夏凡林，沈磊瑩，曹 陽，林子晶

（1.上海城建職業(yè)學院，上海 201415；2.上海交通大學附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011；3.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，重慶 400016）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種慢性、自身免疫性和神經(jīng)退行性疾病，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為主要病理特征。據(jù)報道，全球大約有250多萬人罹患MS。該病的發(fā)病機制目前尚未明確，可能與遺傳、環(huán)境、感染和自身免疫等有關(guān)，其中“自身免疫學說”是研究熱點之一。該學說指出，MS的產(chǎn)生是由于髓鞘堿性蛋白（MBP）對自身免疫系統(tǒng)進行攻擊，導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)髓鞘脫失，從而導致各種神經(jīng)功能障礙的發(fā)生[1]。目前，國內(nèi)外學者依據(jù)“自身免疫學說”開發(fā)出了Glatiramer acetate、Fingolimod等新藥治療MS，但其價格昂貴且患者耐受性差，臨床應用有限。近年來，中藥治療MS因其療效穩(wěn)定、毒副作用小及復發(fā)率低的特點引起了學者的廣泛關(guān)注[2]。

多發(fā)性硬化在中醫(yī)學中無對應的名稱，根據(jù)其癥狀及體征可歸屬于“痿證”。其主要病機是患者多素體稟賦不足，復感受外邪，導致體內(nèi)痰瘀凝結(jié)，誘發(fā)腦髓、脊髓病變。治療應以補腎益氣、活血化瘀為主要治療原則。薯蕷塊莖是常用中藥材山藥，中醫(yī)學認為薯蕷具有益腎氣、健脾胃、止泄痢、化痰涎、舒筋活血、截瘧等功效。薯蕷皂苷是其主要活性成分，屬于甾體皂苷類化合物之一。藥理學研究顯示，薯蕷皂苷具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤和抗凋亡等活性[3]。褚春民等[4]研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷對膠原性關(guān)節(jié)炎模型大鼠具有良好的雙向免疫調(diào)節(jié)作用，被認為是非常具有開發(fā)前景的免疫調(diào)節(jié)劑。鑒于此，筆者推測薯蕷皂苷可能通過改善免疫炎癥損傷而延緩MS進展。核因子κB（NF-κB）屬于轉(zhuǎn)錄因子，與細胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應等密切相關(guān)[5]。與健康人比較，MS患者腦脊液、血清、腦組織和脊髓組織中NF-κB表達水平均有所升高[6]；且臨床上常用于治療MS的藥物[如醋酸格拉替雷、干擾素β（IFN-β）等]均可通過抑制NF-κB的表達而發(fā)揮作用[7]。這提示阻斷NF-κB表達可能是防治MS的有效手段[8]?；诖?，本研究采用髓鞘堿性蛋白（MBP）+完全弗氏佐劑（CFA）誘導建立EAE小鼠模型，觀察薯蕷皂苷是否可以通過抑制NF-κB活性而改善MS小鼠神經(jīng)炎癥反應及阻止疾病的進展，旨在探討薯蕷皂苷對MS的免疫調(diào)節(jié)作用，為其臨床應用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性C57BL/6小鼠40只，健康狀況良好，SPF級，10周齡，體質(zhì)量20～30 g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0002，動物使用許可證號：SYXK（京）2016-0037。所有小鼠均飼養(yǎng)于上海交通大學動物實驗中心，室溫（24±2）℃，每12 h明暗交替，自由攝食、飲水。實驗結(jié)束后，采用脊椎脫臼法處死小鼠，本實驗所有操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》和上海交通大學實驗動物福利和倫理相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥物與試劑 薯蕷皂苷原料藥（海純優(yōu)生物科技有限公司，批號：180704，純度：≥98%）；氯化鈉注射液（齊魯制藥有限公司，批號：20180911，規(guī)格：500 mL∶450 mg）；CFA（內(nèi)含減毒結(jié)核分枝桿菌H37RA（美國Sigma公司，批號：170902）；百日咳毒素（美國Sigma公司，批號：P7208）；兔抗小鼠MBP多克隆抗體（上海澤葉生物科技有限公司，批號：181207）；兔抗小鼠抗離子化鈣結(jié)合適配分子1（IBA-1）多克隆抗體（日本W(wǎng)AKO公司，批號：180922）；兔抗小鼠抗神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP，批號：SC201809）、IFN-γ（批號：SC201294）、白細胞介素-4（IL-4，批號：SC201502）、IL-17（批 號：SC201607）、IL-22（批號：SC201711）、Nod樣受體蛋白-3（NLRP-3，批號：SC201609）、NF-κB多克隆抗體（批號：SC201602）（美國Santa Cruz公司）；β-actin抗體（美國Santa Cruz公司，批號：SC201801）；Alexa Fluor488/568/594結(jié)合生物素標記的羊抗小鼠IgG二抗（美國Invitrogen公司，批號：A11029）；抗CD4單克隆抗體（武漢生物制品研究所公司，批號：180922）；抗小鼠F4/80抗體（美國Abcam公司，批號：ab204451）；抗小鼠Hinstone H3抗體（北京百奧萊博科技有效公司，批號：181108）；IFN-γ（批號：191108）、IL-4（批 號：180911）、IL-17（批號：191220）、IL-22（批號：180723）、NLRP-3酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（批號：180711）（南京森貝伽生物科技有限公司）；胎牛血清、結(jié)晶紫染液、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）染液（美國Sigma公司）；蘇木精-伊紅（HE）染液（上海實驗試劑有限公司）；蛋白裂解液、胞質(zhì)或核蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、ECL染色試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；固藍（luxol fast blue，LFB）染液（上海經(jīng)科化學科技有限公司）；SDS緩沖液（上海榕柏生物技術(shù)有限公司公司）；Trans AMTM NF-κB p65活性檢測試劑盒（美國Active Motif公司，批號：521455deo）；其余試劑均為分析純，水為滅菌注射用水。

