孫二娜,張小妹,趙伊凡,母智深,孫 健,羅 潔,王 然
(1 內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司 呼和浩特 011500 2 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 北京 100083 3 湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院 長沙 410128 4 中國農(nóng)業(yè)大學營養(yǎng)與健康系 北京 100083)
功能性消化不良 (Functional dyspepsia,F(xiàn)D)是一種常見的胃腸道疾病,世界范圍內(nèi)大約有21%的人受此病影響,中國的發(fā)病率為2%~24%[1]。根據(jù)羅馬Ⅲ標準,F(xiàn)D 癥狀包括上腹部疼痛和灼燒感,早飽,餐中或餐后飽腹等。這些癥狀是慢性的,至少每周發(fā)生1 次,并持續(xù)6 個月以上[2]。FD 是一種多因素疾病,包括胃腸運動改變、內(nèi)臟過敏、腸-腦軸失調(diào)、心理障礙、低度炎癥和免疫系統(tǒng)功能障礙等。最近的研究表明,腸道菌群失調(diào)參與了FD 的發(fā)生、發(fā)展[3-6]。由于病因未明,目前尚缺乏明確的治療FD 的手段[7],因此導致巨大的經(jīng)濟[8]和社會負擔[9]。
益生菌在治療功能性胃腸疾病方面具有很好的效果,尤其是對于腸易激綜合癥(IBS)的治療,其在改善IBS 癥狀方面表現(xiàn)為減少由腸道菌群紊亂導致的炎癥,改善腸黏膜通透性[10-12],說明益生菌可能對FD 有改善效果。另外,由于炎癥和黏膜損傷,十二指腸會定植大量的腸道微生物,從而參與FD 的治療過程[13]。隨機對照臨床試驗表明,加氏乳桿菌OLL2716 通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善FD 患者癥狀[14-15]。益生菌具有菌株特異性,目前用于改善FD 癥狀的益生菌菌株及其功能尚缺乏深入研究。
副干酪乳桿菌LC-37(LC-37)是從長壽老人糞便中分離得到的益生菌 (菌種專利保藏號:CGMCC 14055)。實驗室研究人員前期試驗表明,副干酪乳桿菌具有良好的耐受性,發(fā)酵性能優(yōu)越,是可應用于乳酸菌飲料中的優(yōu)良益生菌。本文通過臨床試驗研究含副干酪乳桿菌LC-37 乳酸菌飲料對FD 癥狀的改善效果和調(diào)節(jié)腸道菌群作用。
副干酪乳桿菌LC-37 乳酸菌飲料(LC-37 乳酸菌飲料),由蒙牛高科乳制品(北京)有限責任公司提供,LC-37 活菌含量5×108CFU/g,100 g/瓶。樣品制作方法:將20%脫脂乳粉、10%糖和70%水混合后,在95 ℃條件下褐變反應4 h,冷卻至37℃,接種LC-37 菌粉,接種量為5×106CFU/g,37 ℃發(fā)酵72 h。發(fā)酵結束后添加適量糖和檸檬酸鈉調(diào)整甜度和酸度,使樣品口感適宜飲用。
共招募30 名功能性消化不良受試者,男女不限,年齡18~65 歲。納入標準為:選擇功能性消化不良,伴有長期胃腸不適,主訴食欲不振,早飽、氣多,胃腸脹滿,嘔吐,不明原因慢性腹瀉或大便秘結等自愿受試者。排除標準為:急性腹瀉者,嚴重器質(zhì)性病變引起的消化不良者,合并有心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴重全身性疾病患者,體質(zhì)虛弱無法接受試驗者。本研究經(jīng)中國農(nóng)業(yè)大學倫理委員會審批。
萬分之一電子天平(TP-214),美國丹佛儀器公司;Sigma 3K30 低溫高速離心機,德國Satorious公司;MS2 漩渦振蕩儀,德國IKA 公司。
1.4.1 試驗設計 人群試驗共21 d,包括7 d 排空期和14 d 飲用期。將LC-37 乳酸菌飲料樣品置2~10 ℃冰箱存放。受試者在飲用期內(nèi)每日午飯或晚飯后1 h 內(nèi)飲用,每天飲用2 瓶。分別在排空期結束和飲用期結束時取糞便樣本,由醫(yī)生進行臨床癥狀評分[16](表1)。整個試驗過程中,受試者不可飲用任何發(fā)酵食品(包括泡菜、腐乳、酸奶、奶酪、活性乳酸菌飲料等),僅飲用牛奶。
表1 臨床癥狀積分Table 1 Clinical symptom score
1.4.2 腸道菌群測定 腸道菌群多樣性測序利用Illumina PE300 測序平臺,對16S rDNA 進行高通量測序,測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成?;贗-Sanger 云平臺 (https://www.isanger.com/)進行生物信息學及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
生物信息分析方法:對Miseq 測序得到的PE reads 首先依據(jù)overlap 關系進行拼接,同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾,區(qū)分樣本后進行OTU 聚類分析和物種分類學分析,基于OTU 進行多種多樣性指數(shù)分析,以及對測序深度的檢測。基于分類學信息,在各分類水平上進行群落結構的統(tǒng)計分析。在上述分析基礎上,對多樣本的群落組成和系統(tǒng)發(fā)育信息進行多元分析和差異顯著性檢驗等一系列統(tǒng)計學和可視化分析。
