郭建宏，王彩霞，王松磊，李亞蕾

（寧夏大學食品與葡萄酒學院 銀川 750021）

我國是世界第一大羊肉生產(chǎn)國，也是第一大羊肉消費國。據(jù)統(tǒng)計，2015年我國羊肉人均需求量為3.23 kg/人，現(xiàn)以年均1.39%的速度增長，2020年我國羊肉消費需求總量將增加到502 萬t[1]。隨著城鄉(xiāng)居民消費水平的提高和消費觀念的改變，人們對肉品已由量的需求轉(zhuǎn)向質(zhì)的要求。寧夏灘羊是我國特有的綿羊品種，主要分布于賀蘭山東麓平坦的山前荒原及河東丘陵引黃灌區(qū)，甘草、沙蔥、苦豆子等多種中草藥植被及獨特無污染的氣候條件，賦予了灘羊肉質(zhì)細嫩，脂肪分布均勻，腥膻味小的優(yōu)良品質(zhì)。

長期以來，風味是肉的重要品質(zhì)，也是影響消費的重要因素，主要由一些風味前體物質(zhì)經(jīng)復雜的化學反應轉(zhuǎn)化而來。肉風味的前體物質(zhì)包括水溶性化合物和脂溶性化合物，且脂溶性風味前體物是熟肉揮發(fā)性風味物質(zhì)的主要來源，也是不同物種之間肉的特征風味物質(zhì)的主要來源[2]。研究表明，不同地區(qū)羊肉中脂肪酸種類與結(jié)構(gòu)差異明顯[3-4]。如李愛華等[5]對不同年齡寧夏灘羊肌肉中的脂肪酸組成進行了研究，硬脂酸（C18：0）的含量從羔羊的14.16%遞增到成年羊的20.10%，同時成年羊的膻味也在增加，表明羊肉中的硬脂酸（C18：0）含量與其膻味呈正相關(guān)，這與Crouse 等[6]的研究結(jié)果一致。李文博等[7]對蘇尼特羊肉中主要脂肪酸與特征揮發(fā)性風味物質(zhì)做相關(guān)性分析，肉中揮發(fā)性風味物質(zhì)與脂肪酸含量呈顯著相關(guān)性（P＜0.05）。此外，文志勇等[8]研究了脂肪酸氧化生成揮發(fā)性的醛、酮、醇等香味物質(zhì)，油酸被認為是最豐富的風味前體物質(zhì)。除此之外油酸（C18：1）還具有降低血液膽固醇及低密度脂蛋白的作用[9-10]?？焖贉蚀_地檢測羊肉中的脂肪酸組成及含量，具有重要的現(xiàn)實意義。

脂肪酸組成及含量檢測主要以理化檢測為主，如氣相色譜法、高效液相色譜法、氣-質(zhì)譜聯(lián)用法和液-質(zhì)譜聯(lián)用法等[11]。方法準確率高，然而，檢測過程中對樣本有一定的破壞性且耗費大量的試劑，同時對操作人員有較高的專業(yè)素質(zhì)要求，難以滿足快速無損檢測的要求[12]。高光譜成像技術(shù)融合圖像與光譜兩種信息，結(jié)合化學計量學方法可實現(xiàn)組分含量的快速無損檢測。文韜等[13]應用高光譜技術(shù)，采用SG-SPA-MLR 法構(gòu)建的模型對不同霉變時期的稻谷脂肪酸含量均具有較強的預測能力，相關(guān)系數(shù)Rp和均方根誤差RMSEP 分別為0.9366，12.3550 mg/100 g。Cheng 等[14]基于可見/近紅外高光譜成像系統(tǒng)預測不同品類魚片在不同儲藏周期中的DHA 和EPA 含量，結(jié)果表明：采用PN-GA 方法提取特征波長建立回歸預測模型是可行的。Portarena 等[15]基于拉曼光譜技術(shù)建立了橄欖油中油酸、棕櫚酸和亞油酸含量的PLSR 預測模型。Tao 等[16]利用“二階導數(shù)+S-G 平滑”預處理反射光譜建立PLSR 預測模型，可以快速、無損地測定魚片中多不飽和脂肪酸含量。