1.3 主要儀器ELX808型酶標儀（美國BioTek公司）；CM1950型冷凍切片機（北京格美勝達醫(yī)療設備有限公司）；IX51型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；CX43型光學顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]；JIDI-16R型高速冷凍離心機（廣州吉迪儀器有限公司）；Odyssey 9120雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器（美國LICOR公司）；680型全自動酶標儀（美國BIO-RAD公司）。

1.4 造模與分組 所有小鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為對照組、模型組、薯蕷皂苷低劑量組、薯蕷皂苷高劑量組，每組10只。除對照組外，其余小鼠參考練高建等[9]的研究建立EAE模型：取MBP 15 mg，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）5 mL稀釋，得質(zhì)量濃度為3 mg/mL的MBP溶液，再將同體積的CFA（內(nèi)含減毒結(jié)核分枝桿菌H37RA）與之混合。將上述混合溶液于4℃下進行乳化，得乳化液。于小鼠脊柱段兩側(cè)任意2點皮下注射乳化液0.2 mL（內(nèi)含MBP 300μg）進行免疫，并于免疫當日同時腹腔注射百日咳毒素0.5 mL（即200 ng/只）以復制EAE模型。取造模小鼠脊髓組織進行HE染色，若出現(xiàn)脊髓血管周圍炎性細胞浸潤、白質(zhì)脫髓鞘等癥狀，提示造模成功。

1.5 實驗給藥 薯蕷皂苷溶液的配制以生理鹽水為溶劑，劑量參照人臨床常用劑量的5、10倍并通過人與小鼠的體質(zhì)量換算而得。于造模完成當日（即為第0天）起，薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠按0.1 mL/10 g腹腔注射相應藥物，劑量分別為60、120 mg/kg；對照組和模型組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，每日中午給藥，1次/d，連續(xù)20 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 一般情況及神經(jīng)功能評分 每日由同一研究者觀察各組小鼠進食、飲水、排便、活動度、體質(zhì)量等一般情況，并對小鼠神經(jīng)功能進行評估。參照文獻[3]進行評分，0分：無明顯異常；1分：尾巴癱瘓；2分：共濟失調(diào)，后肢麻痹性癡呆；3分：雙后肢癱瘓；4分：四肢癱瘓；5分：瀕死狀態(tài)或死亡。分別記錄造模前及造模后第5、10、15、20天各組小鼠的體質(zhì)量及神經(jīng)功能評分情況。

