穆凱宇，楊昱姝，劉佳欣，孫嘉臨，陳文章，劉學(xué)波，劉夫國

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌 712100）

近年來，塑料包裝薄膜被廣泛應(yīng)用于食品包裝領(lǐng)域。由于其主要成分是不可再生的石油基材料，需要很長時(shí)間才能被自然降解，因此帶來了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。與此同時(shí)，塑料包裝薄膜還存在一定的安全問題，例如，塑料膜中使用的鄰苯二甲酸酯類增塑劑可能會(huì)滲出到食品中而污染食品，對(duì)人體健康產(chǎn)生危害。目前，以可降解、可食用的生物大分子成分（例如：蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)）為主要原料來制備可食用薄膜成為食品包裝領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。生物聚合物可食膜具有減少或完全替代某些傳統(tǒng)聚合物包裝材料的潛力。生物聚合物材料較傳統(tǒng)塑料包裝材料具有更高的安全性[1]。

來自動(dòng)、植物資源的多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)化合物可用于制備可食用薄膜。天然蛋白質(zhì)因出色的功能特性而成為生產(chǎn)食品包裝薄膜的理想選擇[2]。蛋白質(zhì)中，酪蛋白具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，優(yōu)異的水溶性和乳化能力，是制備可食膜的理想基質(zhì)材料[3-6]。蛋白質(zhì)可食用膜還具有良好的機(jī)械性能、透明性以及出色的氧氣和二氧化碳阻隔能力，在食品包裝生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景[7-8]。然而，相比于合成聚合物包裝材料，單一酪蛋白膜不能提供較高的機(jī)械強(qiáng)度。為了強(qiáng)化其性能，采用物理或化學(xué)處理的方法，促使蛋白質(zhì)分子間發(fā)生交聯(lián)，修飾聚合物網(wǎng)絡(luò)，以達(dá)到改善蛋白膜性能的目的。此外，將兩種或多種聚合物共混制膜也是改善薄膜物理、化學(xué)性質(zhì)的方法之一。例如：明膠/殼聚糖膜[9]、殼聚糖/明膠/聚乙烯醇膜[10]和殼聚糖/綠茶提取物膜[11]等。

據(jù)報(bào)道，通過添加谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TG 酶）可以改善蛋白膜的物理性能，且產(chǎn)品具有較高的安全性[12]。在蛋白基質(zhì)中添加多糖，也可使膜性能增強(qiáng)。其中，應(yīng)用較多的是殼聚糖，其具有良好的生物相容性和可生物降解性，較高的親水性和生物黏附性。EGCG 作為一種酚類化合物，其具有抗氧化活性和抑菌性[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG 可改善殼聚糖的乳化活性和抗氧化活性[15]。根據(jù)以上研究，本試驗(yàn)選用酪蛋白作為成膜基質(zhì)，添加酶（TG酶）、多糖（殼聚糖）及多酚（EGCG）制備復(fù)合膜，對(duì)膜的厚度、色度、透明度、機(jī)械強(qiáng)度、抗氧化及微觀形態(tài)進(jìn)行表征，確定復(fù)合膜的最佳成膜配方，為開發(fā)新型可食包裝膜提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

酪蛋白，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；TG酶，江蘇一鳴生物股份有限公司；殼聚糖（CS），Sigma 公司；EGCG，北京北實(shí)縱橫科技有限公司；DPPH，上海麥克林生物化學(xué)有限公司；丙三醇、氫氧化鈉、乙酸等均為分析純級(jí)，陜西楊凌新三力化玻站。