關(guān)于應用光譜技術(shù)對脂肪酸含量無損檢測的應用研究內(nèi)容極為豐富，而大多數(shù)研究都僅對脂肪酸含量建立預測模型，未實現(xiàn)脂肪酸含量的可視化表達，且將可見/近紅外高光譜技術(shù)應用于羊肉脂肪酸含量的檢測較少。本文就脂肪酸檢測方法研究中的弱點問題，以寧夏灘羊肉中油酸和硬脂酸含量為研究對象，通過高光譜成像技術(shù)建立油酸和硬脂酸含量預測模型；通過建立的最優(yōu)預測模型將脂肪酸含量定量反演到樣本圖像上，進而實現(xiàn)脂肪酸含量在羊肉樣本高光譜圖像上的可視化表達。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肉，寧夏鹽池縣鑫海食品有限公司；正己烷（色譜純）、甲醇、濃硫酸、氫氧化鉀（均為分析純），國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AL204 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Eppen-dorf 移液槍，美國Agilent 公司；GC-2010 Plus 氣相色譜儀、HP-5 MS 色譜柱、FID 檢測器，日本島津公司；可見/近紅外高光譜成像系統(tǒng)，美國Headwall Photonics 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羊肉樣本采集 選取新鮮屠宰10月齡50只健康灘羊后腿、前腿和背部（外脊）3 個部位最長肌組織，用包裝袋包裝放入保溫箱運至實驗室，貯藏于4 ℃冰箱備用。光譜掃描前剔除多余油脂和筋膜，整形切塊（大小約為40 mm×30 mm×10 mm）并標號。共獲得139 個灘羊肉樣品，其中，羊后腿肉、前腿肉和背最長肌各46，42，51 個。室溫放置2 h，待肉樣中心溫度到達室溫后，用濾紙吸干樣品表面水分，進行光譜掃描。

1.3.2 高光譜信息采集 由于儀器中暗電流的存在以及光源強度在各個波段的不均勻分布，導致樣品部分信息失真，因此圖像采集后需要進行黑白校正。校正方程如式（1）。

式中，RO——原始圖像；RW——全白的標定圖像；RB——全黑的標定圖像；R——校正后的光譜圖像。

經(jīng)多次預試驗，樣本采集參數(shù)設定為：曝光時間30 ms；曝光物距360 mm；掃描線實際長度60 mm；電控位移臺掃描速度200 μm/s。

1.3.3 脂肪酸含量的測定 根據(jù)Floch 的方法[17-18]。稱取0.5 g 樣品研磨粉碎于耐熱玻璃管中，向管中加入含有0.1%丁羥基甲苯（BHT）的0.2 mL C11：0的甲醇溶液作為內(nèi)標，再向管中加入0.7 mL 10 mol/L 的KOH 溶液和5.3 mL 的甲醇。將管在55℃條件下水浴1.5 h，且每隔20 min 振蕩5 s。然后在冷水浴條件下降至室溫，向管內(nèi)加入0.58 mL 24 mol/L 的H2SO4，反復倒置混勻，然后在55 ℃條件下水浴1.5 h，且每隔20 min 振蕩5 s。之后將管在冷水浴條件下降至室溫，向管內(nèi)加入3 mL 正己烷，然后漩渦混勻5 min，在3 000 r/min 條件下離心5 min。取上層液體進行氣相分析。

氣相色譜條件為：HP-5 MS 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣后于70 ℃保持1 min，然后以5 ℃/min 上升到210 ℃，保留96 min；進樣溫度：250 ℃；檢測器溫度：200 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 感興趣區(qū)域選取及全波段光譜特征分析利用ENVI 4.8 軟件提取圖像的感興趣區(qū)域（ROI），如圖1所示。通過背景與樣本之間的光譜響應差異確定掩膜波段，選擇第83 個波段（λ=795 nm）作為樣本從整個圖像分割的最優(yōu)波段，設置掩膜閾值為0.1，得到二值化圖像，然后將其應用于高光譜圖像獲取掩膜圖像。選取樣本像素作為每幅圖像的ROL，計算其平均光譜，獲得原始光譜值，并對羊肉樣本全波段光譜特征和不同部位光譜差異進行分析。然后采用理化值共生距離法（SPXY）劃分校正和預測樣本集，設定樣本容量的3/4 作為校正集，1/4 作為預測集。

圖1 感興趣區(qū)域選取Fig.1 Region of interest selection

1.4.2 預處理方法選擇 在光譜掃描過程，待測樣本的狀態(tài)、儀器響應以及周圍環(huán)境引起的光散射等會導致光譜的基線平移和偏移，影響建模效果的準確性。卷積平滑（Savitzky-Golay，S-G）可消除儀器噪音的影響；標準正態(tài)變量變換（SNV）、基線校準（Baseline）、矢量歸一化（Normalize）、趨勢算法（De-trending）及多元散射校正（MSC）5 種方法可消除樣品表面光散射所導致的基線漂移現(xiàn)象。對原始光譜數(shù)據(jù)預處理，可以提高光譜分辨率，提高模型穩(wěn)定性和準確性。