1.6.2 血清炎癥因子水平 于造模后第20天，腹腔注射10%水合氯醛溶液（4 mL/kg）進行麻醉，于小鼠眼球取血并分離血清。采用ELISA法以酶標儀于450 nm波長處檢測各組小鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-22、NLRP3水平，嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

1.6.3 組織形態(tài)學觀察 于取血后處死各組小鼠，取出脊髓組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，使用冷凍切片機切片（厚度約16μm），經(jīng)HE染色后使用光學顯微鏡觀察各組小鼠脊髓組織中免疫細胞的浸潤情況（浸潤細胞呈藍紫色）；經(jīng)LPB染色后使用光學顯微鏡觀察其脊髓組織脫髓鞘情況（髓鞘呈藍白色）。

1.6.4 脊髓組織中CD3、F4/80、GFAP、IBA-1蛋白表達 采用免疫熒光染色法檢測。取“1.6.3”項下脊髓組織切片，用PBS洗滌2次，用3%過氧化氫孵育20 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。隨后用5%胎牛血清阻斷1 h，分別加入CD3、F4/80、GFAP、IBA-1抗體（稀釋度均為1∶200），于4℃下孵育過夜；經(jīng)PBS洗滌3次后，于室溫下加入Alexa Fluor 488/568/594結(jié)合生物素標記的IgG二抗（稀釋度為1∶500），室溫孵育1～2 h；經(jīng)PBS洗滌3次，用DAPI染色后，以中性樹脂封片，使用熒光顯微鏡觀察CD3、F4/80、GFAP、IBA-1的表達情況（根據(jù)其綠色/紅色熒光強弱來判定其表達強弱）。上述試驗重復3次。

1.6.5 脊髓組織中炎癥蛋白（IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-22、NLRP3、NF-κB及p-NF-κB）的表達水平 采用Western blotting法檢測。取各組大鼠脊髓組織適量，勻漿后，加入蛋白裂解液提取細胞的總蛋白，分別使用胞質(zhì)或核蛋白提取試劑盒提取細胞的胞漿或胞核蛋白，冰上裂解25 min后，于4℃下以1 000 g離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至EP管中，加入SDS緩沖液適量，煮沸5 min使蛋白變性。取變性后的蛋白進行SDS-PAGE，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應一抗（稀釋度均為1∶500），4℃孵育過夜，用TBST溶液清洗5 min×3次；隨后加入二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h，用TBST溶液清洗5 min×3次。經(jīng)ECL顯色后，使用Odyssey 9120雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參（β-actin或Histone 3）的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量。上述試驗重復3次。

1.6.6 NF-κB p65與DNA結(jié)合活性檢測 按“1.6.4”項下方法提取各組小鼠脊髓組織的核蛋白，參考Trans AMTM NF-κB p65活性檢測試劑盒說明書，使用酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度值，其吸光度值越高，表示NF-κB p65與DNA結(jié)合活性越強。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析或重復測量方差分析，兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠的一般情況 對照組小鼠生存狀態(tài)良好，食量、活動和大小便均未見異常，造模前后的神經(jīng)功能評分均為0分；模型組小鼠自造模后第10天起出現(xiàn)EAE癥狀，如疲憊、后肢無力、尾拖地等，其體質(zhì)量（造模后第10～20天）明顯減少，神經(jīng)功能評分（造模后第10～20天）明顯升高（P＜0.05）。薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠上述癥狀均有不同程度的改善，薯蕷皂苷高劑量組小鼠體質(zhì)量（造模后第10～20天）明顯增加，且薯蕷皂苷高劑量組明顯高于薯蕷皂苷低劑量組；薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠神經(jīng)功能評分（造模后第10～20天）均明顯降低，且薯蕷皂苷高劑量組明顯低于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見表1~2、圖1~2）

