劉曉麗，楊冰鑫，陳柳青，范宇婷，吳克剛，于泓鵬

（廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院 廣州 510006）

肝臟通過(guò)吞噬和解毒功能對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用[1]，而酒精是導(dǎo)致肝病的重要因素[2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界飲酒者高達(dá)23 億，其中3.3%的飲酒者患有酒精性肝病 （Alcoholic liver disease，ALD）[3]。酒精性肝損傷的標(biāo)志是乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡和壞死[4]，然而其發(fā)病機(jī)制尚不明確[5]。

余甘子（Phyllanthus emblicaL.，PE）是葉下珠屬木本植物的成熟果實(shí)，藥食同源的品種之一。在傳統(tǒng)的中藥和印度醫(yī)學(xué)中，余甘子干果被用作治療肝損傷[6]。Pramyothin 等[7]報(bào)道余甘子能夠提高肝細(xì)胞中AST、ALT 和IL-β 水平，從而抑制肝損傷。Reddy 等[8]認(rèn)為余甘子中的多酚成分起護(hù)肝作用。余甘子多酚（Polyphenols fromPhyllanthus emblicaL.，PPE）屬于天然的植物多酚，它可以誘導(dǎo)HO-1基因的表達(dá)，然而，目前PE 對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制及主要活性成分均未明確。

本文研究PPE 及PE 中主要成分沒食子酸（GA）、柯里拉京（CO）和鞣花酸（EA）對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用，探討余甘子保肝作用的主要活性成分及作用機(jī)制，為余甘子在酒精性肝損傷治療方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

余甘子鮮果，涼山；BRL-3A 鼠肝細(xì)胞株，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷胱甘肽（GSH） 試劑，南京建成生物研究所；沒食子酸（GA）、柯里拉京（CO）、鞣花酸（EA）標(biāo)準(zhǔn)品，成都指標(biāo)化所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，德國(guó)DBI Bioscience 公司；熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒，美國(guó)GeneCopoeia公司；Bicinchoninic acid（BCA）蛋白定量試劑盒，杭州弗德生物。

1.2 儀器與設(shè)備

7500 熒光定量PCR 儀，德國(guó)DBI Bioscience公司；SMA4000 微量核酸定量?jī)x，美國(guó)Merinton公司；多功能酶標(biāo)儀，上?，F(xiàn)科儀器有限公司；LC-20A 高效液相色譜儀、Inertsil ODS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，日本島津公司；脫色搖床、電泳儀，北京六一儀器廠；灰度分析軟件Image J，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 新鮮余甘子清洗去核，烘干、粉碎，過(guò)60 目篩，制成余甘子粉末備用。取10 g 余甘子粉末加入45%乙醇50 mL，70 ℃水浴振蕩提取135 min[9]，過(guò)濾，濾渣重復(fù)上述操作，收集余甘子多酚提取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，收集濃縮液，依次用水、乙酸乙酯進(jìn)行分級(jí)萃取，萃取液分別旋蒸至膏狀。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) BRL-3A 細(xì)胞在含10%FBS 和1%青鏈霉素溶液的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3.3 酒精性肝損傷模型 BRL-3A 細(xì)胞以5×104細(xì)胞/mL 的密度種于96 孔板過(guò)夜后，用酒精（體積分?jǐn)?shù)0.6%，3%，6%）處理細(xì)胞24 h[10]，按照CCK-8 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.3.4 樣品毒理性檢測(cè) BRL-3A 細(xì)胞以5×104細(xì)胞/mL 的密度種于96 孔板過(guò)夜后，用PPE/GA/CO/EA（10，40，70 μg/mL）處理細(xì)胞24 h 后檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.3.5 PPE 對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用

1.3.5.1 溶劑相對(duì)PPE 抑制酒精性肝損傷的影響 將PPE 提取物及水相、乙酸乙酯相萃取物分別用DMSO 稀釋到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，0.22 μm的微孔濾頭過(guò)濾得到濾液。采用Inertsil ODS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈（A）-0.1%三氟乙酸（B）為流動(dòng)相，以1.0 mL/min 的流速梯度洗脫35 min，在254 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行HPLC 檢測(cè)[11]。