納米激光粒度儀（ZEN3600），英國馬爾文儀器有限公司；物性測定儀 （TA.XT PLUS），英國Stable Micro systems 公司；色度儀（Ci7600），美國愛色麗（上海）色彩科技有限公司；掃描電子顯微鏡（S-3400N），日本日立公司；分光測色儀器（CS-820），中國杭州彩譜科技有限公司；數(shù)顯千分測厚規(guī)（0-10X30），中國浙江德清盛泰芯電子科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酪蛋白溶液的制備 將10 g 酪蛋白粉末分散于90 mL pH 9 的NaOH 水溶液中，在室溫連續(xù)攪拌40 min 使其充分溶解。將分散好的溶液于功率450 W 條件下超聲處理80 min，使酪蛋白水合程度顯著提高。純酪蛋白膜性質(zhì)較差，取3 g 丙三醇加入膜溶液中[16]，用于增強(qiáng)蛋白膜性能，使其在磁力攪拌條件下均勻分散在酪蛋白溶液中。將制備好的酪蛋白溶液（10%）置4℃冰箱中備用。

1.2.2 酪蛋白復(fù)合膜液的制備 為制備不同材料的膜，首先配制不同的膜液，不同樣品的成分及添加量見表1。樣品縮寫名稱的具體含義為：酪蛋白組即對(duì)照組（CA）；添加EGCG 組（CAEG）；添加TG 酶組（CATG）；添加殼聚糖組（CACS）；同時(shí)添加TG 酶和EGCG 組（CATE）；同時(shí)添加EGCG 和殼聚糖組（CAEC）。每組樣品制備方法如下：

表1 酪蛋白復(fù)合膜溶液配方Table 1 Formulations used in casein composite films

1） 酪蛋白組即對(duì)照組（CA） 在后期蛋白質(zhì)溶液與添加劑混合的過程中，有水的引入，故為了控制變量，在原先制得溶液的基礎(chǔ)上加入等體積的水，充分混合，得到酪蛋白樣品溶液（5%），儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2） 添加TG 酶組（CATG） 酶添加量過高會(huì)導(dǎo)致酪蛋白迅速交聯(lián)，造成空間位阻，而TG 酶/酪蛋白比例超過10 U/g 時(shí)，對(duì)TG 酶催化聚合酪蛋白的影響不大。催化酪蛋白聚合所需酶量可選擇10～20 U/g[17]。通過濃度梯度預(yù)試驗(yàn)，得出TG 酶添加量10 U/g 時(shí)，制得樣品最佳。取制備好的酪蛋白溶液，向其中加入TG 酶樣品，使酶濃度為10 U/g，并向其中添加等體積的水，充分混合，在50 ℃情況下孵育60 min，得CATG 樣品溶液，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

3） 添加EGCG 組（CAEG） 在酪蛋白樣品中加入基于酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的EGCG，添加EGCG 后，向其中添加等體積的水，充分混合，將樣品避光貯存?zhèn)溆谩?/p>

4） 添加殼聚糖組（CACS） 取0.2 g 殼聚糖加入100 mL 體積分?jǐn)?shù)1%的冰乙酸水溶液中，磁力攪拌至溶解，調(diào)節(jié)溶液pH 5～6，取50 mL 酪蛋白溶液與50 mL 0.1%殼聚糖、冰乙酸溶液1∶1 混合，采用調(diào)溫磁力攪拌器攪拌均勻，備用。

5） 添加TG 酶和EGCG 組（CATE） 在CATG組的基礎(chǔ)上，按照CAEG 組添加EGCG 的方法加入EGCG，添加EGCG 后，將樣品置避光條件貯存?zhèn)溆谩?/p>

6） 添加EGCG 和殼聚糖組（CAEC） 在CAEG組的基礎(chǔ)上，按照CACS 組的方法加入殼聚糖，混合后攪拌均勻的樣品置避光貯存?zhèn)溆谩?/p>

7） 添加TG 酶和殼聚糖組（CATC） 在CATG組的基礎(chǔ)上，按照CACS 組添加CS 的方法加入殼聚糖，混合后攪拌均勻的樣品避光貯存?zhèn)溆?。由于后續(xù)成膜過程中，該組膜液樣品烘干所得膜樣品不均一，顆粒聚集懸于表面，成膜效果較差，因此后續(xù)試驗(yàn)中未作分析討論。

