王敏思，柳 雙，朱文博，宋 洋

（天津師范大學 天津市動植物抗性重點實驗室 天津 300387）

鏈霉素（Streptomycin，STR）是一種氨基酸糖苷類抗生素藥物[1]，對結核桿菌和許多革蘭陰性桿菌有較強的抗菌作用[2]，是目前我國畜牧業(yè)和水產業(yè)常用的藥物之一[3]。在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中，鏈霉素被大量、頻繁地超劑量用于奶牛乳腺炎的治療，由此導致牛奶中高濃度的鏈霉素藥物滯留和蓄積[4]，并以食物鏈方式進入人體，危害人體健康[5]。鏈霉素有嚴重的腎毒性和耳毒性，長期攝入有鏈霉素殘留的食物會造成腎臟及前庭功能和耳蝸神經永久性損傷[6]。食物中殘留的鏈霉素可能會造成過敏反應，甚至引起休克[7]。此外，鏈霉素還具有潛在的致畸作用[8]。臨床上，鏈霉素逐漸被其它類似藥物所取代，然而，在畜牧業(yè)和水產業(yè)仍在繼續(xù)使用[9]，因此建立準確可靠、簡便的檢測方法很有必要。

目前，鏈霉素在我國及日本等多個國家（地區(qū)）均允許使用，鑒于其對人體的危害性，世界各國對其殘留限量均有規(guī)定，其中歐盟國家及日本肯定列表中均規(guī)定牛奶中鏈霉素的最高殘留限量為200 μg/kg[10-11]，加拿大為125 μg/kg[12]。國內外定量鏈霉素殘留的檢測方法包括傳統(tǒng)的高效液相色譜法（HPLC）[13]、液相色譜-串聯質譜法（HPLCMS）[14-17]等儀器檢測方法，以及酶聯免疫法（ELISA）[18]、適配體傳感器（Aptamer sensor，AS）[19]、試紙條（Test strip，TS）[20]等方法。HPLC-MS 可定性、定量分析，然而昂貴的儀器和專業(yè)的操作程序不利于大量樣品以及現場檢測。ELISA 是成熟的快速檢測手段，廣泛用于食源性危害物的快速檢測。AS 建立所需時間較長，保存時間短。TS 檢測時間短，準確度低。表1為近年來牛奶中鏈霉素殘留的主要檢測方法。

表1 本研究與以往鏈霉素檢測方法比對Table 1 Comparison of the study with previous streptomycin detection methods

表面等離子體共振傳感器（Surface plasmon resonance，SPR）是一種建立在免疫學基礎上，利用物理光學現象的檢測方法。由于SPR 對小分子物質的相應信號較低和非特異性吸附的影響，局限了其在食品安全領域的發(fā)展?；谏锼?親和素（Biotin-avidin system，BAS）的親和特性與SPR 結合[21]，可以提高抗原抗體的親和性，從而提高相應信號和檢測的準確性[22-23]。與傳統(tǒng)SPR 相比，更具優(yōu)勢。本研究將活化酯法合成的生物素化抗原結合在偶聯鏈霉親和素的SA 芯片，優(yōu)化了抗體濃度、再生液等條件，建立BAS-SPR 鏈霉素殘留高效檢測方法，對20 例牛奶樣品進行測定，該方法較既往的快速檢測方法，靈敏、準確且可再生多次[24-25]?；贐AS-SPR 的信號放大策略建立的快速檢測方法可為實際樣品中STR 的檢測提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

硫酸鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、氯霉素、硫酸新霉素、雙氫鏈霉素、妥布霉素、（+）-生物素N-羥基琥珀酰亞胺（BNHS，≥98%），美國Sigma Aldrich 公司；10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）緩沖液、不同pH 值的甘氨酸（Gly）-HCl（10 mmol/L）、50 mmol/L 氫氧化鈉（NaOH）溶液、500 mmol/L 氯化鈉（NaCl）溶液、碳酸鈉（Na2CO3）緩沖溶液、二甲基甲酰胺（DMF），Harmonia Testing Technology Ltd.公司（中國天津）；牛奶樣品，天津師范大學超市；抗鏈霉素抗體（STR-Ab）6 mg/mL，天津師范大學動植物抗性重點實驗室。