BRL-3A 細(xì)胞以5×104細(xì)胞/mL 的密度種于96 孔板過(guò)夜后，加入不同溶劑相萃取的提取物處理細(xì)胞24 h 后檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.3.5.2 不同體積分?jǐn)?shù)樣品對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用 BRL-3A 細(xì)胞模型組用體積分?jǐn)?shù)3%的乙醇處理細(xì)胞24 h，試驗(yàn)組同時(shí)用3%乙醇和PPE（1.3.5.1 節(jié)試驗(yàn)結(jié)果中效果較好的樣品）/GA/CO/EA（10，40，70 μg/mL）處理細(xì)胞24 h 后檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.3.6 試驗(yàn)分組 正常對(duì)照組（N）：用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；模型組（M）：用含3%乙醇的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，試驗(yàn)組：用含3%乙醇和GA/CO/EA/PPE的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.3.7 待測(cè)樣的制備及肝指標(biāo)的測(cè)定 細(xì)胞上清液制備：經(jīng)過(guò)24 h 培養(yǎng)后，用EP 管收集培養(yǎng)基，3 000 r/min 離心15 min，收集上清液，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定MDA、SOD、ALT、AST、GSH 指標(biāo)。

1.3.8 Q-PCR 檢測(cè)Nrf2/HO-1 的mRNA 表達(dá)水平 收集處理好的細(xì)胞，提取RNA 并測(cè)定RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸35 s，重復(fù)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Nrf2和HO-1的mRNA 相對(duì)表達(dá)量，檢測(cè)目的基因及引物序列見表1。

表1 目的基因的引物序列Table 1 Primer sequences for target genes

1.3.9 Western blot 檢測(cè)Nrf2/HO-1 的表達(dá)水平 收集處理好的細(xì)胞，提取蛋白并按照BCA 蛋白定量試劑盒說(shuō)明書測(cè)定蛋白濃度，蛋白標(biāo)本水浴5 min，上樣至SDS-PAGE 凝膠，電泳至溴酚藍(lán)剛出來(lái)，轉(zhuǎn)模至PDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，稀釋一抗，4 ℃過(guò)夜，置于相應(yīng)二抗中室溫孵育30 min，放入暗匣中曝光，最后用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影，將膠片進(jìn)行掃描存檔，Image J 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精性肝損傷模型

據(jù)Lee 等[12]和Zhang 等[13]的報(bào)道，當(dāng)細(xì)胞暴露于乙醇，導(dǎo)致細(xì)胞存活率顯著降低50%左右時(shí)，適合建立酒精性細(xì)胞模型。從圖1可以看出，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)胞存活率降低；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，BRL-3A 細(xì)胞存活率極顯著降低（P﹤0.01），且細(xì)胞存活率為48.01%，因此，選用3%乙醇建立酒精性肝損傷模型。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)下細(xì)胞存活率Fig.1 Cell survival rate under different ethanol volume fraction

2.2 樣品毒理性檢測(cè)

從圖2可以看出，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的GA/CO/EA/PPE 處理后，相對(duì)于正常組的細(xì)胞存活率沒有顯著性差異（P＞0.05），從而排除GA/CO/EA/EAFPPE 對(duì)BRL-3A 細(xì)胞的毒副作用，可以開展PPE及主要活性成分對(duì)酒精性肝細(xì)胞損傷保護(hù)的研究試驗(yàn)。

圖2 不同樣品對(duì)BRL-3A 細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of different samples on the survival rate of BRL-3A cells

2.3 余甘子多酚對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用

2.3.1 不同溶劑相PPE 對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用 GA、CO 和EA 是余甘子的主要活性成分，其含量常被視為余甘子品質(zhì)評(píng)估的重要指標(biāo)。PPE提取物進(jìn)一步經(jīng)過(guò)水和乙酸乙酯萃取后，提取物中的GA、CO 和EA 的含量見表2。

