孫二娜，張小妹，趙伊凡，母智深，孫 健，羅 潔，王 然

（1 內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司 呼和浩特 011500 2 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 北京 100083 3 湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院 長沙 410128 4 中國農(nóng)業(yè)大學營養(yǎng)與健康系 北京 100083）

功能性消化不良 （Functional dyspepsia，F(xiàn)D）是一種常見的胃腸道疾病，世界范圍內(nèi)大約有21%的人受此病影響，中國的發(fā)病率為2%～24%[1]。根據(jù)羅馬Ⅲ標準，F(xiàn)D 癥狀包括上腹部疼痛和灼燒感，早飽，餐中或餐后飽腹等。這些癥狀是慢性的，至少每周發(fā)生1 次，并持續(xù)6 個月以上[2]。FD 是一種多因素疾病，包括胃腸運動改變、內(nèi)臟過敏、腸-腦軸失調(diào)、心理障礙、低度炎癥和免疫系統(tǒng)功能障礙等。最近的研究表明，腸道菌群失調(diào)參與了FD 的發(fā)生、發(fā)展[3-6]。由于病因未明，目前尚缺乏明確的治療FD 的手段[7]，因此導致巨大的經(jīng)濟[8]和社會負擔[9]。

益生菌在治療功能性胃腸疾病方面具有很好的效果，尤其是對于腸易激綜合癥（IBS）的治療，其在改善IBS 癥狀方面表現(xiàn)為減少由腸道菌群紊亂導致的炎癥，改善腸黏膜通透性[10-12]，說明益生菌可能對FD 有改善效果。另外，由于炎癥和黏膜損傷，十二指腸會定植大量的腸道微生物，從而參與FD 的治療過程[13]。隨機對照臨床試驗表明，加氏乳桿菌OLL2716 通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善FD 患者癥狀[14-15]。益生菌具有菌株特異性，目前用于改善FD 癥狀的益生菌菌株及其功能尚缺乏深入研究。

副干酪乳桿菌LC-37（LC-37）是從長壽老人糞便中分離得到的益生菌 （菌種專利保藏號：CGMCC 14055）。實驗室研究人員前期試驗表明，副干酪乳桿菌具有良好的耐受性，發(fā)酵性能優(yōu)越，是可應用于乳酸菌飲料中的優(yōu)良益生菌。本文通過臨床試驗研究含副干酪乳桿菌LC-37 乳酸菌飲料對FD 癥狀的改善效果和調(diào)節(jié)腸道菌群作用。

1 材料與方法

1.1 菌種與受試樣品

副干酪乳桿菌LC-37 乳酸菌飲料（LC-37 乳酸菌飲料），由蒙牛高科乳制品（北京）有限責任公司提供，LC-37 活菌含量5×108CFU/g，100 g/瓶。樣品制作方法：將20%脫脂乳粉、10%糖和70%水混合后，在95 ℃條件下褐變反應4 h，冷卻至37℃，接種LC-37 菌粉，接種量為5×106CFU/g，37 ℃發(fā)酵72 h。發(fā)酵結束后添加適量糖和檸檬酸鈉調(diào)整甜度和酸度，使樣品口感適宜飲用。

1.2 受試對象

共招募30 名功能性消化不良受試者，男女不限，年齡18～65 歲。納入標準為：選擇功能性消化不良，伴有長期胃腸不適，主訴食欲不振，早飽、氣多，胃腸脹滿，嘔吐，不明原因慢性腹瀉或大便秘結等自愿受試者。排除標準為：急性腹瀉者，嚴重器質(zhì)性病變引起的消化不良者，合并有心血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴重全身性疾病患者，體質(zhì)虛弱無法接受試驗者。本研究經(jīng)中國農(nóng)業(yè)大學倫理委員會審批。

1.3 儀器與設備

萬分之一電子天平（TP-214），美國丹佛儀器公司；Sigma 3K30 低溫高速離心機，德國Satorious公司；MS2 漩渦振蕩儀，德國IKA 公司。

1.4 方法

1.4.1 試驗設計 人群試驗共21 d，包括7 d 排空期和14 d 飲用期。將LC-37 乳酸菌飲料樣品置2～10 ℃冰箱存放。受試者在飲用期內(nèi)每日午飯或晚飯后1 h 內(nèi)飲用，每天飲用2 瓶。分別在排空期結束和飲用期結束時取糞便樣本，由醫(yī)生進行臨床癥狀評分[16]（表1）。整個試驗過程中，受試者不可飲用任何發(fā)酵食品（包括泡菜、腐乳、酸奶、奶酪、活性乳酸菌飲料等），僅飲用牛奶。

表1 臨床癥狀積分Table 1 Clinical symptom score

1.4.2 腸道菌群測定 腸道菌群多樣性測序利用Illumina PE300 測序平臺，對16S rDNA 進行高通量測序，測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成?；贗-Sanger 云平臺 （https：//www.isanger.com/）進行生物信息學及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

生物信息分析方法：對Miseq 測序得到的PE reads 首先依據(jù)overlap 關系進行拼接，同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進行OTU 聚類分析和物種分類學分析，基于OTU 進行多種多樣性指數(shù)分析，以及對測序深度的檢測。基于分類學信息，在各分類水平上進行群落結構的統(tǒng)計分析。在上述分析基礎上，對多樣本的群落組成和系統(tǒng)發(fā)育信息進行多元分析和差異顯著性檢驗等一系列統(tǒng)計學和可視化分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用SPSS 21.0 軟件對結果進行統(tǒng)計分析，各項指標結果以“平均值±標準差”（±s）表示。自身對照資料采用配對t檢驗，P<0.05，視為顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 受試者基本情況