BIAcore 3000 儀器，美國GE 公司；SA 芯片，美國Biosensing Instrument 公司；HPLC-MS，美國Thermofinnegan 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 BNHS-STR-OVA 的制備 直接交聯法[26]合成的STR-OVA，用碳酸鈉緩沖溶液（pH 9.6）稀釋為1 mg/mL，與50 μL 在DMF 中的20 mg/mL 的BNHS 混合，將該反應混合物室溫攪拌4 h，PBS 在4 ℃透析3 d，該抗原BNHS-STR-OVA 的質量濃度為0.8 mg/mL，于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BNHS-STR-OVA 在SA 芯片表面的固定試驗采用SA 芯片進行固定化。生物素化抗原與芯片上的鏈霉親和素結合即將抗原穩(wěn)定的固定在芯片表面。10 mmol/L，pH 7.0 的PBS 作為整個反應中的流動相，流速為10 μL/min，對芯片表面進行沖洗，固定抗原時，流速5 μL/min，注射時間30 s。

1.2.3 測定過程 依據免疫抑制原理，將構建BAS-SPR 免疫傳感器應用于目標物STR 的定量分析。一系列質量濃度的STR-Ab（6.0，7.5，10.0，15.0，30.0，60.0，80.0，100.0 mg/L）分別注入儀器中，流速30 μL/min，注射時間6 min，解離時間180 s，優(yōu)化最佳抗體質量濃度。每個質量濃度重復3 次。PBS 代替抗體，作為對照。

將90 μL 一系列質量濃度的STR-PBS 溶液（0.1，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，64.0 μg/L）分別 與抗體等體積混合后注入儀器中，反應時間300 s。每個質量濃度注射3 次，根據響應值的變化，以標品質量濃度的對數為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制相應的SPR 標準曲線圖。

式中，B0——STR 質量濃度為0 的響應值；Bx——STR 質量濃度為x的響應值。

1.2.4 優(yōu)化再生液 對再生液進行優(yōu)化，選擇pH 2.0 的甘氨酸-鹽酸（Gly-HCl）、pH 2.2 的Gly-HCl、500 mmol/L 的NaCl 溶液、2.5 mmol/L 的NaOH溶液4 種再生液進行優(yōu)化，流速10 μL/min，觀察并比較反復測定過程中SPR 響應值的變化，并對結果進行比較，最后選擇最佳的再生液。

1.2.5 方法特異性評價 本試驗選擇的STR 結構類似物為雙氫鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、氯霉素、硫酸新霉素和妥布霉素。所有結構類似物用PBS 稀釋至500，100，20，5，1，0.2 μg/L。用IC50計算交叉反應性百分比（CR%）：

式中，IC50——測試化合物的濃度，其中相應的吸光度等于最大吸光度的一半。

1.2.6 樣品前處理及添加回收試驗 SPR 法：取5 mL 牛奶樣品于10 mL 離心管中，8 000 r/min 離心10 min，取上清液用冰醋酸調節(jié)pH 值至4.6，振蕩混勻后5 000 r/min 離心5 min，取上清液。處理后的樣品液體儲存于棕色小瓶中-20 ℃?zhèn)溆?，用緩沖液稀釋后過0.22 μm 水系濾膜，即可進行檢測。

HPLC-MS 法：參考標準方法GB/T 22969-2008[27]，經羧酸型固相萃取柱后用甲酸和庚烷磺酸鈉溶液定容至2.0 mL，混勻后過0.20 μm 濾膜供液相色譜串聯質譜測定。于牛奶樣品中添加STR 標準品，最終質量濃度為20，40，80 μg/L，分別通過SPR 和HPLC-MS 測定回收率。

