毛海萍，葉 繁，趙巧靈，金仁耀，吳佳佳*，戴志遠(yuǎn)

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州 310012 2 舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 浙江舟山 316000）

抗生素被廣泛用于人類、畜牧業(yè)及魚類養(yǎng)殖的疾病預(yù)防和治療，抗生素誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素耐藥基因（Antibiotic resistant genes，ARGs）已成為一種新型環(huán)境污染物，其污染分布廣泛且危害持久。ARGs 借助質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動(dòng)的基因元件在不同的細(xì)菌菌群間發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，同時(shí)，菌體裂解釋放的ARGs 能夠被其它細(xì)菌再次捕獲、整合，從而使其在微生態(tài)環(huán)境中遷徙、污染[1]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖是中國農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)中發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一，2018年中國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量超5 000 萬t（占水產(chǎn)總量的78%），為居民提供了豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白供給[2]。然而，養(yǎng)殖水環(huán)境抗生素污染引起的水產(chǎn)品ARGs 污染問題也日趨嚴(yán)重而不容忽視。醫(yī)療及畜牧養(yǎng)殖廢水中抗性基因或耐藥菌會(huì)通過污水排放、水循環(huán)進(jìn)入養(yǎng)殖水體，造成養(yǎng)殖環(huán)境抗生素和ARGs 本底水平升高[3]。同時(shí)，水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中大量投放的抗生素進(jìn)一步誘導(dǎo)ARGs 的產(chǎn)生并促進(jìn)其轉(zhuǎn)移[4]，養(yǎng)殖水體環(huán)境正在逐漸成為一個(gè)巨大的ARGs 儲(chǔ)存庫。張瑞泉等[5]測(cè)定魚塘養(yǎng)殖環(huán)境中11 種四環(huán)素類耐藥基因（tetA，tetB，tetC，tetD，tetA，tetM，tetO，tetQ，tetS，tetW，tetX），3 種磺胺類耐藥基因（sul1，sul2，sul3），2 種整合酶基因（int1，int2）的分布特征及豐度水平，結(jié)果顯示：14 種抗生素耐藥基因及2 種整合酶基因在魚塘養(yǎng)殖環(huán)境中廣泛檢出，表明養(yǎng)殖魚塘及污水環(huán)境廣泛受到抗生素耐藥基因的污染。馬辰婕等[6]發(fā)現(xiàn)與細(xì)菌多重耐藥性快速傳播相關(guān)的復(fù)合I 型整合子在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中并不少見，且存在于多種細(xì)菌中。水產(chǎn)品中攜帶抗生素耐藥基因的耐藥菌株的種類和數(shù)量日益增加，不僅影響抗生素的治療效果，抗生素耐藥基因向環(huán)境和食物鏈的遷移，也對(duì)環(huán)境及人類健康造成極大威脅[7]。

本研究選取杭州市菜場(chǎng)銷售的鯽魚、黃顙魚、大黃魚和沼蝦4 種常見水產(chǎn)品，選擇水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的磺胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺、喹諾酮類、氯霉素類幾種抗生素對(duì)應(yīng)的抗性基因作為研究對(duì)象，對(duì)其常見基因tetA、sul2、blaPSE、cmlA、qnrS、aac（6'）-Ib、intⅠ1 進(jìn)行檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量，以水產(chǎn)品攜帶細(xì)菌總DNA 為模板，探究其常見ARGs 和I 類整合子的數(shù)量及分布。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 陽性菌株 實(shí)驗(yàn)室分離出分別攜帶四環(huán)素耐藥基因tetA、磺胺類耐藥基因sul2、β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaPSE、氯霉素耐藥基因cmlA、喹諾酮類耐藥基因qnrS、氨基糖苷類耐藥基因aac（6'）-Ib、整合子基因intⅠ1 的陽性對(duì)照菌株。

1.1.2 樣品采集 沼蝦（40±5）g、鯽魚（100±10）g、黃顙魚（120±10）g、大黃魚（600±50）g，杭州市西湖區(qū)某菜市場(chǎng)。