表2 不同溶劑相PPE 中GA、CO、EA 的含量Table 2 GA，CO and EA content in PPE of different solvent phases

加入不同溶劑相萃取的提取物處理24 h 后，BRL-3A 細(xì)胞的細(xì)胞活力見圖3。

從表2可以看出，不同溶劑萃取的PPE 中GA、CO、EA 含量不同，水萃取的PPE 中GA、CO、EA 含量最低，乙酸乙酯相中的GA、CO、EA 含量極顯著高于水相（P﹤0.01）。未經(jīng)萃取的PPE 中CO 含量較高，而經(jīng)乙酸乙酯萃取的PPE 中GA 和CO 含量較高。從圖3可以看出，乙酸乙酯萃取的PPE 對(duì)酒精性BRL-3A 細(xì)胞保護(hù)作用較強(qiáng)，細(xì)胞存活率高于水相和未經(jīng)萃取的PPE 提取物，這可能與PPE 中活性成分含量不同有關(guān)，推測(cè)GA 和EA 對(duì)酒精性肝細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的貢獻(xiàn)較大。因此，選擇乙酸乙酯萃取得的PPE 作為后期試驗(yàn)的給藥樣品。

圖3 不同溶劑相PPE 對(duì)酒精損傷的BRL-3A細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of different solvent phase polyphenols from Phyllanthus emblica L.on survival rate of BRL-3A cells damaged by alcohol

2.3.2 PPE 對(duì)酒精性損傷BRL-3A 細(xì)胞的保護(hù)作用 從圖4可以看出，EAF-PPE 和GA、CO、EA 對(duì)酒精損傷BRL-3A 細(xì)胞均具有一定的保護(hù)作用，隨著樣品劑量的增加，細(xì)胞存活率增加，存在劑量依賴關(guān)系。GA 和EA 對(duì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用相對(duì)較好，高劑量組細(xì)胞存活率分別達(dá)到79.33%和86.99%。

圖4 不同樣品對(duì)酒精性損傷BRL-3A 細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effect of different samples on the survival rate of BRL-3A cells induced by alcoholic injury

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清液生化指標(biāo)測(cè)定

2.4.1 MDA 和SOD 含量測(cè)定 MDA 是氧化損傷重要產(chǎn)物之一，也是用于檢測(cè)氧化損傷的常用指標(biāo)[14]，MDA 含量可以反應(yīng)細(xì)胞氧化損傷的程度。飲酒時(shí)，酒精會(huì)導(dǎo)致MDA 含量增加，降低總抗氧化能力[15]。SOD 是作用于超氧陰離子自由基的專一歧化反應(yīng)催化劑，是重要的酶類抗氧化劑[16]，具有抗氧化作用。EAF-PPE 和GA、CO、EA 處理后酒精損傷BRL-3A 細(xì)胞中MDA 和SOD 的含量見圖5。

圖5 不同樣品對(duì)酒精損傷BRL-3A 細(xì)胞中MDA 和SOD 含量的影響Fig.5 Effect of different samples on the content of MDA and SOD in the cell of BRL-3A with alcohol injury

從圖5可以看出，3%乙醇處理后使細(xì)胞的MDA 含量顯著增加（P＜0.01），SOD 含量顯著降低（P＜0.01）；添加不同劑量的EAF-PPE 會(huì)使MDA含量顯著降低（P＜0.05），SOD 含量顯著增加（P＜0.05），且樣品劑量與MDA 含量、SOD 含量存在劑量依賴效應(yīng)。EAF-PPE 和GA、CO、EA 處理的高劑量組細(xì)胞中MDA 含量分別下降0.76%，0.69%，0.60%，0.69%，SOD 含量分別增加20.31%，17.02%，26.61%，13.96%。因此，EAF-PPE 可以通過(guò)降低MDA 含量，增加總SOD 活力，使BRL-3A 細(xì)胞的抗氧化能力增強(qiáng)，抑制酒精對(duì)BRL-3A 細(xì)胞的氧化損傷，且EAF-PPE 之所以可以有效減輕酒精損傷BRL-3A 細(xì)胞的氧化損傷與其含有GA、CO、EA有關(guān)。