利用SPSS 21.0 軟件對結果進行統(tǒng)計分析,各項指標結果以“平均值±標準差”(±s)表示。自身對照資料采用配對t檢驗,P<0.05,視為顯著性差異,具有統(tǒng)計學意義。
受試者30 人,脫落1 人,有效受試樣本29人,基本情況(年齡、性別、BMI 等)見表2。在篩選受試者時,充分考慮性別、年齡、身體狀況等因素。
表2 受試者飲用前基本情況Table 2 Basic information of subjects before ingesting
2.2.1 臨床癥狀積分 對受試者飲用乳酸菌飲料前、后的臨床癥狀積分進行統(tǒng)計分析,結果見表3。飲用LC-37 乳酸菌飲料14 d,受試者腹痛癥狀完全消失,噯氣、泛酸、腹脹、食欲不振、腹瀉及便秘等癥狀評分顯著降低(P<0.05),表明飲用14 d,可顯著改善功能性消化不良癥狀。
2.2.2 臨床癥狀改善率 對受試者飲用后的臨床癥狀改善率進行統(tǒng)計分析,結果見圖1。飲用14 d后,腹痛、泛酸和食欲的改善率為100%,改善效果明顯。噯氣、腹脹、食欲不振和腹瀉及便秘的癥狀改善率為89.5%~94.7%,表明LC-37 乳酸菌飲料對功能性消化不良癥狀有顯著的改善作用。
表3 受試者臨床癥狀積分變化情況Table 3 Clinical symptom scores of subjects
圖1 飲用LC-37 后臨床癥狀改善率Fig.1 Improvement rate of clinical symptom scores after intaking LC-37 fermented milk
2.3.1 對菌群多樣性的影響 LC-37 乳酸菌飲料對腸道菌群多樣性的影響見圖2。飲用14 d 后與飲用前(0 d)相比,Chao 指數(shù)與Sobs 有所增加,不顯著(P>0.05);Shannon 指數(shù)無顯著性差異(P>0.05),說明飲用LC-37 乳酸菌飲料對腸道菌群的物種多樣性和豐富度沒有顯著影響。
圖2 腸道菌群多樣性指數(shù)Fig.2 Intestinal flora diversity index
2.3.2 對腸道菌群物種組成的影響 如圖3所示,在門水平,受試者腸道菌群中的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)。與飲用前(0 d)相比,飲用LC-37 乳酸菌飲料第14 天,受試者腸道中厚壁菌門減少,擬桿菌門增加,變形菌門增加,放線菌門減少。
圖3 受試者腸道菌群門水平的變化Fig.3 Change of intestinal flora at phylum level of subjects
在屬水平,對相對豐度大于1%的菌屬進行分析,結果見圖4。與飲用前(0 d)相比,飲用LC-37 乳酸菌飲料14 d,有益菌雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、普氏菌屬(Prevotella_9)和另枝菌屬(Alistipes)豐度增加,有害菌Dorea豐度降低。雙歧桿菌是人體主要的益生菌之一,參與消化、吸收、代謝、營養(yǎng)、免疫等過程,在維持腸黏膜屏障完整性方面起重要作用[17]。普氏菌屬與慢性功能性便秘患者增加排便次數(shù)和短鏈脂肪酸呈正相關[18-19]。另枝菌屬對DSS 誘導的結腸炎有緩解作用[20]。有害菌Dorea與結腸炎有關[21]。綜上所述,飲用LC-37 乳酸菌飲料可以調(diào)節(jié)功能性消化不良人群的腸道菌群組成,增加有益菌豐度,減少有害菌豐度。
圖4 受試者腸道菌群屬水平的變化情況Fig.4 Change of intestinal flora at genus level of subjects
2.3.3 對腸道菌群主成分的影響 PCoA 主成分分析見圖5。PC1 為第1 主坐標,對整體菌群的代表性為12.68%;PC2 為第2 主坐標,對整體菌群的代表性為11.56%,P=0.82,表明飲用LC-37 乳酸菌飲料前、后,腸道菌群的主成分未發(fā)生顯著改變。
圖5 受試者腸道菌群結構的PCoA 分析Fig.5 PCoA analysis of intestinal flora structure
2.3.4 飲用前、后兩組間差異顯著性檢驗 利用wilcoxon 秩和檢驗對飲用前、后兩組間差異顯著性進行檢驗,結果見圖6。與飲用前(0 d)相比,飲用LC-37 乳酸菌飲料14 d 后鏈球菌屬(Streptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和Muribaculaceae顯著增加,鏈球菌是腸道和口腔中廣泛存在的菌屬[22],乳桿菌屬在腸道中發(fā)揮重要的益生作用,可通過下調(diào)炎癥因子的表達起到抗炎的作用[23]。Muribaculaceae菌屬于擬桿菌門,在腸道中代謝產(chǎn)生丙酸[24]。丙酸是一種飽腹感的誘導劑,可影響能量攝入和飲食行為[25]。以上結果表明,飲用LC-37乳酸菌飲料能夠顯著增加腸道中有益菌乳桿菌屬和Muribaculaceae菌屬,從而緩解消化不良的相關癥狀。
圖6 飲用前、后兩組間差異顯著性檢驗Fig.6 Significant difference between the two groups before and after ingesting
本研究表明,飲用LC-37 乳酸菌飲料14 d,可以顯著緩解受試者功能性消化不良癥狀,調(diào)節(jié)受試者腸道菌群,增加有益菌雙歧桿菌屬、普氏菌屬和另枝菌屬的豐度,顯著增加有益菌乳桿菌屬和Muribaculaceae菌屬的豐度,從而緩解消化不良相關癥狀。