1.1.3 主要試劑 LATaqDNA 聚合酶、100 bp DNA Ladder、大腸桿菌（E.coli）DH5α 感受 態(tài)細(xì)胞、TB Green Premix Ex Taq 聚合酶預(yù)混液、pTG19-T Vector 載體，大連Takara 生物公司；Safe Green 核酸染料，莫納生物科技有限公司；UNIQ-10 柱式瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

凝膠電泳儀、T100 型PCR 儀、Mini Opticon Monitor 3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國Bio-Rad 公司；BSA124S-CW 電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Fresco 21 型高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo Fisher 公司；Evolution 60s 紫外可見光分光光度計(jì)，美國Thermo 公司；LRH-150-S 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；MLS-3781L-PC 高壓蒸汽滅菌器，松下電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 目的基因片段擴(kuò)增 通過煮沸法裂解陽性菌菌體，提取DNA 模板。采用25 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系：1.5 μL 10×LA buffer（Mg2+plus），2 μL dNTP Mix（2.5 mmol/L），上、下游引物各1 μL，0.1 μL LATaq（5 U/μL），2 μL DNA 模板，17.4 μL ddH2O。tetA、sul2、blaPSE、cmlA、qnrS、aac（6'）-Ib、intⅠ1、16S rDNA 的引物序列見表1，由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)后，按照UNIQ-10 柱式微量瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒的說明書進(jìn)行DNA 純化和回收。

表1 目的基因的擴(kuò)增引物Table 1 The primers for selected genes

1.3.2 陽性質(zhì)粒的構(gòu)建 將目的基因tetA、sul2、blaPSE、cmlA、qnrS、aac（6'）-Ib、intⅠ1 分別連接到pTG19-T Vector 后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Escherichia coliDH5α，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

1.3.3 目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 以重組質(zhì)粒作為陽性模板建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線?？截悢?shù)的計(jì)算公式：拷貝數(shù)=（質(zhì)量/分子質(zhì)量）×6.02×1023。根據(jù)1A260nm=50 μg/mL 計(jì)算質(zhì)粒質(zhì)量濃度。

以起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)Ct值為縱坐標(biāo)，構(gòu)建各體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算曲線的R2值，擴(kuò)增效率E= [10（-1/slope）-1]×100%。獲得各耐藥基因和內(nèi)參基因16S rDNA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)粒濃度范圍為101～109拷貝/μL。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)滿足以下要求：相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，擴(kuò)增效率E為90%～110%[16]。

1.3.4 市售水產(chǎn)品菌體總DNA 提取 無菌條件下分別收集魚鰓、腸道、體表粘液或蝦線、蝦頭，搗碎后取10 g 樣品加至含90 mL 無菌生理鹽水的三角瓶中，充分搖勻，2 000 r/min 離心5 min，收集上清液，10 000 r/min 離心5 min，以500 μL 無菌水懸浮菌體沉淀后，沸水浴5 min，冰浴2 min，5 000 r/min 離心1 min，取上清為DNA 模板。

1.3.5 qPCR 反應(yīng) qPCR 反應(yīng)體系：10 μL TB Premix Ex Taq，引物各0.4 μL，2 μL DNA 模板，7.2 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)[17]。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。Ct 取31 為檢出限，即Ct 值大于30 時(shí)，判斷結(jié)果為陰性[18]。ARGs 的絕對(duì)拷貝數(shù)和內(nèi)參基因16S rDNA 絕對(duì)拷貝數(shù)的比值得到該基因的相對(duì)豐度，用來比較待測(cè)樣品中ARGs 的相對(duì)含量[19]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 通過Microsoft Excel 2007 和IBM SPSS Statistics 19 軟件分析處理數(shù)據(jù)，利用Origin 2017 制作圖表。采用Spearman 相關(guān)性分析目的基因之間的相關(guān)性。用SPSS 軟件進(jìn)行Duncan 單因素方差分析，顯著性水平設(shè)定為0.05，當(dāng)P＜0.05 時(shí)，即為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性重組子驗(yàn)證