1.2.3 酪蛋白膜液粒徑和電位的測定 基于Chen 等[18]的方法，測定不同膜液的粒徑和ζ-電位。采用ZEN3600 納米激光粒度儀測量粒徑。將復(fù)合蛋白溶液用去離子水稀釋100 倍，取1 000 μL 稀釋的樣品，加入粒徑池中，運(yùn)行程序測量。記錄3 次測量的平均值。另取870 μL 稀釋的樣品，放入電位池中，運(yùn)行程序測量。

1.2.4 復(fù)合膜的制備 分別取經(jīng)不同添加劑處理的復(fù)合酪蛋白溶液每組20 mL，倒入聚苯乙烯培養(yǎng)皿（8 cm）中，在（30±1.0）℃烘箱中處理8 h，烘干后樣品在室溫（20 ℃，60%濕度）平衡48 h，對(duì)其性能進(jìn)行表征。

1.2.5 蛋白膜厚度的測定 取平衡后的膜樣品，用電子厚度測量儀測量厚度。根據(jù)薄膜樣品中5個(gè)不同位置處的測量值計(jì)算平均厚度。

1.2.6 酪蛋白膜的不透明度測定 將待測樣品裁成10 mm×50 mm 的矩形，貼于比色皿內(nèi)側(cè)，用紫外分光光度計(jì)，在波長600 nm 處測定OD 值，以空比色皿作對(duì)照。不透明度計(jì)算公式如下：

式中，T600nm——膜在波長600 nm 處的透過率（%）；X——膜的厚度（mm）。

1.2.7 酪蛋白膜的色度測定 采用色度儀測定膜的色度，儀器設(shè)定為透射測量模式，將薄膜固定在透射測量位置。以儀器所配備的白板作為對(duì)比板進(jìn)行測量，計(jì)算L*，a*和b*。每組測量5 次，試驗(yàn)結(jié)果以平均值表示。

顏色變化（ΔE）計(jì)算公式：

式中，L*——亮度。當(dāng)L*值為正時(shí)，顏色偏白，反之顏色偏黑；當(dāng)a*值為正時(shí)，顏色偏紅，反之顏色偏綠；當(dāng)b*值為正時(shí)，顏色偏黃，反之則偏藍(lán)。

1.2.8 膜的機(jī)械性能測定 將膜樣品切成1 cm×6 cm 的長條。將平衡后的膜條安裝在TA.XT PLUS 物性測定儀的夾具中，夾具間隔30 mm，以3.00 mm/s 移動(dòng)拉伸速度對(duì)膜樣品進(jìn)行測試。根據(jù)所測力-變形數(shù)據(jù)繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線，得到薄膜的拉伸強(qiáng)度和薄膜斷裂伸長率。每個(gè)樣品測量5次，結(jié)果以平均值表示[19]。

1.2.9 膜的水蒸氣透過率（WVP）測定 通過重量分析法[20]改良測定WVP，將待測薄膜放在存有KNO3飽和溶液的蒸發(fā)皿中，提前室溫平衡48 h。在50 mL 離心管中加入5 g 干燥CaCl2，將樣品覆蓋在離心管口密封，放入存有飽和KNO3溶液的密閉容器中。放置48 h 后稱量離心管及CaCl2質(zhì)量。計(jì)算其增加的質(zhì)量，確定CaCl2所吸收的水分。根據(jù)公式（3）計(jì)算WVP。

式中，WVP——水蒸氣透過率 （g·mm/m2·d·kPa）；M——離心管和CaCl2增加的質(zhì)量（g）；L——膜厚度（mm）；t——測試時(shí)間（d）；A——膜的測試面積（m2）；ΔP——膜內(nèi)外水蒸氣壓差，1.268 kPa。

1.2.10 DPPH 自由基清除率的測定 取每種膜樣品20 mg 加到5 mL 甲醇中，25 ℃溶解12 h，得到膜提取液。將200 μL 膜提取溶液與2 mL DPPH 溶液（0.025 g/L）混合，在環(huán)境溫度下避光保存30 min。使用紫外分光光度計(jì)測量其在波長517 nm 處的吸光度。根據(jù)吸光度計(jì)算其DPPH 自由基清除率：