1.4.3 特征波長提取及建模分析 原始光譜數(shù)據(jù)量龐大、冗余信息量多，需對全波段數(shù)據(jù)進行降維處理。試驗采用連續(xù)投影算法（Successive projection algorithm，SPA）、無信息變量消除算法（Uninformative variable elimination，UVE）和變量組合集群分析法（Variable combination cluster analysis，VCPA）對樣本光譜數(shù)據(jù)提取特征波長，降低模型運算量，提高模型穩(wěn)定性和預測準確性。使用The Unscrambler X 10.4 軟件對特征波長光譜數(shù)據(jù)建立偏最小二乘回歸（PLSR）、主成分回歸（PCR）和多元線性回歸（MLR）預測模型。選用校正集相關(guān)系數(shù)（Rc）、預測集相關(guān)系數(shù)（Rp）以及校正均方根誤差（Root mean square error of calibration，RMSEC）、預測均方根誤差（Root mean square error of prediction，RMSEP）對模型性能進行評估。其中，Rc、Rp越高，RMSEC、RMSEP 值越低，模型的校正和預測性能越好[19]。

1.4.4 脂肪酸含量的可視化表達 高光譜成像技術(shù)完美結(jié)合了光譜與圖像信息，圖像上的每個像素點都包含一條光譜曲線，對樣本指標進行檢測的同時，還能結(jié)合預測模型參數(shù)將檢測指標定量反演到樣本圖像上，從而實現(xiàn)待測指標的可視化表達。

利用Matlab 軟件將掩膜圖像信息轉(zhuǎn)化為三維數(shù)據(jù)矩陣，進一步獲取特征波長矩陣；建立預測模型讀取與待測指標之間具有高相關(guān)性的各個特征波長對應的權(quán)重系數(shù)bn，并將權(quán)重系數(shù)與樣本圖像上每個像素點的反射率值相乘，得到每個像素點的賦值即為樣本待測物含量值；最后根據(jù)賦值大小對像素點進行顯色處理。不同區(qū)域顏色差異與深淺代表不同含量，紅色表示含量較高，藍色表示含量較低，顏色隨含量的降低從紅色向藍色漸變?？梢暬鞒倘鐖D2所示。

圖2 可視化流程Fig.2 Visualization process

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸含量統(tǒng)計分析

羊肉樣本不同部位油酸、硬脂酸含量比較分析結(jié)果如圖3所示。不同部位中，油酸和硬脂酸的含量都是背最長?。厩巴热猓竞笸热猓@可能是因為背部的運動量相對于腿部較少，導致脂肪含量沉積較多，且糖酵解活性也較高，會產(chǎn)生較多的ATP 用于脂肪酸的從頭合成[20]。由圖3可知，油酸含量在后腿肉與背最長肌中有顯著差異；硬脂酸含量在羊肉不同部位中均無顯著差異；而在羊肉樣本中，油酸與硬脂酸含量差異極顯著。

圖3 不同部位羊肉樣本脂肪酸含量分析Fig.3 Analysis of fatty acid content in mutton samples from different parts

2.2 全波段光譜特征分析

在可見/近紅外光譜中，電磁輻射與樣本之間發(fā)生相互作用時，樣本中不同的化合物在特定波段具有典型的反射特征。圖4a 是羊肉樣本原始光譜反射率曲線，可以看出所有光譜曲線走勢相似；430，490，560 nm 波長處的反射帶主要與呼吸色素血紅蛋白有關(guān)；波長755 nm 附近反射帶可能與水分的O-H 鍵有關(guān)；920 nm 波長處的反射帶與C-H 第3 次拉伸泛音有關(guān)，是肉類樣本中脂肪和脂肪酸的特征分子；而970 nm 波長處的反射帶與水O-H 的第二泛音相關(guān)[21]。圖4b 為不同部位羊肉樣本光譜曲線，3 個部位光譜反射率曲線區(qū)分較明顯，其中后腿反射率曲線最高，而背最長肌反射率曲線最低。

圖4 樣本原始光譜曲線和不同部位光譜曲線Fig.4 Sample original spectral curve and different parts spectral curve