受試者30 人，脫落1 人，有效受試樣本29人，基本情況（年齡、性別、BMI 等）見表2。在篩選受試者時，充分考慮性別、年齡、身體狀況等因素。

表2 受試者飲用前基本情況Table 2 Basic information of subjects before ingesting

2.2 臨床癥狀積分及改善率

2.2.1 臨床癥狀積分 對受試者飲用乳酸菌飲料前、后的臨床癥狀積分進行統(tǒng)計分析，結果見表3。飲用LC-37 乳酸菌飲料14 d，受試者腹痛癥狀完全消失，噯氣、泛酸、腹脹、食欲不振、腹瀉及便秘等癥狀評分顯著降低（P＜0.05），表明飲用14 d，可顯著改善功能性消化不良癥狀。

2.2.2 臨床癥狀改善率 對受試者飲用后的臨床癥狀改善率進行統(tǒng)計分析，結果見圖1。飲用14 d后，腹痛、泛酸和食欲的改善率為100%，改善效果明顯。噯氣、腹脹、食欲不振和腹瀉及便秘的癥狀改善率為89.5%～94.7%，表明LC-37 乳酸菌飲料對功能性消化不良癥狀有顯著的改善作用。

表3 受試者臨床癥狀積分變化情況Table 3 Clinical symptom scores of subjects

圖1 飲用LC-37 后臨床癥狀改善率Fig.1 Improvement rate of clinical symptom scores after intaking LC-37 fermented milk

2.3 LC-37 乳酸菌飲料對腸道菌群的影響

2.3.1 對菌群多樣性的影響 LC-37 乳酸菌飲料對腸道菌群多樣性的影響見圖2。飲用14 d 后與飲用前（0 d）相比，Chao 指數(shù)與Sobs 有所增加，不顯著（P＞0.05）；Shannon 指數(shù)無顯著性差異（P＞0.05），說明飲用LC-37 乳酸菌飲料對腸道菌群的物種多樣性和豐富度沒有顯著影響。

圖2 腸道菌群多樣性指數(shù)Fig.2 Intestinal flora diversity index

2.3.2 對腸道菌群物種組成的影響 如圖3所示，在門水平，受試者腸道菌群中的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）。與飲用前（0 d）相比，飲用LC-37 乳酸菌飲料第14 天，受試者腸道中厚壁菌門減少，擬桿菌門增加，變形菌門增加，放線菌門減少。

圖3 受試者腸道菌群門水平的變化Fig.3 Change of intestinal flora at phylum level of subjects

在屬水平，對相對豐度大于1%的菌屬進行分析，結果見圖4。與飲用前（0 d）相比，飲用LC-37 乳酸菌飲料14 d，有益菌雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、普氏菌屬（Prevotella_9）和另枝菌屬（Alistipes）豐度增加，有害菌Dorea豐度降低。雙歧桿菌是人體主要的益生菌之一，參與消化、吸收、代謝、營養(yǎng)、免疫等過程，在維持腸黏膜屏障完整性方面起重要作用[17]。普氏菌屬與慢性功能性便秘患者增加排便次數(shù)和短鏈脂肪酸呈正相關[18-19]。另枝菌屬對DSS 誘導的結腸炎有緩解作用[20]。有害菌Dorea與結腸炎有關[21]。綜上所述，飲用LC-37 乳酸菌飲料可以調(diào)節(jié)功能性消化不良人群的腸道菌群組成，增加有益菌豐度，減少有害菌豐度。

圖4 受試者腸道菌群屬水平的變化情況Fig.4 Change of intestinal flora at genus level of subjects

2.3.3 對腸道菌群主成分的影響 PCoA 主成分分析見圖5。PC1 為第1 主坐標，對整體菌群的代表性為12.68%；PC2 為第2 主坐標，對整體菌群的代表性為11.56%，P=0.82，表明飲用LC-37 乳酸菌飲料前、后，腸道菌群的主成分未發(fā)生顯著改變。

圖5 受試者腸道菌群結構的PCoA 分析Fig.5 PCoA analysis of intestinal flora structure

2.3.4 飲用前、后兩組間差異顯著性檢驗 利用wilcoxon 秩和檢驗對飲用前、后兩組間差異顯著性進行檢驗，結果見圖6。與飲用前（0 d）相比，飲用LC-37 乳酸菌飲料14 d 后鏈球菌屬（Streptococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和Muribaculaceae顯著增加，鏈球菌是腸道和口腔中廣泛存在的菌屬[22]，乳桿菌屬在腸道中發(fā)揮重要的益生作用，可通過下調(diào)炎癥因子的表達起到抗炎的作用[23]。Muribaculaceae菌屬于擬桿菌門，在腸道中代謝產(chǎn)生丙酸[24]。丙酸是一種飽腹感的誘導劑，可影響能量攝入和飲食行為[25]。以上結果表明，飲用LC-37乳酸菌飲料能夠顯著增加腸道中有益菌乳桿菌屬和Muribaculaceae菌屬，從而緩解消化不良的相關癥狀。

圖6 飲用前、后兩組間差異顯著性檢驗Fig.6 Significant difference between the two groups before and after ingesting

3 結論

本研究表明，飲用LC-37 乳酸菌飲料14 d，可以顯著緩解受試者功能性消化不良癥狀，調(diào)節(jié)受試者腸道菌群，增加有益菌雙歧桿菌屬、普氏菌屬和另枝菌屬的豐度，顯著增加有益菌乳桿菌屬和Muribaculaceae菌屬的豐度，從而緩解消化不良相關癥狀。