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

注：F時間主效應=23.517，P時間主效應=0.000；F分組主效應=21.326，P分組主效應=0.000；F交互效應=17.218，P交互效應=0.000；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與薯蕷皂苷低劑量組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg） 造模前 造模后5 d造模后10 d造模后15 d造模后20 d F P對照組 10 - 22.09±7.21 22.62±7.82 22.98±8.13 23.41±7.99 23.65±8.14 0.129 0.887模型組 10 - 23.82±8.43 21.82±8.12 20.35±7.09a 18.63±6.58a 18.15±5.66a 7.213 0.003薯蕷皂苷低劑量組 10 60 22.09±7.95 21.67±7.11 21.02±6.84 19.02±6.73 18.94±5.82 6.490 0.005薯蕷皂苷高劑量組 10 120 23.40±8.45 22.42±7.65 22.31±6.93bc 22.97±6.67bc 23.14±7.65bc 0.074 0.929 F 0.162 0.056 4.238 5.641 8.284 P 0.851 0.946 0.025 0.009 0.002

圖1 各組小鼠體質(zhì)量比較的交互效應輪廓圖

圖2 各組小鼠神經(jīng)功能評分比較的交互效應輪廓圖

2.2 各組小鼠血清炎癥因子水平比較 與對照組比較，模型組小鼠血清IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3水平均明顯升高（P＜0.05），而IL-4水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠血清IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3水平均明顯降低（P＜0.05），且薯蕷皂苷高劑量組血清IFN-γ、IL-17、NLRP3明顯低于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）；薯蕷皂苷低、高劑量組血清IL-4水平均明顯升高（P＜0.05），且薯蕷皂苷高劑量組明顯高于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組小鼠血清炎癥因子水平比較（±s，pg/mL）

表3 各組小鼠血清炎癥因子水平比較（±s，pg/mL）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與薯蕷皂苷低劑量組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg） IFN-γ IL-4 IL-17 IL-22 NLRP-3對照組 10 - 11.23±1.09 36.92±2.77 16.73±2.26 17.58±4.36 19.75±2.46模型組 10 - 33.73±4.81a 19.83±1.25a 31.22±2.47a 65.73±7.33a 31.25±3.41a薯蕷皂苷低劑量組 10 60 21.73±2.35b 26.48±2.24b 21.36±1.97b 21.09±5.13b 23.47±3.59b薯蕷皂苷高劑量組 10 120 15.72±3.11b c 30.91±2.47b c 15.09±2.48b c 22.15±5.22b c 20.93±2.44b c

2.3 各組小鼠脊髓組織形態(tài)學變化 對照組未見明顯的單核細胞浸潤，模型組可見大量的單核細胞浸潤，薯蕷皂苷低、高劑量組單核細胞浸潤明顯減少。LFB染色結(jié)果顯示，對照組未見明顯的脊髓脫髓鞘變化，模?型組可見明顯的脫髓鞘改變，薯蕷皂苷低、高劑量組脫髓鞘改變明顯減少。（見圖3）

圖3 各組小鼠脊髓組織形態(tài)學

表2 各組小鼠神經(jīng)功能評分比較（±s，分）

表2 各組小鼠神經(jīng)功能評分比較（±s，分）

注：F時間主效應=32.471，P時間主效應=0.000；F分組主效應=42.362，P分組主效應=0.000；F交互效應=36.283，P交互效應=0.000；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與薯蕷皂苷低劑量組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量（mg/kg）造模前 造模后5 d造模后10 d造模后15 d造模后20 d F P對照組 10 - 0 0 0 0 0模型組 10 - 0 0 0.22±0.15a 2.64±0.66a 3.02±0.72a 70.869 0.000薯蕷皂苷低劑量組 10 60 0 0 0.23±0.17b 1.02±0.53b 1.95±0.61b 32.610 0.000薯蕷皂苷高劑量組 10 120 0 0 0.09±0.03b c 0.17±0.09b c 0.97±0.49b c 28.519 0.000 F 16.499 65.193 27.896 P 0.000 0.000 0.000