2.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)上清中肝指標(biāo)ALT、AST 和GSH含量測(cè)定 ALT、AST 和GSH 的釋放是肝損傷最可靠的證據(jù)[17]，谷胱甘肽（GSH）水平是重要的非酶類抗氧化劑[15]，被廣泛用作肝病的指標(biāo)[18]。本研究測(cè)定了各組細(xì)胞中的ALT、AST 和GSH 活力，以考察EAF-PPE 對(duì)酒精性肝細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果見圖6。

從圖6可以看出，乙醇導(dǎo)致BRL-3A 細(xì)胞中ALT 和AST 含量顯著升高 （P﹤0.01），GSH含量顯著降低 （P﹤0.01）。當(dāng)加入不同劑量的EAF-PPE 時(shí)，ALT 和AST 含量顯著下降（P﹤0.01），GSH 含量顯著增加 （P﹤0.01），且樣品劑量和ALT、AST、GSH 含量之間存在劑量依賴效應(yīng)。EAF-PPE 和GA、CO、EA 處理的高劑量組細(xì)胞中，ALT 含量分別下降14.24%，16.41%，16.22%，15.89%，AST 分別下降20.14%，19.51%，20.05%，18.46%，GSH 含量分別增加0.73%，0.66%，0.35%，0.28%。綜上所述，EAF-PPE 可以通過(guò)降低AST 和ALT 指標(biāo)含量，增加GSH 指標(biāo)含量，抑制酒精對(duì)BRL-3A 細(xì)胞的氧化損傷，且與其GA、CO、EA 含量呈正相關(guān)。

圖6 不同樣品對(duì)酒精損傷BRL-3A 細(xì)胞ALT、AST、GSH 含量的影響Fig.6 Effect of different samples on ALT，AST，GSH content of BRL-3A cells in alcohol injury

2.4.3 PPE 對(duì)酒精性BRL-3A 細(xì)胞中Nrf2、HO-1 的mRNA 表達(dá)的影響 Nrf2 是調(diào)控細(xì)胞對(duì)抗氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控著上百種抗氧化及解毒相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[19]，而Nrf2的過(guò)度表達(dá)有致癌作用[20]。HO-1 作為重要的抗氧化蛋白酶，可以提高機(jī)體的內(nèi)源性抗氧化能力，是目前研究預(yù)防氧化應(yīng)激的首選靶基因之一[21]。EAF-PPE 和GA、CO、EA 處理后酒精損傷BRL-3A 細(xì)胞中Nrf2 和HO-1 的mRNA 見圖7。

從圖7可以看出，與正常對(duì)照組相比，酒精會(huì)導(dǎo)致BRL-3A 細(xì)胞Nrf2 的mRNA 水平顯著增加（P﹤0.05），HO-1 的mRNA 水平顯著降低（P﹤0.01）；當(dāng)加入質(zhì)量濃度為70 μg/mL 的EAF-PPE 時(shí)，Nrf2 的mRNA 水平有顯著降低（P﹤0.05），其中CO、EA 處理后，下調(diào)效果非常顯著（P﹤0.01），分別下調(diào)了1.68%和0.72%。經(jīng)EAF-PPE 處理后，所有試驗(yàn)組HO-1 的mRNA水平均顯著增加（P﹤0.01）。綜上所述，EAF-PPE對(duì)Nrf2 和HO-1 的mRNA 的表達(dá)具有顯著影響。EAF-PPE 可以通過(guò)調(diào)控Nrf2 和HO-1 的mRNA表達(dá)，尤其是可以顯著上調(diào)抗氧化細(xì)胞，保護(hù)蛋白的基因表達(dá)，進(jìn)而緩解酒精對(duì)BRL-3A 細(xì)胞的氧化損傷，且EAF-PPE 中的GA、CO、EA 都有貢獻(xiàn)。