式中，A0——空白對(duì)照組在波長517 nm 處的吸光度；A——添加膜液的樣品組的吸光度[21]。

1.2.11 掃描電子顯微鏡圖像分析 （SEM） 采用SEM 捕獲膜的表面和橫截面圖像。將膜樣品凍干處理后，用導(dǎo)電膠帶將其固定在觀察臺(tái)上，經(jīng)離子濺射儀噴金。使用15.0 kV 電壓，2 000 放大倍數(shù)觀察正面，300～350 放大倍數(shù)觀察側(cè)截面，探究其微觀結(jié)構(gòu)形貌。

1.2.12 數(shù)據(jù)分析 采用Origin 8.5 軟件繪圖，SPSS 16.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以“±s”表示，當(dāng)P＜0.05 時(shí)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣品膜液的粒徑和電位分析

膜溶液顆粒大小影響微粒間的作用及溶液烘干成膜的結(jié)構(gòu)。由圖1粒徑分析可得，與CA 組對(duì)比，每種添加劑的引入對(duì)于粒徑都有顯著的影響（P<0.05），其中，CATG 組的粒徑最大。TG 酶能催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，在蛋白質(zhì)、多肽及伯胺之間形成共價(jià)鍵。如果蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基的ε-氨基作為酰基受體，那么在分子間及分子內(nèi)會(huì)形成ε-（γ-Glu）-Lys 鍵[22]，形成粒徑較大的顆粒結(jié)構(gòu)。CACS組也有較大的粒徑，殼聚糖和酪蛋白分別帶正電荷和負(fù)電荷，因此這兩種聚合物間的作用可能是通過靜電作用發(fā)生的[23]。而CAEG 組粒徑明顯減小，EGCG 與酪蛋白發(fā)生非共價(jià)和共價(jià)結(jié)合，酪蛋白結(jié)構(gòu)中的疏水性殘基和脯氨酸為茶多酚的強(qiáng)烈絡(luò)合提供位點(diǎn)，形成非共價(jià)復(fù)合物，而茶多酚的氧化和親核加成過程可促進(jìn)茶多酚和蛋白質(zhì)之間不可逆的共價(jià)締合[24]。具有較高親水性EGCG 的結(jié)合促進(jìn)了酪蛋白的分散，故粒徑最小。由于EGCG與殼聚糖復(fù)合可以提高殼聚糖的乳化活性，使殼聚糖更容易吸附到酪蛋白上[15]。故與CA 組相比，CAEC 組粒徑顯著升高。

圖1 不同添加劑對(duì)酪蛋白復(fù)合溶液粒徑的影響Fig.1 Effects of different additives on particle size of casein complex solution

各添加劑帶有不同的電荷，可通過改變分子間靜電排斥力而影響膜的結(jié)構(gòu)[25]。液滴的電荷在分散體系穩(wěn)定性方面起重要作用，液滴之間的靜電排斥可防止液滴的聚集。電位絕對(duì)值增加，粒子之間的靜電排斥力增加，系統(tǒng)相對(duì)穩(wěn)定[26]。由圖2可知，各組相較于CA 組變化較為顯著（P<0.05），其中CATG 組電位絕對(duì)值最小，表明顆粒間的靜電斥力最小。CACS 組電位值較CA 組更低，通常殼聚糖溶液的電位在酸性條件下為正，在一些特定的pH 值，如pH 6～6.5 時(shí)，氨基的電荷損失會(huì)使殼聚糖電位變負(fù)[23]，同時(shí)CATE、CAEC 組電位較低，說明EGCG 的引入使得復(fù)合物的電荷降低。總體來說，靜電排斥效果會(huì)使膜溶液中粒子分布更加均勻，影響其成膜后的物理特性。

圖2 不同添加劑對(duì)酪蛋白復(fù)合溶液電位的影響Fig.2 Effects of different additives on the potential of casein complex solution