2.4各組小鼠脊髓組織中CD4、F4/80、GFAP、IBA-1蛋白表達比較 與對照組比較，模型組小鼠脊髓組織中CD4、F4/80、GFAP、IBA-1蛋白表達均明顯增加；與模型組比較，薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠脊髓組織中CD4、F4/80、GFAP、IBA-1蛋白表達均有不同程度的減少。（見圖4）

圖4 各組小鼠脊髓組織中CD4、F4/80、GFAP、IBA-1表達比較（×20，小方格中為×200，比例尺為50μm）

2.5 各組小鼠脊髓組織中炎癥蛋白表達比較 與對照組比較，模型組小鼠脊髓組織中IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3蛋白的相對表達量均明顯升高（P＜0.05），而IL-4的相對表達量明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠脊髓組織中IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3的相對表達量均明顯降低（P＜0.05），且薯蕷皂苷高劑量組低于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）；而IL-4的相對表達量均明顯升高（P＜0.05），且薯蕷皂苷高劑量組高于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見圖5、表4）

表4 各組小鼠脊髓組織中IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3蛋白表達比較（±s）

表4 各組小鼠脊髓組織中IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量（mg/kg）IFN-γ IL-4 IL-17 IL-22 NLRP3對照組 10 - 0.49±0.12 1.98±0.15 0.42±0.05 0.51±0.11 0.62±0.07模型組 10 - 0.85±0.12a 0.72±0.08a 0.87±0.11a 0.92±0.13a 1.25±0.12a薯蕷皂苷低劑量組 10 60 0.54±0.21b 1.16±0.10b 0.52±0.11b 0.65±0.09b 1.01±0.05b薯蕷皂苷高劑量組 10 120 0.39±0.06b c 1.78±0.08b c 0.38±0.05b c 0.56±0.06b c 0.87±0.07b c

圖5 各組小鼠脊髓組織中IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3蛋白表達電泳圖

2.6 各組小鼠脊髓組織中NF-κB表達比較 與對照組比較，模型組小鼠脊髓組織細胞核中NF-κB的相對表達量明顯升高（P＜0.05），細胞質(zhì)中NF-κB的相對表達量明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠脊髓組織細胞核中NF-κB的相對表達量均明顯升高（P＜0.05），且薯蕷皂苷高劑量組明顯高于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）；細胞質(zhì)中NF-κB的相對表達量均明顯降低（P＜0.05），且薯蕷皂苷高劑量組明顯低于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見圖6、表5）

圖6 各組小鼠脊髓組織中NF-κB蛋白表達電泳圖

表5 各組小鼠脊髓組織中NF-κB蛋白表達及DNA結(jié)合活性比較（±s）

表5 各組小鼠脊髓組織中NF-κB蛋白表達及DNA結(jié)合活性比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05

NF-κB蛋白表達 NF-κB p65與細胞核 細胞質(zhì) DNA結(jié)合的OD值對照組 10 - 0.45±0.11 1.21±0.18 0.18±0.03模型組 10 - 1.38±0.26a 0.34±0.05a 1.35±0.19a薯蕷皂苷低劑量組10 60 1.09±0.17b 0.69±0.12b 1.16±0.14b薯蕷皂苷高劑量組10 120 0.65±0.12b c 0.92±0.12b c 0.76±0.08b c組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量（mg/kg）

2.7 各組小鼠脊髓組織中NF-κB p65與DNA結(jié)合活性比較 與對照組比較，模型組小鼠脊髓組織細胞核中NF-κB p65與DNA結(jié)合的活性顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，薯蕷皂苷低、高劑量組小鼠NF-κB p65與DNA結(jié)合的活性均明顯降低（P＜0.05），且薯蕷皂苷高劑量組明顯低于薯蕷皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見表5）

