縮反射（AWR）評分（分）

1.6.4 小腸推進率測定 實驗前禁食不禁水24 h，于針刺結(jié)束當日按0.15 mL/10 g對各組小鼠進行墨汁灌胃，靜置15 min后，快速脫頸處死，剖開小鼠腹腔，迅速取出小鼠整個胃腸道，拉直后測定小腸推進率。小腸推進率=墨汁前沿至幽門的距離/小腸總長度×100%。

1.6.5 結(jié)腸組織的病理學改變 于小腸推進率測定結(jié)束后取距離肛門6 cm處結(jié)腸段各3 cm，經(jīng)生理鹽水沖洗后放入10%中性福爾馬林固定液固定。經(jīng)常規(guī)石蠟包埋組織切片，HE染色后光鏡（×200）下觀察結(jié)腸組織形態(tài)。

1.6.6 結(jié)腸組織肥大細胞（mast cells，MC）計數(shù) 取“1.6.5”經(jīng)常規(guī)石蠟包埋組織切片，行甲苯胺藍染色，隨機選取3個視野光鏡（×400）下觀察MC形態(tài)，連續(xù)計數(shù)后取平均值。

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料均以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般行為學觀察空白組小鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)順滑有光澤，飲食、大便正常。造模小鼠較空白組小鼠體型偏瘦小，精神狀態(tài)較差，易怒易嘶叫打斗，毛發(fā)枯黃稀疏，日活動減少，飲食減少且出現(xiàn)不同程度的稀便。經(jīng)穴位注射與電針治療后，小鼠情緒易激狀態(tài)明顯改善，活動增加，毛發(fā)逐漸恢復亮白色，飲食量增加。

2.2 各組小鼠Bristol糞便性狀評分比較模型組小鼠Bristol糞便性狀評分明顯高于空白組（P＜0.05）；穴位注射組、電針組小鼠Bristol糞便性狀評分明顯低于模型組（P＜0.05）；電針組小鼠Bristol糞便性狀評分明顯低于穴位注射組（P＜0.05）；表明穴位注射與電針均能改善IBS-D小鼠腹瀉狀態(tài)，但電針效果明顯優(yōu)于穴位注射。（見表4）

表4 各組小鼠Bristol糞便性狀評分比較（±s，分）

表4 各組小鼠Bristol糞便性狀評分比較（±s，分）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與穴位注射組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 糞便性狀評分空白組 6 3.73±0.45模型組 6 5.70±0.46a穴位注射組 6 4.71±0.46b電針組 6 4.20±0.40b c

2.3 各組小鼠AWR最小容量閾值比較造模后，模型組、穴位注射組、電針組小鼠AWR最小容量閾值均明顯低于空白組（P＜0.05），說明造模后小鼠腸道敏感性增高。干預后，電針組小鼠AWR最小容量閾值高于模型組（P＜0.05），穴位注射組小鼠AWR最小容量閾值高于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；電針組小鼠AWR最小容量閾值明顯高于穴位注射組（P＜0.05），說明電針能改善IBS-D小鼠腸道高敏感狀態(tài)。（見表5）

表5 各組小鼠AWR最低容量閾值比較（±s，mL）

表5 各組小鼠AWR最低容量閾值比較（±s，mL）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與穴位注射組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 造模后 干預后空白組 6 0.308±0.020 0.318±0.005模型組 6 0.207±0.023a 0.225±0.018a穴位注射組 6 0.209±0.017a 0.232±0.006a電針組 6 0.237±0.028a 0.292±0.127b c

2.4 各組小鼠小腸推進率比較模型組小鼠小腸推進率明顯高于空白組（P＜0.05）；穴位注射組、電針組小鼠小腸推進率均明顯低于模型組（P＜0.05）；電針組小鼠小腸推進率明顯低于穴位注射組（P＜0.05）；表明穴位注射、電針均能改善IBS-D小鼠胃腸功能紊亂狀態(tài)，但電針效果優(yōu)于穴位注射。（見表6）

表6 各組小鼠小腸推進率比較（±s，%）

表6 各組小鼠小腸推進率比較（±s，%）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與穴位注射組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 小腸推進率空白組 6 0.743±0.015模型組 6 0.832±0.021a穴位注射組 6 0.786±0.008b電針組 6 0.740±0.007b c

2.5 各組小鼠結(jié)腸組織黏膜形態(tài)觀察各組小鼠結(jié)腸黏膜形態(tài)完好，無炎癥，黏膜固有層中無中性粒細胞浸潤，間質(zhì)無水腫，柱狀細胞排列整齊，杯狀細胞數(shù)量較多。（見圖1）

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織的病理圖（HE，×200）

2.6 各組小鼠結(jié)腸組織肥大細胞（MC）浸潤程度比較空白組小鼠結(jié)腸組織MC呈圓形，外觀平整均勻，單個散布于組織中，浸潤程度低；模型組小鼠結(jié)腸組織MC以不規(guī)則形狀集中分布為主，且浸潤程度明顯高于空白組（P＜0.05）；穴位注射組、電針組小鼠結(jié)腸組織MC以不規(guī)則橢圓形為主、邊界清晰、散在分布于組織中，且浸潤程度均明顯低于模型組（P＜0.05）；電針組小鼠結(jié)腸組織MC浸潤程度明顯低于穴位注射組（P＜0.05）。（見圖2、表7）