圖7 不同樣品對(duì)酒精損傷BRL-3A 細(xì)胞Nrf2 和HO-1 的mRNA 水平的影響Fig.7 Effect of different samples on the mRNA level of Nrf2 and HO-1 in BRL-3A cells damaged by alcohol

2.4.4 樣品對(duì)酒精性BRL-3A 細(xì)胞中Nrf2、HO-1的蛋白含量的影響 用Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞保護(hù)蛋白水平的變化，結(jié)果如圖8所示。與正常對(duì)照組相比，酒精導(dǎo)致BRL-3A 細(xì)胞中的Nrf2 蛋白含量顯著增加（P﹤0.01），細(xì)胞保護(hù)蛋白HO-1 蛋白含量顯著降低 （P﹤0.01）。當(dāng)加入一定量的EAF-PPE 時(shí)，各試驗(yàn)組的Nrf2 蛋白含量顯著降低（P﹤0.01），HO-1 蛋白含量顯著增加 （P﹤0.01）。因此，EAF-PPE 可以通過(guò)調(diào)控BRL-3A 細(xì)胞中Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)源性的抗氧化能力，從而降低酒精性肝細(xì)胞氧化損傷的程度。EAF-PPE 中的GA、CO 和EA 對(duì)細(xì)胞抗氧化蛋白水平提升作用優(yōu)于EAF-PPE 混合物，是酒精性肝細(xì)胞氧化損傷的有效成分。

圖8 不同樣品對(duì)酒精損傷BRL-3A 細(xì)胞Nrf2 和HO-1 蛋白水平的影響Fig.8 Effect of different samples on Nrf2 and HO-1 protein levels in BRL-3A cells with alcohol injury

3 討論

ALD 是指因攝入過(guò)量的酒精而導(dǎo)致肝臟損害的一系列病變，乙醇代謝所造成的炎癥免疫反應(yīng)和氧化應(yīng)激是引起酒精性肝臟損傷的主要致病因素[22]。在機(jī)體的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中HO-1是目前研究預(yù)防氧化應(yīng)激的首選靶基因之一，主要作為反映細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力的重要指標(biāo)[23]。然而，目前已知的HO-1 經(jīng)典誘導(dǎo)劑，如血晶素、鈷原卟啉等都具有毒性，這一特性限制了HO-1 在動(dòng)物及人體臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，因此開發(fā)出低毒甚至無(wú)毒的HO-1 誘導(dǎo)劑來(lái)防治酒精性肝損傷具有更大的應(yīng)用前景。近幾年，由于合成藥物潛在的負(fù)面影響或在食品添加劑方面出現(xiàn)的食品安全問題，促使研究人員對(duì)自然物質(zhì)的興趣逐漸增加，自然物質(zhì)尤指水果和樹葉已被用作治療各種疾病的傳統(tǒng)藥物[24]，PPE 屬于天然的植物多酚，它可以有效誘導(dǎo)HO-1基因的表達(dá)，這可能是余甘子對(duì)酒精性肝損傷具有保護(hù)作用的重要機(jī)制。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，BRL-3A 細(xì)胞存活率為48.01%，適合建立酒精性肝損傷模型；通過(guò)乙酸乙酯萃取得的PPE 對(duì)BRL-3A 細(xì)胞酒精性氧化損傷的緩解效果較好；PPE 通過(guò)降低MDA、ALT、AST 含量，升高SOD 和GSH 含量，降低Nrf2 的mRNA 水平和蛋白含量來(lái)阻止Nrf2 的過(guò)度表達(dá)，上調(diào)HO-1 的mRNA 水平和蛋白含量來(lái)促進(jìn)HO-1 的表達(dá)，對(duì)酒精性肝損傷起到保護(hù)作用。因此，PPE 可以通過(guò)調(diào)控Nrf2/HO-1 信號(hào)通路抑制酒精性肝損傷，且PPE 對(duì)酒精性肝損傷保護(hù)作用與其含有豐富的GA、CO、EA有關(guān)。