采用SPXY 法對油酸和硬脂酸數(shù)據(jù)進行樣本集劃分。由表1可見，油酸含量的最大值為5.145 g·（100 g）-1，比硬脂酸含量的最大值足足高了3.521 g·（100 g）-1，而二者的最小值僅差了0.094 g·（100 g）-1。同時，校正集樣本含量選擇范圍較好的涵蓋了預測集樣本，說明樣本集的劃分是合理的。

表1 樣本集劃分結(jié)果Table 1 Sample set partition statistical results

2.3 光譜預處理

圖5為原始光譜和不同預處理方法利用PLSR 建模對比結(jié)果。由圖5a 油酸含量預測模型可以看出，光譜經(jīng)Baseline 和De-trending 法預處理后模型的校正集相關(guān)系數(shù)略有下降，其中經(jīng)Baseline 法預處理后模型的預測集相關(guān)系數(shù)僅有0.7807，可能是因為在基線校準過程中剔除了少量有效信息，從而影響了模型準確度；而經(jīng)S-G、SNV、Normalize 和MSC 法預處理的光譜PLSR 模型校正集相關(guān)系數(shù)均大于原始光譜，其中MSC 法預處理的模型預測集相關(guān)系數(shù)最為理想，Rp=0.8805，且均方根誤差小于原始光譜，RMSEP=0.2564 g·（100 g）-1，說明MSC 法可有效消除樣本表面的散射效應。因此，選擇經(jīng)MSC 法預處理的光譜進行后期油酸數(shù)據(jù)的處理。綜合模型相關(guān)系數(shù)與均方根誤差，對經(jīng)6 種方法預處理后的硬脂酸含量模型對比分析，結(jié)果如圖5b 所示。只有SNV 法預處理的光譜所建PLSR 模型校正集和預測集相關(guān)系數(shù)均高于原始光譜，且均方根誤差均低于原始光譜，說明SNV 法很好的消除了樣本表面散射和光路變化對近紅外反射光譜的影響。因此選擇SNV 法為樣本硬脂酸的最佳光譜預處理方法。

圖5 不同預處理方法的PLSR 模型統(tǒng)計分析Fig.5 PLSR model statistical results of different pretreatment methods

2.4 提取特征波長

利用UVE、SPA 和VCPA 算法對經(jīng)最優(yōu)預處理的光譜數(shù)據(jù)提取特征波長。3 種方法選取油酸和硬脂酸特征波長信息如圖6所示。

在采用UVE 選取特征波長時，根據(jù)PLSR 模型中RMSECV 最小值確定最佳主成分數(shù)（油酸為11，硬脂酸為12），豎線兩側(cè)分別有125 個波長變量，兩條水平虛線為變量選擇閾值（油酸為7.117，硬脂酸為6.012），如圖6a～6b 所示。采用SPA 算法進行特征波長篩選時，需計算在各個波長數(shù)下的RMSEC 值，并將RMSEC 最小值對應的波長數(shù)確定為特征波長數(shù)，如圖6c～6d 所示。首先設置波長變量范圍為5～30，在油酸數(shù)據(jù)中，當特征波長個數(shù)在20 之前時，RMSE 呈明顯下降趨勢，此時，RMSE=0.2504，之后隨著波長數(shù)的增加，RMSE 值變化平穩(wěn)，因此，確定油酸的特征波長個數(shù)為20。同理可得SPA 法提取的硬脂酸數(shù)據(jù)的特征波長個數(shù)為16，RMSE=0.0942。此外，在VCPA 算法中采用5 折交叉驗證，設置采樣次數(shù)1 000，迭代次數(shù)50 次，優(yōu)秀子集占變量子集的比率為0.1。

圖6e～6f 為不同算法提取的特征波長統(tǒng)計結(jié)果。從圖6e 可以看出，油酸數(shù)據(jù)提取的特征波長主要集中在430，560，920 nm 波段附近范圍內(nèi)；同樣在圖6f 中，硬脂酸數(shù)據(jù)提取的特征波長在430，640，755，920 nm 波段區(qū)域較為集中。此外，整體來看，選取的特征波段與可見/近紅外吸收機理基本吻合，且采用UVE 法選取的特征波長數(shù)目居多且較為集中，SPA 法次之，VCPA 法選取的特征波長數(shù)目較少。

