林 昕，王 麗，陳興蓮，邵金良，蘭珊珊，魏茂瓊，沙林杰，劉宏程*

（1 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所 昆明 650203 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室 昆明 650203 3 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心 昆明 650203）

普洱茶[1]是我國(guó)“六大茶類”中的代表性黑茶之一，也是典型的地理標(biāo)準(zhǔn)型產(chǎn)品，具有抗氧化、降血脂、降血糖、抑菌、助消化、醒酒、解毒等多種功效[2]。與其它茶類相比，普洱茶是擁有獨(dú)特風(fēng)味品質(zhì)特征的后發(fā)酵茶葉，其滋味“醇厚回甘”，具有“陳香味”香氣，這是由普洱茶鮮明的屬性所決定[2]。根據(jù)普洱茶加工工藝的不同分為普洱生茶和普洱熟茶。普洱生茶[3-4]具有更強(qiáng)的清除自由基、抗氧化活性，降血糖、降血脂等抗衰老的功效，被稱為“減肥茶”和“美容茶”，受到國(guó)內(nèi)外廣大消費(fèi)者的青睞。依據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)，普遍認(rèn)為普洱生茶的品質(zhì)經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的貯藏會(huì)明顯提升，具有“越陳越香，紅褐明亮”的特征[5]。研究者分別通過(guò)感官評(píng)價(jià)[6]、香氣評(píng)價(jià)[7]、湯色評(píng)價(jià)[8]和品質(zhì)成分評(píng)價(jià)[9]等多方面，證實(shí)了這一點(diǎn)。

目前普洱生茶貯藏時(shí)間對(duì)品質(zhì)的影響成為研究熱點(diǎn)。普洱生茶貯藏時(shí)間的傳統(tǒng)鑒別方法主要依據(jù)普洱生茶的感官審評(píng)打分判定[10]。茶葉的感官評(píng)價(jià)需要從業(yè)者具備專業(yè)性強(qiáng)、經(jīng)驗(yàn)豐富和感官識(shí)別靈敏的素質(zhì)，然而合格的評(píng)茶人員很少，并且感官審評(píng)結(jié)果極具主觀性，易受外界因素影響，最終影響評(píng)分結(jié)果。為科學(xué)、準(zhǔn)確地評(píng)定普洱生茶的貯藏時(shí)間，田小軍等[11]利用頂空-固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法分析普洱生茶貯藏期間香氣成分變化，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行特征性指標(biāo)研究。曾亮等[12]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測(cè)定茶湯中多種成分的變化趨勢(shì)，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行特征成分篩選。劉興勇等[13]通過(guò)高效液相色譜儀獲得不同陳化年限普洱茶內(nèi)含成分的指紋圖譜信息，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法判別不同貯藏時(shí)間的普洱茶。上述研究表明，通過(guò)儀器測(cè)定普洱茶內(nèi)含成分差異性，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法鑒別不同貯藏年份的普洱茶是可行的。多酚類物質(zhì)是普洱茶品質(zhì)形成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[14]，本研究通過(guò)分析普洱茶中18 種代表性多酚類成分在貯藏期間的變化特征，結(jié)合偏最小二乘判別分析法及其變量重要性貢獻(xiàn)值，來(lái)反映普洱生茶貯藏期間多酚類組分的變化特征，為普洱生茶貯藏時(shí)間的評(píng)定提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和樣品

1.1.1 茶葉樣品 在昆明市茶葉市場(chǎng)購(gòu)買得到不同貯藏年限的普洱茶樣品，每個(gè)產(chǎn)區(qū)6 份，合計(jì)18 份，按照T/TEA 002-2019《陳年普洱茶》[15]中對(duì)普洱茶貯藏期定義對(duì)樣品進(jìn)行劃分，以普洱生茶貯藏年限為依據(jù)低于5年分為C 組，貯藏年限高于5年低于10年分為B 組，高于10年分為A 組（詳見表1）。