2 結果與分析

2.1 SPR 芯片表面的修飾及抗原固定

SPR 試驗常使用葡聚糖修飾的CM5 芯片，或是便于自組裝的裸金芯片。這兩種芯片均需要對綁定探針進行預富集和活化，過程較為繁瑣。本試驗采用芯片修飾有鏈霉親和素的SA 芯片，利用其與生物素（BNHS）的高親和性，在SPR 芯片表面形成生物素-親和素-抗原的探針。圖1是BASSPR 傳感器敏感探針制備示意圖。

圖1 抑制型BAS-SPR 傳感器探針制備原理Fig.1 Preparation principle of inhibitory BAS-SPR sensor probe

圖2為BNHS-STR-OVA 在SA 芯片表面結合情況。上樣量2 μg。第1 次上樣，響應值顯著上升，第2 次上樣，響應值上升幅度較小，第3 次上樣，響應值無明顯變化，說明芯片表面SA 的結合位點基本達到飽和狀態(tài)，停止上樣。BNHS-STROVA 共注射6 μg，因此選擇6 μg 為BNHS-STROVA 的最佳固定量，BNHS-STR-OVA 與芯片表面SA 的結合響應值為1 435.4 RU。

圖2 芯片表面BNHS-STR-OVA 的結合Fig.2 Binding of BNHS-STR-OVA on the chip surface

2.2 STR-Ab 質量濃度優(yōu)化

抗體濃度在很大程度上影響了免疫測定的穩(wěn)定性和靈敏度，是免疫分析方法中需要優(yōu)化的一個重要參數。將STR-Ab（6.0，7.5，10.0，15.0，30.0，60.0，80.0，100.0 mg/L）分別與結合在芯片表面的BNHS-STR-OVA 進行結合，結果如圖3所示，隨著抗體質量濃度的增加，響應值不斷升高；60 mg/L 和80 mg/L 抗體質量濃度的響應值分別為148.3 RU 和152.6 RU，幾乎接近，說明抗原與抗體的結合基本達到飽和狀態(tài)；這2 個質量濃度3 次進樣響應值的變異系數（Coefficient of variation，CV%）分別為5.06，6.53。這可能是由于高質量濃度的抗體會降低再生效果，造成檢測的穩(wěn)定性降低。因此，為節(jié)約抗體，提高穩(wěn)定性，確定抗體添加質量濃度為60 mg/mL。

圖3 不同質量濃度的抗體與BNHS-STR-OVA 結合Fig.3 Binding of different concentrations of antibodies to BNHS-STR-OVA

2.3 再生條件的確定

再生液需要洗去結合的抗體，并保留結合在芯片上的抗原穩(wěn)定，適當的再生溶液決定了試驗的穩(wěn)定性及芯片的使用壽命。鏈霉素堿性條件下不穩(wěn)定，為保護芯片上的抗原，試驗選擇較為溫和的再生液進行優(yōu)化，分別為50 mmol/L NaCl，pH 2.0 Gly-HCl，pH 2.2 Gly-HCl 及2.5 mmol/L NaOH溶液，根據4 次結合反應和基準響應值變化進行再生效果比較。由圖4顯示的結果表明：50 mmol/L NaCl 溶液不能完全洗去抗體，因此再生時出現基準響應值上升，結合相應值下降；2.5 mmol/L NaOH 溶液再生結果表明，即使低濃度的堿性溶液，也會影響鏈霉素穩(wěn)定，從而造成抗原損失；對比pH 2.0 Gly-HCl 和pH 2.2 Gly-HCl 溶液的再生效果，pH 2.2 Gly-HCl 溶液的再生信號穩(wěn)定性更佳。通過試驗可知，采用pH 2.2 Gly-HCl 溶液可使BAS-SPR 敏感膜芯片重復再生90次，表現出良好的穩(wěn)定性和再生性。

圖4 再生液優(yōu)化結果Fig.4 The results of regenerant optimization

2.4 標準曲線的確定

基于分析物與偶聯抗原間的競爭性反應原理，將抗體STR-Ab（60 mg/L）與等體積濃度梯度的STR 混合后注入芯片，BNHS-STR-OVA 分別與質量濃度為0.1，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，64.0 μg/L 的STR 競爭抗體，根據抗原抗體結合響應值與STR 濃度相關聯繪制標準曲線。圖5是不同質量濃度STR 與抗原競爭抗體的SPR 結合曲線，由此繪制出STR 的BAS-SPR 標準工作曲線，如圖6所示，STR 線性檢測范圍是0.4～32.0 μg/L，IC50為1.65 μg/L，IC15為0.37 μg/L，檢測時間為10 min。