3 討 論

MS是一種慢性自身免疫性中樞炎性疾病，伴有大腦神經(jīng)細胞大量損傷和死亡[10]。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，與免疫炎癥、氧化應激、細胞增殖和分化等密切相關(guān)[11]。NF-κB激活在MS發(fā)病中有重要意義，阻斷NF-κB功能可能是防治MS的有效手段。IFN-γ、IL-17、IL-22屬于促炎細胞因子，而IL-4為抗炎細胞因子，有研究發(fā)現(xiàn)MS患者血清中IFN-γ、IL-17、IL-22表達水平升高，而IL-4水平下降[12-13]。NF-κB可以調(diào)控IFN-γ、IL-17、IL-22、IL-4的表達[14-15]。NLRP3是炎癥小體，NF-κB可以靶向NLRP3而調(diào)節(jié)機體免疫炎癥[16]。膠質(zhì)細胞激活后可引起炎癥反應，使組織中炎癥因子水平升高，促進MS的發(fā)生發(fā)展。

本研究建立了EAE小鼠模型對MS進行研究。EAE是以特異性致敏的CD4+T細胞介導為主的，以及以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小血管周圍出現(xiàn)單個核細胞浸潤及髓鞘脫失為特征的自身免疫性疾病，是模擬MS的理想動物模型。本研究采用MBP+CFA對小鼠進行免疫，約10 d后小鼠出現(xiàn)明顯的EAE癥狀，如精神疲憊、后肢無力、尾拖地和體質(zhì)量下降等，且模型組神經(jīng)功能評分及體質(zhì)量均明顯低于對照組，且小鼠脊髓出現(xiàn)了典型的脊髓損傷的病理改變，脊髓損傷區(qū)域出現(xiàn)大量免疫細胞，且星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP和小膠質(zhì)細胞標志物IBA-1明顯激活，提示造模成功，這與既往報道類似[4]。同時，與對照組比較，模型組小鼠血清IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3水平均明顯升高，而IL-4水平明顯降低。HE染色結(jié)果顯示，模型組可見大量的單核細胞浸潤。LFB染色結(jié)果顯示，模型組可見明顯的脫髓鞘改變，同時，可見脊髓組織中CD4、F4/80、IBA-1、GFAP，IFN-γ、IL-17、IL-22、NLRP3蛋白的相對表達量均明顯升高，IL-4的相對表達量明顯降低；模型組脊髓組織細胞核中NF-κB的相對表達量明顯升高，細胞質(zhì)中NF-κB的相對表達量明顯降低，NF-κB p65與DNA結(jié)合的活性明顯增加。進一步驗證了MS脊髓組織中出現(xiàn)了典型的自身免疫炎癥反應，而這一過程與NF-κB的激活，并促進炎癥因子的大量釋放有關(guān)。

薯蕷皂苷屬于甾體皂苷，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤和抗凋亡等活性[17-18]。既往研究顯示，薯蕷皂苷可以通過抑制NF-κB而改善酒精性肝纖維化、缺血性腦卒中、肝臟缺血再灌注損傷等病理改變。本研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷可顯著改善MS小鼠的一般情況和神經(jīng)功能評分，且可以減少脊髓損傷區(qū)域單核細胞浸潤和脊髓脫髓鞘的發(fā)生。中樞免疫炎癥性損傷是MS的重要發(fā)病機制之一[19]，本研究發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷干預后脊髓組織中活化的T細胞和巨噬細胞明顯減少，并且星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的活化受到抑制，提示薯蕷皂苷可以通過改善中樞免疫炎癥損傷而發(fā)揮治療MS的作用。

本研究中薯蕷皂苷干預后實驗性變態(tài)反性腦脊髓炎模型小鼠血清及脊髓組織中相關(guān)炎癥因子水平明顯降低，且NF-κB向胞核轉(zhuǎn)移明顯減弱，故我們推測薯蕷皂苷可能是通過阻斷NF-κB的胞核轉(zhuǎn)移途徑來影響炎癥蛋白表達，從而發(fā)揮保護EAE小鼠的作用。

綜上所述，薯蕷皂苷可以改善EAE小鼠脊髓病理損傷，并且能夠改善外周血和脊髓組織中炎癥因子表達，其機制可能是抑制NF-κB從細胞質(zhì)移位至細胞核，進而抑制NF-κB激活。本實驗屬于初步研究，存在一定不足，如未設立陽性對照藥物組，在后續(xù)實驗中將進一步開展研究。