表1 茶葉樣品來(lái)源Table 1 Sources of raw Pu-erh tea samples

1.1.2 儀器和試劑 Waters Alliance e2695-2998高效液相色譜儀-二極管陣列檢測(cè)器、Empower 3 數(shù)據(jù)工作站，美國(guó)Waters 公司；KQ-500DB 超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；TGL-10B-6D 高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；JJ200 電子分析天平，江蘇省常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；MILLIQ 純水機(jī)，美國(guó)Millipore 公司。

乙腈、甲醇（色譜純級(jí)），德國(guó)Merck 公司；磷酸、乙酸（分析純級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；多酚類對(duì)照品：兒茶素（Catechin，C）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、沒(méi)食子兒茶素（Gallocatechin，GC）、表沒(méi)食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（Catechin gallate，CG）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、蘆?。≧utin）、槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、山奈苷（Kaempferitrin）、芹菜素（Apigenin）、金絲桃苷（Hyperoside）、沒(méi)食子酸（Gallic acid，GA）、茶黃素（Theaflavin）、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯（Theaflavin-3-gallate，TF-3-G）、茶黃素-3’-沒(méi)食子酸酯（Theaflavin-3’-gallate，TF-3’-G）、茶黃素-3，3’-雙沒(méi)食子酸（Theaflavine-3，3’-digallate，TF-3，3’-G）（純度≥98.0%），成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)中茶葉前處理及其檢測(cè)方法等參數(shù)參考李永迪等[16]和王麗等[17-19]的試驗(yàn)方法。

1.2.1 樣品前處理及供試液制備 將普洱茶樣品按照“四分法”處理，將粉碎后的茶葉樣品過(guò)60 目篩。精密稱取1.0 g 樣品置于50 mL 離心管中，加入10 mL 80%甲醇水溶液，超聲處理30 min，以5 000 r/min 離心5 min，移取上層清液到25 mL容量瓶中，離心管內(nèi)再加入10 mL 80%甲醇水溶液復(fù)提，合并上清液并定容到25 mL，吸取1 mL 上清液經(jīng)0.22 μm 有機(jī)相濾膜過(guò)濾，待上機(jī)測(cè)定。

1.2.2 色譜條件 色譜柱選擇Waters C18 柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），柱溫30.0 ℃，進(jìn)樣體積10.0 μL，流速0.7 mL/min，流動(dòng)相A 為乙腈，流動(dòng)相B為0.5%乙酸水溶液，梯度洗脫程序見表2。檢測(cè)波長(zhǎng)分別是270 nm 和360 nm。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedures

1.2.3 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、蘆丁、槲皮素、山奈酚、山奈苷、芹菜素、金絲桃苷、沒(méi)食子酸、對(duì)羥基苯丙酸、咖啡堿、茶黃素、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯、茶黃素-3’-沒(méi)食子酸酯、茶黃素-3，3’-雙沒(méi)食子酸各對(duì)照品10 mg，各用甲醇溶解并定容至于10 mL，搖勻得到單一對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，再準(zhǔn)確吸取上述各對(duì)照品于容量瓶中并用甲醇定容，得到18 種混合對(duì)照品溶液，低溫避光保存、備用。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行方差分析比較不同樣品間的顯著性差異，P＜0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，并在SPSS 23.0 軟件上進(jìn)行聚類分析，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后輸入軟件SIMCA-P11.0進(jìn)行主成分分析和偏最小二乘判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏年限普洱生茶中多酚類成分差異性分析

普洱生茶中的多酚類物質(zhì)[20-21]通常包括黃烷醇類（兒茶素類為代表）、黃酮及黃酮苷類（山奈酚和槲皮素為代表）、花青素和酚酸及縮酚酸等。對(duì)不同貯藏年限的普洱生茶中18 種多酚類成分含量檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)分析，分析結(jié)果見表3。從結(jié)果可以看出，普洱生茶中的兒茶素類多酚成分含量隨著貯藏年限的延長(zhǎng)而逐步下降，長(zhǎng)期貯藏的A 組與短期貯藏的C 組相比大部分存在顯著差異性。普洱生茶中的黃酮及黃酮苷類中的蘆丁、山奈酚和金絲桃苷的含量也逐步下降，山奈酚的含量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明長(zhǎng)期貯藏的A 組含量與短期貯藏的C 組含量存在顯著差異性。沒(méi)食子酸是普洱茶中重要的特征性組分，隨著貯藏年限的延長(zhǎng)，其含量逐步增加，長(zhǎng)期貯藏的A 組含量與短期貯藏的C組含量比較，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異性。茶黃素類化合物中茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯和茶黃素-3，3’-雙沒(méi)食子酸的含量隨著貯藏年限的延長(zhǎng)含量逐步增加，其它的茶黃素含量略有下降，茶黃素-3’-沒(méi)食子酸的含量無(wú)明顯變化，這與茶黃素是由兒茶素類為主組分氧化形成有關(guān)。