圖5 STR 與BNHS-OVA-STR 競爭試驗結果Fig.5 Results of competition between STR and BNHS-OVA-STR

圖6 鏈霉素BAS-SPR 傳感器檢測標準工作曲線Fig.6 Standard curve for BAS-SPR sensor detection of STR

2.5 特異性評價

試驗選用了6 種STR 結構及功能類似物分別進行BAS-SPR 測試，測定交叉反應率（CR%）。由表2結果可以看出，該抗體可以特異性的識別鏈霉素，且與雙氫鏈霉素有極高的交叉反應（98.79%），然而與其它氨基糖苷類和結構類似的抗生素藥物的交叉反應率小于0.01%。由于雙氫鏈霉素是鏈霉素的衍生物，與鏈霉素僅相差一個基團，與鏈霉素有相似的生理功能，在國標中也將兩者統(tǒng)一計量[28]，因此在檢測時可作為同一種物質檢測。

表2 各化合物與抗體的交叉反應率和IC50 值Table 2 Cross reaction rate and IC50 value of each compound and antibody

2.6 樣品檢測

2.6.1 樣品基質影響及消除 牛奶的基質影響主要包括蛋白質和脂肪。對于包含蛋白質和脂肪的牛奶樣品，可以通過簡單地離心，稀釋和超濾將基質干擾降至最低。取牛奶樣品進行處理，將獲得的樣品提取液經PBS 稀釋0，2，4，8，16 倍后的溶液作為STR 標品的稀釋液，經BAS-SPR 檢測獲得的抑制率曲線即為樣品的基質曲線，結果如圖7所示，樣品稀釋8 倍獲得的基質曲線與校正曲線幾乎重合。由此可知，稀釋8 倍基本可以消除基質影響。

圖7 牛奶樣品中基質消除的優(yōu)化曲線Fig.7 Optimization curve of matrix elimination in milk samples

2.6.2 添加回收試驗 在牛奶中添加5.0，20.0，30.0 μg/L 的STR 標準品，通過SPR 和HPLC-MS檢測添加回收率。如表3所示，SPR 回收率為96.6%～101.0%，HPLC-MS 回收率為95.6%～99.4%，SPR 相對于HPLC-MS 添加回收率較高。說明SPR 方法準確可靠，對牛奶樣品中STR 的檢測提供了一種高效、靈敏的檢測方法。

表3 SPR、HPLC-MS 法檢測STR 的3 個質量濃度水平下樣品的回收率（n = 3）Table 3 SPR and HPLC-MS method for the recovery of samples at three levels of STR（n=3）

3 結論

本研究構建了BAS-SPR 增敏抑制型免疫傳感器并應用于牛奶中STR 的快速檢測。將BNHS-STR-OVA 固定于SA 芯片表面形成BAS-Ag 敏感膜，簡化了固定化的活化過程，有效提高了響應值和芯片的穩(wěn)定性。敏感膜上的抗原作為探針，依據免疫抑制原理，對目標物STR 進行定量分析。經過對固定化條件、抗體濃度、再生液等條件的優(yōu)化，最終確定：抗體濃度為60 mg/L；固定化緩沖液為pH 7.0 PBS 緩沖液；芯片再生液為pH 2.2 Gly-HCl。得到競爭抑制型BAS-SPR 對STR 的方法檢出限（IC15）為0.37 μg/L；靈敏度（IC50）為1.65 μg/L；整個檢測過程用時10 min；芯片可重復使用90 次以上。3 個添加量（5，20，30 μg/L）回收率為96.6%～101.0%。該方法具有快速、樣品處理方法相對簡單，所用時間短、靈敏、檢測限低等優(yōu)點，在大量樣品的痕量檢測中具有優(yōu)勢。