2.2 不同膜樣品的厚度、色度、不透明度分析

膜的厚度取決于成膜溶液基質(zhì)中溶劑的組成和濃度。由表2可知，復(fù)合膜的厚度為150～200 μm，各組之間差異較為顯著（P<0.05）。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，添加TG 酶的復(fù)合膜較厚（204 μm），可能是由于酶交聯(lián)提高了蛋白質(zhì)的聚集程度。而添加CS 和EGCG 的復(fù)合膜較薄，主要是因?yàn)橐隕GCG 降低了膜液的粒徑，粒子的結(jié)構(gòu)變??；引入CS 使得粒子間通過交聯(lián)作用形成更加致密的結(jié)構(gòu)，粒子與粒子的間隙更小，因而總的縱向空間體積較小。

膜的光學(xué)特性在食品包裝的生產(chǎn)中尤其重要，因?yàn)樗鼤?huì)影響消費(fèi)者對(duì)食品的接受度[27]。CAEG、CATG 和CATE 3 組的a*值均為負(fù)值，且相較于其它組a*絕對(duì)值更小，因此綠色較其它組弱。僅添加EGCG 的CAEG 組b*值最大，幾乎為零，相較于其它組，發(fā)黃趨勢更為明顯。綜合顏色變化可知，摻入酚類化合物的蛋白膜相比于未摻入酚類化合物的膜呈現(xiàn)更暗的顏色，且相較于CA組差異較大（P<0.05）。一方面可能是因?yàn)橐氲姆宇愌趸甚愇镔|(zhì)，使薄膜顏色變暗。另一方面是因?yàn)樘砑臃宇愇镔|(zhì)后，光會(huì)被形成的交聯(lián)結(jié)構(gòu)散射和折射，從而產(chǎn)生較暗的視覺感受[28]，在光敏感食品上有著良好的應(yīng)用。

對(duì)許多應(yīng)用于食品的包裝薄膜來說，薄膜的不透明度是重要的參數(shù)。不透明度數(shù)值越高，透明性越差。如表2所示，與對(duì)照組相比，單獨(dú)添加TG酶和殼聚糖的兩組樣品相較于CA 組的不透明度有明顯上升（P<0.05），可能是由于蛋白質(zhì)-酶和蛋白質(zhì)-多糖相互作用，形成了更多的聚集體，使光不易通過。另外，蛋白質(zhì)和添加劑的相互作用使膜厚度增加，也使其不透明度上升。添加EGCG 的3組樣品中，只添加EGCG 的樣品不透明度數(shù)值最小，即透明性最好。主要原因是引入EGCG 使樣品粒徑更小，形成更加均勻的結(jié)構(gòu)，且樣品厚度均較小，光線容易透過，表現(xiàn)出較好的光透過性。

表2 不同添加劑對(duì)酪蛋白復(fù)合膜厚度、色度和不透明度的影響Table 2 Effects of different additives on the thickness，chromaticity and opacity of casein composite films

總體來說，與對(duì)照組相比，添加TG 酶和殼聚糖導(dǎo)致薄膜厚度增加，不透明度也增加，而引入EGCG 導(dǎo)致膜厚度減小，薄膜色澤較暗，透明性較好。

2.3 不同膜樣品的機(jī)械性能分析

機(jī)械性能對(duì)食品包裝材料至關(guān)重要。良好的機(jī)械性能是保證包裝產(chǎn)品完整性的前提[29]。本實(shí)驗(yàn)通過測量樣品的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率來確定不同添加劑對(duì)酪蛋白復(fù)合膜機(jī)械性能的影響。

由圖3可知，6 組樣品都有良好的拉伸強(qiáng)度，這與酪蛋白性質(zhì)及甘油的引入有關(guān)。在復(fù)合膜中，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間通過氫鍵、疏水相互作用以及二硫鍵結(jié)合發(fā)生相互作用[30]，使膜具有一定的穩(wěn)定性，其中添加甘油賦予薄膜一定的柔韌性和延展性。相較于CA 組，經(jīng)不同添加劑處理的蛋白膜的拉伸強(qiáng)度都有一定程度的增強(qiáng)（P<0.05）。對(duì)比分析CA 組與CATG、CAEG 和CACS 組發(fā)現(xiàn)，TG酶、EGCG 和殼聚糖的單獨(dú)引入都會(huì)使復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度增強(qiáng)，且引入殼聚糖的綜合效果最佳。由于拉伸強(qiáng)度不是簡單地隨添加劑的引入而疊加，加入TG 酶和EGCG 的CATE 組的性能雖強(qiáng)于CA 組，但其拉伸強(qiáng)度低于TG 酶和EGCG 單獨(dú)與酪蛋白作用帶來的提升。CAEC 組的拉伸強(qiáng)度也較高，說明在EGCG 存在的條件下，殼聚糖仍起主要作用。