表3 不同貯藏年限普洱生茶多酚類成分含量（mg/g）Table 3 Polyphenols contents of raw Pu-erh tea with different storage times（mg/g）

2.2 不同貯藏年限普洱生茶多酚類組分的多元統(tǒng)計(jì)分析

2.2.1 主成分分析結(jié)果 主成分分析法是通過(guò)正交變換將一組可能存在相關(guān)性的變量轉(zhuǎn)換為一組線性不相關(guān)的變量，轉(zhuǎn)換后的這組變量叫主成分。目前主成分分析法作為一種非監(jiān)督模式的統(tǒng)計(jì)方法得到廣泛應(yīng)用。

在本文中，將18 種多酚類成分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，帶入軟件SPSS 23.0 進(jìn)行PCA 分析。通過(guò)對(duì)普洱生茶中多酚類化合物進(jìn)行信息提取和濃縮，得到PCA 的得分圖和載荷因子圖（圖1），特征值及方差貢獻(xiàn)率見表4。

圖1 PCA 得分圖（a）及載荷圖（b）Fig.1 PCA score scatter plot（a）and loading scatter plot（b）

表4 PCA 特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 4 Characteristic value and variance contribution rate of PCA

從圖1a 可以看出，不同貯藏年限的普洱生茶雖然可以被區(qū)分開來(lái)，但是部分樣品混合在一起。從表4可知，前5 個(gè)主成分PC1、PC2、PC3、PC4 和PC5 的特征值大于1，其累積貢獻(xiàn)率達(dá)82.186%，能較好的反映變量的原始信息。從PCA 載荷圖（圖1b）可以看出，沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、山奈酚和茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯、沒(méi)食子酸6 個(gè)含量指標(biāo)在第1主成分上載荷較大，兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、茶黃素、茶黃素-3’-沒(méi)食子酸和茶黃素-3，3’-雙沒(méi)食子酸5 個(gè)含量指標(biāo)在第2 主成分上載荷較大，從結(jié)果可以看出，兒茶素類組分和茶黃素類組分在主成分中貢獻(xiàn)率中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明普洱茶生茶在貯藏期間，兒茶素類組分和茶黃素類組分發(fā)生了明顯變化。

2.2.2 聚類分析結(jié)果 聚類分析是一種將研究對(duì)象分為相對(duì)同質(zhì)的群組的統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)，作為一種無(wú)監(jiān)督模式，被廣泛應(yīng)用。在本文中，將18 個(gè)樣品的18 種多酚類成分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，輸入軟件SPSS 23.0 進(jìn)行聚類分析。采用系統(tǒng)聚類中“瓦爾德-平方歐式距離”算法，結(jié)果見圖2。

從圖2可知，當(dāng)橫坐標(biāo)為15 時(shí)，可將茶葉樣品聚類為3 類，拋開3 和12 號(hào)樣品，貯藏年限超過(guò)5年的普洱生茶樣品，A 組和B 組樣品聚在一起歸為一類。貯藏年限不超過(guò)5年的C 組普洱生茶樣品聚集在一起歸為一類。這結(jié)果說(shuō)明普洱生茶貯藏年限從第5年起，普洱生茶內(nèi)含多酚類成分發(fā)生明顯變化。

圖2 不同貯藏年限普洱生茶的聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram for cluster analysis of raw Pu-erh tea with different storage times