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織MC浸潤程度（甲苯胺藍，×400）

表7 各組小鼠結(jié)腸組織肥大細胞數(shù)目比較（±s，個/視野）

表7 各組小鼠結(jié)腸組織肥大細胞數(shù)目比較（±s，個/視野）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與穴位注射組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 肥大細胞數(shù)目空白組 6 0.67±0.37模型組 6 4.61±1.65a穴位注射組 6 3.45±0.72b電針組 6 1.78±0.46b c

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，IBS-D的發(fā)病機制可能與胃腸動力紊亂、內(nèi)臟高敏感性及腦腸互動關系密切[2]。隨著腦腸軸理論研究的不斷深入，精神心理因素已成為導致IBS-D發(fā)生的重要因素，并且與疾病發(fā)展預后密切相關。IBS-D在中醫(yī)學中多屬于“泄瀉、腸郁”的范疇，IBS-D的基本病機為肝郁脾虛，其中脾胃失調(diào)是基礎，而情不遂、神不和則為發(fā)病的關鍵。張介賓在《景岳全書》中有言：“脾胃之傷于情志者，較之飲食寒暑為更多也?！碑斍橹旧?，累及脾胃而無力化生氣血，易導致出現(xiàn)以氣血不足、心神失養(yǎng)為主要表現(xiàn)的臨床癥狀?；趯Πl(fā)病機理的認知，“健脾調(diào)神”針刺治療IBS-D在臨床收效甚佳?！鞍贂蔽挥趲p頂，具有調(diào)神健腦之功，依據(jù)經(jīng)絡循行，腦與胃、大腸、小腸經(jīng)均相通，且為掌管人體一切思維與情志的“元神之府”，同時又能夠升陽固脫，對治療泄瀉有一定的療效；“足三里”為胃之下合穴，所謂“肚腹三里留”，該穴具有健運中州，維持胃腸運動穩(wěn)定的功能。兩穴相配，調(diào)情志而理氣血，健脾胃而暢氣機，不僅能夠改善胃痛、泄瀉等癥狀，又可以緩解患者抑郁、焦慮的情緒。目前認為，針刺治療IBS-D具有獨特優(yōu)勢。相較于單純的運用西醫(yī)治療，電針治療IBS-D能夠更好地緩解患者腹痛的癥狀，平衡胃腸功能，改善精神狀況[9]。韋麗萍等[10]采用穴位注射黃芪注射液治療IBS-D，結(jié)果顯示其治療有效率顯著高于西醫(yī)對照組，且復發(fā)率明顯降低。此外，相較于中藥內(nèi)服，電針與穴位注射具有操作簡便、副作用小、用藥量小且作用迅速的特點，更有利于患者接受及臨床的推廣使用。

本實驗采用母嬰分離、乙酸灌腸、番瀉葉灌胃和夾尾刺激聯(lián)合制備實驗所需IBS-D小鼠模型。實驗結(jié)果表明，模型小鼠Bristol糞便性狀評分提高，AWR最小容量閾值降低（P＜0.05），HE染色顯示模型小鼠結(jié)腸黏膜形態(tài)完好、無炎癥細胞浸潤、無器質(zhì)性病理改變。以上各項指標均符合肝郁脾虛型IBS-D模型的病理特點。通過比較干預后各組小鼠的Bristol糞便性狀評分、AWR最小容量閾值、小腸推進率，我們發(fā)現(xiàn)穴位注射組與電針組小鼠的排便異常、內(nèi)臟高敏感性及胃腸紊亂情況均有所改善，但電針的治療效果明顯優(yōu)于穴位注射。

MC與IBS-D的關系主要體現(xiàn)在增加內(nèi)臟敏感度，造成胃腸動力紊亂，以及破壞腸道的免疫屏障功能[11]。當人體受到外來刺激時會導致腸道內(nèi)MC大量活化脫顆粒，從而釋放多種活性介質(zhì)和細胞因子，其中5-羥色胺（5-HT）是重要的介質(zhì)之一。5-HT廣泛存在于胃腸道中，其受體5-HT3、5-HT4廣泛參與對腸道蠕動反射的調(diào)節(jié)，從而導致IBS患者胃腸功能紊亂的形成[12]。IBS患者內(nèi)臟敏感性的升高也可能與5-HT損害迷走神經(jīng)的調(diào)控能力有關[13]。有研究表明，相較于正常人，IBS患者腸道MC的數(shù)量不僅在全結(jié)腸呈現(xiàn)整體上升趨勢，而且在單個結(jié)腸段仍顯著增加[14]，這一結(jié)果表明MC與IBS存在密切的關聯(lián)。本實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠結(jié)腸組織MC浸潤程度明顯高于空白組（P＜0.05），說明IBS-D的發(fā)病機制可能與MC存在密切聯(lián)系；與模型組比較，穴位注射組與電針組小鼠結(jié)腸組織MC浸潤程度均降低，但電針組浸潤程度明顯低于穴位注射組（P＜0.05），這表明電針治療IBS-D的機制可能與降低MC水平有關。

綜上所述，電針和穴位注射均可對IBS-D模型小鼠起到治療作用，但兩者存在效應差異，即電針的作用優(yōu)于穴位注射。需要說明的是，IBS-D屬于慢性疾病，臨床治療過程一般長達幾個月，考慮到本實驗治療時間短暫且樣本量較少，故實驗結(jié)果具有一定的局限性。電針與穴位注射治療IBS-D的作用機制仍需進一步探究。