圖3 不同添加劑對(duì)酪蛋白復(fù)合膜拉伸強(qiáng)度的影響Fig.3 Effects of different additives on tensile strength of casein composite films

圖4顯示復(fù)合膜的斷裂伸長率。與CA 組相比，CATG 組略微增強(qiáng)，CAEC 組的變化不大，其余組均有一定程度的下降，可能是引入TG 酶使蛋白膜發(fā)生分子交聯(lián)，其結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜和緊密。樣品中只添加EGCG 和殼聚糖兩組的斷裂伸長率均明顯下降（P<0.05），可能是由于拉伸強(qiáng)度增強(qiáng)的同時(shí)，堅(jiān)韌的材料在受到縱向剪切力時(shí)變得酥脆易斷。而同時(shí)添加EGCG 和TG 酶的CATE 組斷裂伸長率最低，可能是因?yàn)镋GCG 的加入使得TG酶催化作用下蛋白質(zhì)間形成的多孔交聯(lián)結(jié)構(gòu)被填補(bǔ)，使充滿孔洞的結(jié)構(gòu)變成密集緊實(shí)，進(jìn)而變得酥脆。而添加EGCG 和殼聚糖的CAEC 組斷裂伸長率下降不大，可能是由于引入帶正電的殼聚糖使得EGCG 與酪蛋白相互作用得到改善，保留了蛋白膜的韌性。

圖4 不同添加劑對(duì)酪蛋白復(fù)合膜斷裂伸長率的影響Fig.4 Effects of different additives on elongation at break of casein composite films

綜上所述，在膜樣品中添加一些化合物可能會(huì)提高膜樣品的機(jī)械性能，也可能因添加的化合物與酪蛋白的相互作用而降低膜樣品的機(jī)械性能。當(dāng)部分樣品的拉伸強(qiáng)度增強(qiáng)時(shí)，斷裂伸長率可能會(huì)大幅度下降，因此在選擇材料時(shí)，拉伸強(qiáng)度最強(qiáng)不代表材料的綜合性能最好。綜合比較6 種薄膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率，得出CAEC 組的拉伸強(qiáng)度較CA 組明顯提高的同時(shí)，也具有良好的斷裂伸長率，綜合機(jī)械性能最佳。

2.4 不同膜樣品的水蒸氣透過率分析

為了防止或減少食品的脫水，用作包裝或涂層的薄膜必須控制水分從產(chǎn)品到環(huán)境的傳輸，因此可食用薄膜的水蒸氣透過率應(yīng)盡可能低[31]。薄膜的組成和結(jié)構(gòu)是影響水蒸氣透過率的最重要因素。水蒸氣透過率的數(shù)值越高，膜樣品的水阻隔性能越差。如圖5所示，與對(duì)照組相比，添加EGCG組水蒸氣透過率都有一定程度的降低，而單獨(dú)添加TG 酶和殼聚糖的樣品水蒸氣透過率都呈升高的現(xiàn)象。添加TG 酶的CATG 組水蒸氣透過率數(shù)值顯著升高（P＜0.05）。在分別添加TG 酶和殼聚糖的基礎(chǔ)上，添加EGCG 的CATE 組和CAEC 組的水蒸氣透過率均降低，其中CAEC 組的水蒸氣透過率最低。