PCR 擴(kuò)增陽性重組子中的目的基因片段后對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，且與NCBI 數(shù)據(jù)庫中對(duì)應(yīng)基因的同源性≥99%。篩選所獲的重組子均能用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

利用陽性重組子繪制的7 個(gè)ARGs 和16S rDNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線如表2所示。Ct 值與目的基因拷貝數(shù)之間的擴(kuò)增效率E在90.42%～106.23%之間，擴(kuò)增效率在qPCR 效率范圍內(nèi)（90%～110%），相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，一般滿足R2＞0.985 時(shí)，所得曲線即可被稱為合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)R2越接近1.00 時(shí)，則曲線越可信，說明所有曲線都有較好的精確度和重復(fù)性[20]。曲線的斜率在-3.1811～-3.5752 之間，滿足qPCR 試驗(yàn)的要求（-3.1～-3.59），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于5.1%。說明8條標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，可用于計(jì)算待測(cè)樣品中各基因的拷貝數(shù)。Ct 取31 為檢出限，已建立的qPCR 方法對(duì)blaPSE 的最低檢出限為6.6×104拷貝/μL，對(duì)其它6 種ARGs 的最低檢出限在11.5～202 拷貝/μL 之間。

表2 目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curve of selected genes

2.3 市售水產(chǎn)品耐藥基因的定量測(cè)定

利用本試驗(yàn)建立的qPCR 方法對(duì)市售沼蝦、鯽魚、黃顙魚、大黃魚中的ARGs 攜帶情況進(jìn)行定量分析。如圖1所示，6 種ARGs 在4 種水產(chǎn)樣品中均有檢出，基因拷貝數(shù)跨越6 個(gè)數(shù)量級(jí)，最小值為2.90×102拷貝/g（沼蝦樣品，喹諾酮耐藥基因aac（6'）-Ib），最大值為3.97×107拷貝/g（鯽魚樣品，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaPSE）。四環(huán)素耐藥基因tetA、磺胺類耐藥基因sul2 和β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaPSE 在所有樣品中都有較高的拷貝數(shù)。

圖1 市售水產(chǎn)品中ARGs 的絕對(duì)豐度Fig.1 The abundance of selected genes in samples

由于不同樣品攜帶微生物總量不同，為降低偏差，加入16S rDNA 作為內(nèi)參基因計(jì)算ARGs污染水平用相對(duì)豐度，如圖2所示。總體而言，4種水產(chǎn)樣品中各耐藥基因的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度存在高度一致性。6 種抗性基因在4 種水產(chǎn)樣品中均有檢出，說明ARGs 污染普遍存在于不同的食用水產(chǎn)品中。其中，部分耐藥如編碼β-內(nèi)酰胺酶的blaPSE、磺胺類耐藥基因sul2 和四環(huán)素耐藥基因tetA 具有較高的相對(duì)豐度，說明水產(chǎn)品源微生物攜帶此類耐藥基因的比例較高。

圖2 市售水產(chǎn)中ARGs 的相對(duì)豐度Fig.2 The relative abundance of ARGs in samples

本研究對(duì)水產(chǎn)品中常見的1 型整合子攜帶情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)4 種樣品中intI1 的拷貝數(shù)均高于103拷貝/g。推測(cè)IntI1 的高攜帶率可能與水產(chǎn)品中多重耐藥菌檢出相關(guān)。整合子基因能夠促進(jìn)外源性基因的獲得和表達(dá)，并通過可移動(dòng)遺傳因子、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子等在細(xì)菌群落之間傳播。

2.4 ARGs、intⅠ1 間的相關(guān)性分析

如表3所示，sul2 和blaPSE 之間呈顯著正相關(guān)，blaPSE 和aac（6'）-Ib 之間呈顯著正相關(guān)，cmlA 與qnrS 呈顯著正相關(guān)，這些ARGs 之間可能存在相同的宿主菌[21]。研究表明，某些微生物總是攜帶特定的ARGs[22]，即ARGs 的增值和分布與相關(guān)特定菌屬有關(guān)，例如：梭菌屬（Clostridium）通常攜帶tetO、tet32 和ermB，埃希氏菌（Escherichia）攜帶acrA、mdtH、mdtL 和mdtO[23]，氣微菌屬（Aeromicrobium）和sul2 之間呈顯著正相關(guān)[24]。本試驗(yàn)中的6種ARGs 與intⅠ1 豐度之間不顯著相關(guān)。