圖6 特征波長提取信息Fig.6 Characteristic wavelengths extract information

2.5 建模分析

分別建立油酸和硬脂酸經(jīng)UVE、SPA、VCPA法提取特征波長光譜數(shù)據(jù)的PLSR、PCR 和MLR預測模型。

由圖7a 油酸含量預測模型可知，相對于UVE和SPA 法，VCPA 法提取特征波長所建模型效果較差，原因可能是VCPA 法提取的特征波長數(shù)量少，僅占總波長的4.8%，導致有效信息獲取較少，不利于提高模型預測能力。對比UVE 和SPA 法提取特征波長建立的回歸預測模型，發(fā)現(xiàn)UVE 法提取特征波長建立的3 種模型其Rc和Rp均比SPA法高，相關(guān)系數(shù)均可達到0.86，其中，MLR 模型的校正和預測性能最好，其Rc=0.9099，RMSEC=0.3557 g/100g，Rp=0.8759，RMSEP=0.2467 g/100 g。此外，與2.3 節(jié)基于全波段建立的PLSR 模型相比，雖然全波段建模比采用UVE 法提取特征波長的校正集與預測集相關(guān)系數(shù)高了0.0159 和0.0046，但其數(shù)據(jù)量大，增加了計算負擔，而特征波長的數(shù)據(jù)量少，可以很好的提升模型運算速度。因此，確定UVE-MLR 為油酸含量的最優(yōu)預測模型。

圖7b 為硬脂酸含量預測模型結(jié)果。同理，VCPA 法提取特征波長包含的有效信息較少，導致模型預測效果差。在采用其它兩種方法提取特征波長建模中，顯然都以MLR 模型效果最優(yōu)，其中，SPA 法提取特征波長建立的模型校正集和預測集相關(guān)系數(shù)較UVE 更優(yōu)，Rc=0.8691，Rp=0.8446。所以，確定SPA 法為硬脂酸的最佳特征波長提取方法，并且建立多元線性回歸模型。

圖7 特征波長建模分析Fig.7 Characteristic wavelength modeling analysis

表2 特征波長建模結(jié)果Table 2 Characteristic wavelength modeling results

2.6 油酸和硬脂酸含量的可視化表達

由2.5 節(jié)可知，油酸和硬脂酸含量的最優(yōu)預測模型分別為UVE-MLR 和SPA-MLR，利用最優(yōu)預測模型得知每個像素點對應的油酸和硬脂酸含量值，并將其反演到羊肉樣本圖像上，從而獲得油酸和硬脂酸含量的可視化分布圖。在羊肉樣本油酸和硬脂酸含量分布圖中，羊肉樣本背景為深藍色，含量顯示為零，顏色越紅表示含量越高。

圖8為脂肪酸含量可視化分布圖（a 為油酸，b 為硬脂酸）。從圖中可以看出油酸含量分布比硬脂酸含量分布廣且顏色更深，說明灘羊肉樣本中油酸含量比硬脂酸高，這和脂肪酸測定結(jié)果吻合；二者的主要分布位置基本重疊，且呈不均勻狀態(tài)分布，在樣品肌間脂肪多的地方顏色更紅，說明在肌間脂肪中脂肪酸含量高。因此，通過可視化表達可直觀反映羊肉樣本中脂肪酸含量的分布情況，為羊肉品質(zhì)檢測提供更清晰直觀的形式。

圖8 脂肪酸含量可視化分布圖Fig.8 Visual distribution diagram of fatty acid content

3 結(jié)論

利用可見/近紅外高光譜技術(shù)對灘羊肉中風味前體特征脂肪酸含量進行預測和可視化表達。結(jié)果表明：羊肉樣本光譜數(shù)據(jù)經(jīng)6 種方法預處理后建模分析，油酸和硬脂酸分別以MSC 和SNV法預處理的光譜數(shù)據(jù)建模效果更好；利用UVE、SPA 和VCPA 算法提取特征波長，油酸提取了25，20，6 個特征波長，硬脂酸提取了21，16，9 個特征波長；對3 種方法提取的特征波長分別建立PLSR、PCR 和MLR 回歸預測模型。結(jié)果表明：油酸以UVE 法提取特征波長建立MLR 模型效果最優(yōu)，Rc=0.9099，Rp=0.8759；硬脂酸以SPA 法提取特征波長建立MLR 模型效果最優(yōu)，Rc=0.8691，Rp=0.8446；最后結(jié)合預測模型參數(shù)可很好地對油酸和硬脂酸含量及分布進行可視化表達。利用高光譜技術(shù)對灘羊肉中特征性脂肪酸含量具有較強的預測能力，可為羊肉品質(zhì)的快速檢測提供技術(shù)參考。