2.2.3 偏最小二乘判別分析結(jié)果 主成分分析結(jié)果和聚類分析結(jié)果表明，隨著普洱生茶貯藏年限的變化，18 種多酚類組分隨之發(fā)生明顯變化，并且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有意義的。偏最小二乘判別法是一種數(shù)學(xué)優(yōu)化技術(shù)，它通過(guò)最小化誤差的平方和找到一組數(shù)據(jù)的最佳函數(shù)匹配，適用于多自變量的分析中。因此，可將偏最小二乘判別法引入不同貯藏年限普洱生茶的研究中，以18 種多酚組分為自變量（X），以貯藏年限為因變量（Y），將長(zhǎng)期貯藏年限（10年）普洱生茶定義為A 組，中期貯藏年限（5年）普洱生茶為B 組，短期貯藏年限普洱生茶為C 組，進(jìn)行模型分析，并對(duì)模型進(jìn)行了200 次置換檢驗(yàn)試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，不同貯藏年限的普洱生茶被明顯區(qū)分開來(lái)。依據(jù)偏最小二乘判別分析結(jié)果，以4 個(gè)主成分作為模型擬合結(jié)果最優(yōu)，模型的R2X（cum）自變量擬合指數(shù)值是0.893，表示當(dāng)模型以4 個(gè)主成分?jǐn)M合自變量時(shí)，其可反映總自變量中的89.3%；同時(shí)，因變量（Y）的擬合指數(shù)R2Y（cum）值是0.821，表示當(dāng)模型以4 個(gè)主成分?jǐn)M合自變量時(shí)，可反映總因變量中的82.1%；模型預(yù)測(cè)指標(biāo)Q2（cum）=0.864，說(shuō)明對(duì)于不同貯藏年限普洱生茶的預(yù)測(cè)率為86.4%，說(shuō)明模型結(jié)果可靠。

圖3 不同貯藏年限普洱生茶的PLS-DA 圖Fig.3 PLS-DA score plot of raw Pu-erh tea with different storage times

為了進(jìn)一步探尋以多酚類成分為自變量對(duì)于偏最小二乘判別法模型分析結(jié)果的貢獻(xiàn)率，求得偏最小二乘判別法模型的變量值貢獻(xiàn)圖（圖4）。變量值的大小代表了各品質(zhì)成分對(duì)模型貢獻(xiàn)率的大小，數(shù)值越大貢獻(xiàn)越大，按大小順序排列的普洱生茶中多酚類組分沒(méi)食子酸、懈皮素、山奈酚、表沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素和沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯為主要的差異性組分，結(jié)合含量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，可以將沒(méi)食子酸、懈皮素、山奈酚、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯8 個(gè)普洱茶多酚類成分作為區(qū)分不同貯藏年限普洱生茶的偏最小二乘判別法模型的標(biāo)志性成分。

圖4 偏最小二乘判別法模型的變量值條形圖Fig.4 Barplot with PLS-DA model of VIP

3 結(jié)論

本研究對(duì)不同貯藏年限普洱生茶內(nèi)含有的18 種代表性多酚類組分含量進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，隨著貯藏年限的延長(zhǎng)，普洱生茶中兒茶素類組分含量呈下降趨勢(shì)，茶黃素類組分含量呈上升趨勢(shì)，黃酮及黃酮苷類含量呈不規(guī)則變化。相同貯藏年限茶葉樣品可以被聚聚在一起，不同貯藏年限樣品分離趨勢(shì)雖然存在，但是分離度一般。對(duì)數(shù)據(jù)采用偏最小二乘判別分析，不同貯藏年限普洱生茶樣品分離趨勢(shì)明顯，通過(guò)對(duì)多酚類組分重要性（重要性值>1）分析，發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸、山奈酚、芹菜素、表沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素、山奈苷、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯、沒(méi)食子兒茶素和沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯10 個(gè)多酚類組分對(duì)于不同貯藏年限普洱生茶樣品呈現(xiàn)分離趨勢(shì)起到主要作用，結(jié)合含量差異性分析結(jié)果，沒(méi)食子酸、山奈酚、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯7 個(gè)多酚類組分在普洱生茶貯藏期間發(fā)生明顯變化，可以視為標(biāo)志性成分。本研究可為普洱生茶貯藏期間品質(zhì)變化深入研究提供依據(jù)。