研究表明，添加酚類物質(zhì)后薄膜更堅(jiān)固，柔韌性更差，可能產(chǎn)生更多的多孔結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)水分子的遷移[32]。然而，如圖5所示，添加EGCG 組的水蒸氣透過率較低，其原因可能是EGCG 具有較多羥基，與蛋白質(zhì)之間形成氫鍵，密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以減少聚合物基質(zhì)的自由體積，并增加水分子通過網(wǎng)絡(luò)的曲折度，從而降低水分子通過薄膜的擴(kuò)散速率[33]。添加TG 酶的膜相對(duì)于未添加的膜水蒸氣透過率明顯增加，可能是因?yàn)榻?jīng)TG 酶催化，膜的內(nèi)部發(fā)生分子內(nèi)交聯(lián)，形成較大的孔徑。添加TG 酶的同時(shí)加入EGCG，可在原有基礎(chǔ)上對(duì)膜進(jìn)行修飾。相比于CATG 組，CATE 組具有較低的水蒸氣透過率，可能是引入多酚填補(bǔ)了CATG 膜上因交聯(lián)形成的孔隙。添加殼聚糖的膜樣品水蒸氣透過率變化率不大，這可能是由于一方面CACS膜液粒徑較CA 組有所增加，其成膜孔隙隨之增大，另一方面復(fù)合物靜電結(jié)合使得膜變得致密，兩方面綜合作用使CACS 水蒸氣透過率變化不大。添加殼聚糖和EGCG 的膜樣品水蒸氣透過率最低，可能是由于添加EGCG 改善了殼聚糖的乳化活性[15]。經(jīng)多糖和多酚共同作用，膜樣品更加緊密。

圖5 不同添加劑對(duì)酪蛋白復(fù)合膜水蒸氣透過率的影響Fig.5 Effects of different additives on water vapor permeability of casein composite films

分析得出，TG 酶在催化蛋白交聯(lián)的同時(shí)，形成較多的大孔隙結(jié)構(gòu)，引起水蒸氣透過率的增加。引入EGCG 形成CA-EGCG 復(fù)合結(jié)構(gòu)，增加了水蒸氣透過的曲折度，降低了水蒸氣透過率。單獨(dú)引入殼聚糖的對(duì)水蒸氣透過率的影響不大。EGCG和殼聚糖混合后可以改善乳化活性，在EGCG 與殼聚糖的綜合影響下，CAEC 組的水蒸氣透過率最低，阻隔效果最好。

2.5 不同膜樣品的DPPH 自由基清除活性分析

為了對(duì)比不同蛋白質(zhì)膜樣品的DPPH 自由基清除活性，將每種膜樣品浸于甲醇中，獲得提取液，測定不同樣品的DPPH 自由基清除能力，結(jié)果如圖6所示。各組膜樣品均具有一定的DPPH 自由基清除能力，相較于CA 組，各組抗氧化能力均有較為明顯的提升（P＜0.05）。CAEG 組具有較強(qiáng)的自由基清除能力，這是因?yàn)槠渲泻蠩GCG。EGCG 具有較強(qiáng)的自由基清除活性，能夠螯合金屬離子。同樣CAEC 組也顯現(xiàn)出較強(qiáng)的自由基清除能力，其低于CAEG 組，原因可能為引入殼聚糖后有一定的屏蔽作用，使得EGCG 暴露面積小于CAEG 組。雖然殼聚糖也具有一定的抗氧化能力，但是其清除DPPH 自由基的作用較弱[26]。

圖6 不同添加劑對(duì)酪蛋白復(fù)合膜DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effects of different additives on DPPH radical scavenging rate of casein composite films

2.6 復(fù)合膜的微觀圖像分析

為了探究膜樣品的微觀形貌，分析了膜樣品表面和側(cè)截面的電鏡照片。如圖7所示，CA 組可觀察到大量的氣孔，因此水蒸氣透過率較大。通過截面圖可看出其結(jié)構(gòu)較為均勻，相對(duì)于其它膜，拉伸強(qiáng)度較低。單獨(dú)添加TG 酶、EGCG 和殼聚糖的3 組，都有一定的交聯(lián)組織結(jié)構(gòu)，其機(jī)械強(qiáng)度和阻水性能都有一定的提升，CATE 組中，TG 酶的催化使得膜內(nèi)部形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，EGCG 的引入使TG 酶催化形成的縫隙孔徑得以補(bǔ)充，形成緊密的結(jié)構(gòu)，因此CATE 組的側(cè)截面比CA 組更加均勻、平整，結(jié)構(gòu)韌性更差，更酥脆，斷裂伸長率更低。CAEC組的截面圖具有線性和網(wǎng)狀等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，在具有一定的機(jī)械強(qiáng)度的同時(shí)具有良好的斷裂伸長率。