表3 ARGs 與intⅠ1 之間的相關(guān)性Table 3 Correlation coefficients between the relative abundances of ARGs and intⅠ1

3 討論

目前關(guān)于抗生素抗性基因在畜禽、果蔬及水產(chǎn)品中檢出的報(bào)道逐漸增多，水產(chǎn)品因其生產(chǎn)環(huán)境中耐藥基因污染加劇，極易受到耐藥基因污染。本研究選取的4 種水產(chǎn)品受β-內(nèi)酰胺酶的blaPSE、磺胺類耐藥基因sul2 和四環(huán)素耐藥基因tetA 污染較為嚴(yán)重。

已知質(zhì)粒介導(dǎo)的blaPSE 是編碼β-內(nèi)酰胺酶的常見基因，在本研究選取的4 種樣品中blaPSE的攜帶數(shù)量均最高，拷貝數(shù)均高于106拷貝/g 在1.2×10-4～6.0×10-3之間。β-內(nèi)酰胺類抗生素因具有低毒和廣譜抗菌而被臨床和養(yǎng)殖業(yè)長(zhǎng)期廣泛使用，其產(chǎn)生的細(xì)菌耐藥問題日趨嚴(yán)重。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶革蘭氏陰性菌數(shù)量和種類不斷上升，其攜帶的各類可移動(dòng)基因元件及耐藥基因能夠在不同微生物間發(fā)生轉(zhuǎn)移，進(jìn)而造成耐藥基因的廣泛傳播[25]。β-內(nèi)酰胺類bla基因已經(jīng)在養(yǎng)殖場(chǎng)的廢水、污水處理廠以及地表水中被檢出[26]。bla基因常與其它抗性微生物的抗性基因共存，并與可移動(dòng)遺傳元件相關(guān)聯(lián)，因而增加了多重藥物耐藥性和環(huán)境傳播的可能[27]。

磺胺類耐藥基因sul2 在沼蝦、鯽魚和黃顙魚3 種淡水養(yǎng)殖產(chǎn)品中含量均高于105拷貝/g，四環(huán)素耐藥基因tetA 在4 種樣品中的拷貝數(shù)均高于105拷貝/g。Gao 等[28]研究發(fā)現(xiàn)磺胺類和四環(huán)素耐藥基因在水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)中廣泛存在，使得水產(chǎn)品有極大可能受這2 種ARGs 污染。王慧平等[29]對(duì)廣州市天河區(qū)水產(chǎn)品耐藥基因攜帶研究也發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素抗性基因及磺胺類抗性基因在水產(chǎn)品中含量高于其它幾種抗生素抗性基因。磺胺類sul2 常常位于細(xì)菌的質(zhì)粒上，更容易出現(xiàn)耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移，使得其在樣品中有較高的含量，且磺胺類耐藥細(xì)菌在水體中十分穩(wěn)定，在環(huán)境中耐受性較強(qiáng)以及代謝速度慢，促進(jìn)了其在環(huán)境中的擴(kuò)散與傳播。

本研究中所有樣品中tetA 拷貝數(shù)均高于105拷貝/g，推測(cè)與養(yǎng)殖中四環(huán)素的使用相關(guān)。四環(huán)素水溶性較好且在環(huán)境中不易發(fā)生生物降解，因而容易在養(yǎng)殖環(huán)境中殘留和蓄積，進(jìn)而誘導(dǎo)養(yǎng)殖環(huán)境或養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)微生物對(duì)其產(chǎn)生抗性，形成持續(xù)性的污染。阮曉慧等[30]和Huang 等[31]研究均發(fā)現(xiàn)tetA 和tetG 基因豐度隨四環(huán)素暴露濃度的增加總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。推測(cè)本研究中tetA 在各樣品中含量高可能與養(yǎng)殖過程中四環(huán)素類藥物廣泛使用有關(guān)。