圖7 不同添加劑的酪蛋白復(fù)合膜在2K 放大倍數(shù)下的平面以及300 放大倍數(shù)條件下的截面電鏡照片F(xiàn)ig.7 Planar electron microscopy at 2K magnification and cross section electron microscopy at 300 magnification of casein composite films with different additives

膜截面示意圖如圖8所示，不同的形狀代表不同的物質(zhì)。CA 組酪蛋白分子間帶相同電荷，存在靜電斥力，分布趨向于均勻。添加TG 酶的CATG 組，酪蛋白受酶的催化作用，蛋白分子間結(jié)合，形成聚合結(jié)構(gòu)，分子間空隙增多、增大，機(jī)械強(qiáng)度增強(qiáng)。CAEG 組由于引入EGCG，酪蛋白分子間的縫隙被填補(bǔ)，水蒸氣透過率下降，機(jī)械強(qiáng)度增強(qiáng)，然而由于分子間較強(qiáng)的作用，導(dǎo)致空隙過少，形變空間較少，膜結(jié)構(gòu)酥脆易斷。CACS 組由于引入殼聚糖，多糖與蛋白結(jié)合形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，在提升水阻隔性能和拉伸強(qiáng)度的同時(shí)，對(duì)膜的韌性無太大損害。CATE 組與CACS 組厚度相似，具有較高的機(jī)械強(qiáng)度。CAEC 組性能最佳，圖形的重疊程度表示交聯(lián)程度，EGCG 的引入改善了殼聚糖的乳化活性，使殼聚糖與酪蛋白的反應(yīng)程度加深，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不僅水蒸氣阻隔能力最佳，而且抗拉伸強(qiáng)度和韌性也較優(yōu)良。

圖8 添加劑與酪蛋白作用后形成膜樣品的截面示意圖Fig.8 A cross-sectional diagram of the film samples formed by interaction between additives and casein

3 結(jié)論

以酪蛋白為基底構(gòu)建可食膜，通過添加TG酶、EGCG 和殼聚糖對(duì)酪蛋白膜進(jìn)行改性，測量膜液的粒徑和電位，復(fù)合膜的表觀結(jié)構(gòu)、水蒸氣透過率、機(jī)械性能和自由基清除能力。結(jié)果表明，TG 酶通過催化酪蛋白形成分子間共價(jià)鍵，從而提升酪蛋白膜的機(jī)械性能，然而催化的同時(shí)形成較多的空隙，使得復(fù)合膜的水阻隔性能下降。帶正電的殼聚糖與帶負(fù)電的酪蛋白通過靜電作用相結(jié)合，制得的復(fù)合膜拉伸強(qiáng)度和韌性均大幅提升，水阻隔能力有所提升。EGCG 與酪蛋白通過共價(jià)和非共價(jià)方式結(jié)合，使得復(fù)合膜較為致密，抗拉伸性能大幅提升，水蒸氣阻隔能力上升，然而其結(jié)構(gòu)過于致密，韌性變差，彎折易碎。同時(shí)添加EGCG 和CS 的CAEC 組，改善了CAEG 組膜樣品的結(jié)構(gòu)過于緊密的情況，使其具有較高拉伸強(qiáng)度的同時(shí)，又具有良好的韌性。殼聚糖和EGCG 均具有一定的抗氧化能力，在食品包裝方面有一定的優(yōu)勢。經(jīng)綜合比較，CAEC 膜的綜合性能最佳，在食品包裝領(lǐng)域具有應(yīng)用優(yōu)勢。