氯霉素耐藥基因cmlA、氨基糖苷類耐藥基因aac（6'）-Ib 和喹諾酮類耐藥基因qnrS，在本研究選取的4 種水產(chǎn)品中存在豐度均較低。氯霉素被作為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁藥后，降低了其誘導(dǎo)產(chǎn)生ARGs的風(fēng)險(xiǎn)，一定程度上減少了該類ARGs 對(duì)水產(chǎn)品的污染[32]，而氯霉素類殘留周期長(zhǎng)，且已有耐藥基因能在不同微生物間傳播，也會(huì)造成氯霉素耐藥基因禁用多年后仍能頻繁檢出。氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌性疾病的治療，研究發(fā)現(xiàn)魚源性氣單胞菌、無乳鏈球菌、弧菌、腸道菌等致病菌和共生菌中均攜帶氨基糖苷類和喹諾酮類抗生素相關(guān)的多種抗性基因。本研究中，cmlA、aac（6'）-Ib 和qnrS 在市售水產(chǎn)中豐度雖然較低，但此3 類耐藥基因均容易隨著整合子等可移動(dòng)遺傳組件在菌株間進(jìn)行水平傳播，導(dǎo)致不同種類的細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[33]。

此外，整合子作為基因捕獲系統(tǒng)，可以將外源基因整合到基因盒中，是ARGs 水平轉(zhuǎn)移的重要分子元件。有研究表明，整合子與某些ARGs 的存在具有一定的相關(guān)性。Luo 等[14]研究發(fā)現(xiàn)intⅠ1 與sul1 的相對(duì)豐度間存在顯著相關(guān)性，序列分析說明sul1 基因位于Ⅰ類整合子的保守段（3'-CS）[34]，而sul2 通常與小型非接合質(zhì)?；蚓哂卸嘀啬退幮缘馁|(zhì)粒相結(jié)合[14]。肖鑫鑫等[35]發(fā)現(xiàn)intⅠ1 與tetG、tetM、sul1 和qnrD 存在顯著正相關(guān)。然而本研究選取的6 種ARGs 與intⅠ1 豐度間之間相關(guān)性不顯著。intI1 的存在通常與細(xì)菌的多重耐藥密切相關(guān)，由于抗生素耐藥機(jī)制復(fù)雜而耐藥基因種類繁多，因此，后續(xù)研究需針對(duì)常用抗生素選擇多種相應(yīng)的ARGs 進(jìn)行檢查，更加全面、系統(tǒng)地分析intI1與樣品中ARGs 的相關(guān)性。

4 結(jié)論

本研究針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境污染較多的6 種ARGs 及intI1 建立了實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法，并利用此方法對(duì)4 種市售水產(chǎn)品中ARGs 及intI1進(jìn)行了定量分析，結(jié)果顯示，6 種ARGs 及intI1 在常見市售水產(chǎn)品中均有不同程度的檢出，表明抗生素耐藥相關(guān)基因污染較為普遍。blaPSE、sul2、tetA 在各類樣品中都具有較高的相對(duì)豐度，intI1的普遍檢出也預(yù)示著水產(chǎn)樣品中可能存在多重耐藥菌。

水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中由于水體環(huán)境抗生素污染加劇，加之養(yǎng)殖過程中大量抗生素被用于疾病預(yù)防和治療，使得水產(chǎn)養(yǎng)殖微生態(tài)環(huán)境以及養(yǎng)殖動(dòng)物攜帶細(xì)菌中ARGs 不斷蓄積。ARGs 通過食物鏈遷移將對(duì)人體健康構(gòu)成極大威脅，對(duì)常見ARGs 進(jìn)行檢測(cè)將對(duì)預(yù)防ARGs 經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體，提高食品安全性具有重要意義。魚蝦等水產(chǎn)品為人類提供了優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物蛋白，然而其耐藥基因污染及遷移的問題需引起更多的關(guān)注。