常松林，高曉余，柳雙鳳，孫 娜，董文明，田 洋，4*

（1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明 650201 2 食藥同源資源開發(fā)與利用教育部工程中心 昆明 650201 3 云南省生物大數(shù)據(jù)重點實驗室 昆明 650201 4 云南省藥食同源功能食品工程研究中心 昆明 650201 5 云南高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院 昆明 650201）

糖尿病是一種在全球范圍迅速發(fā)展的代謝性疾病，Ⅱ型糖尿病占糖尿病患者的90%以上[1]。Ⅱ型糖尿病發(fā)病率的上升與高度加工的食品相關(guān)[2]。藥物治療是糖尿病患者的常見選擇[3]?？诜堤撬幙稍谝欢ǔ潭壬险{(diào)節(jié)血糖，而多數(shù)藥物在治療的同時伴隨著一些不良影響，如體重增加、腹瀉、惡心、腹脹、酸中毒、胃腸功能紊亂、肝細胞和膽汁淤積性肝損傷等[4-5]。流行病學(xué)研究表明，Ⅱ型糖尿病在很大程度上可以通過改變飲食和生活方式來預(yù)防。從食品資源中尋找具有降糖作用的活性組分，是食品科學(xué)和營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域長期以來的研究熱點。

α-亞麻酸（α-Linolenic acid，ALA）是人體維持健康所必需的一種不飽和脂肪酸，具有多種營養(yǎng)保健和藥理作用，主要包括心血管保護、神經(jīng)保護、抗癌、抗骨質(zhì)疏松、抗炎和抗氧化等作用[6]。關(guān)于富含ALA 的飲食攝入與糖尿病發(fā)病風(fēng)險的研究已有諸多報道。在臨床研究中，2019年我國的一項前瞻性隊列研究顯示：n-3 PUFA 的低攝入量可能與較高的Ⅱ型糖尿病風(fēng)險有關(guān)[7]。上海女性[8]、新加坡華人[9]、日本男性[10]隊列研究顯示，攝入較多富含n-3 PUFA 的魚類等海產(chǎn)品與Ⅱ型糖尿病發(fā)病風(fēng)險呈負(fù)相關(guān)。隨機對照研究顯示，富含n-3 PUFA 的魚油及紫蘇油在Ⅱ型糖尿病合并血脂異常人群糖代謝方面均有改善作用[11-12]。Ⅱ型糖尿病動物模型研究也表明，富含ALA 的飲食可改善糖尿病小鼠高血糖[13]、高甘油三酯血癥[14]。富含ALA 的飲食對糖尿病具有諸多顯著有益作用，而這些研究很難直接證明單體ALA 對Ⅱ型糖尿病小鼠的有益作用。目前系統(tǒng)的文獻調(diào)研未見關(guān)于單體ALA 對Ⅱ型糖尿病小鼠血糖改善作用的報道。為此，本研究在高脂飼料結(jié)合腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立的Ⅱ型糖尿病小鼠模型中探究ALA的降血糖作用，旨在為ALA 輔助降血糖相關(guān)保健食品的研發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-亞麻酸（純度97%），上海鼓臣生物技術(shù)有限公司。

雄性C57BL/6J 小鼠（體質(zhì)量16～20 g），成都達碩實驗動物有限公司（動物生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2015-0001）；基礎(chǔ)飼料（LAD3001M）、高脂飼料（TP23400，60%熱量來自脂肪），南通特洛非飼料科技有限公司。

鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ），美國Sigma公司；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）測定試劑盒，武漢華美生物工程有限公司；胰島素（Insulin，INS） 測定試劑盒，美國ALPCO 公司；總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘 油 三 酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；動物組織總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑、實時定量PCR 試劑，寶生物工程（大連）有限公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

血糖儀（GA3 型），三諾生物傳感股份有限公司；糖化血紅蛋白檢測儀（博唐平TM A1C EZ），博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司；多功能酶標(biāo)儀（Flexstatin 型），美國ProteinSimple 公司；LightCyclerR480 II 熒光定量PCR 儀，德國羅氏診斷有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗流程 適應(yīng)性喂養(yǎng) （24±1）℃、12 h晝/夜循環(huán)，喂養(yǎng)小鼠7 d 后，隨機取12 只小鼠作為對照組，飼喂基礎(chǔ)飼料；其余54 只小鼠飼喂高脂飼料2 周后，兩次腹腔注射85 mg/kg STZ[15]。4 d 后（第21，22 天），連續(xù)2 次測定小鼠空腹血糖，血糖濃度均大于7.0 mmol/L 即判定為造模成功。剔除造模不成功小鼠后，將48 只小鼠隨機分為模型組和低、中、高劑量ALA 組（n=12），低、中、高劑量組每天分別灌胃0.25，0.50，1.00 g/kg 的ALA，對照組和模型組小鼠灌胃無菌水，連續(xù)灌胃42 d。每8 d 測定1 次小鼠體質(zhì)量，并于第0，21，42，63 天測定小鼠空腹血糖濃度，于第63 天檢測各組小鼠的糖化血紅蛋白水平。第64 天犧牲小鼠并采血，分離血清置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。剝離小鼠肝臟、附睪脂肪和腎周脂肪并稱量，仔細剝離腸道，測量小腸、大腸長度，計算各臟器指數(shù)。具體的流程如圖1所示。

圖1 實驗流程Fig.1 Experiment process

1.3.2 指標(biāo)檢測

1.3.2.1 口服葡萄糖耐量測定 小鼠隔夜饑餓（12 h） 后灌胃2 g/kg 葡萄糖溶液。分別于0，15，30，60，90，120 min 測定小鼠血糖濃度，并計算血糖變化的曲線下面積 （Area under the curve，AUC）。

1.3.2.2 小鼠血清指標(biāo)檢測 于-80 ℃冰箱中取出保存完好的血清，參照試劑盒說明書測定血清中LPS、INS、TC、TG、HDL-C、LDL-C 的水平。

1.3.2.3 功能基因檢測 按照動物組織RNA 提取試劑盒說明書提取小鼠肝臟中RNA，測定RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA 為模板進行熒光定量PCR 分析。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，兩組間比較采用獨立T 檢驗（兩尾法），P≤0.05 為差異性顯著，P≤0.01 為差異性極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALA 對Ⅱ型糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響

如圖2所示，在實驗第40 天后，與對照組相比，模型組小鼠體質(zhì)量顯著增加（P≤0.05），與模型組相比，ALA 中劑量組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P≤0.05）。結(jié)果表明ALA 能明顯抑制Ⅱ型糖尿病小鼠體質(zhì)量的增加。

圖2 ALA 對糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響（n=10～12）Fig.2 Effect of ALA on body weight in diabetic mice（n=10-12）

2.2 ALA 對Ⅱ型糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響

由表2可知，與對照組相比，模型組臟器指數(shù)均顯著升高（P≤0.01 或P≤0.05）；與模型組相比，ALA 高劑量組肝臟、附睪脂肪指數(shù)顯著降低（P≤0.05），中劑量組腎周脂肪、附睪脂肪指數(shù)顯著降低（P≤0.05）；此外，中劑量組大腸、腸道全長指數(shù)顯著下降（P≤0.05），而高劑量組小腸、大腸、腸道全長指數(shù)均顯著下降（P≤0.05）；表明ALA 具有改善Ⅱ型糖尿病小鼠臟器指數(shù)的作用。

表2 ALA 對糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響（n=10～12）Table 2 Effect of ALA on organ index in diabetic mice （n=10-12）

2.3 ALA 改善Ⅱ型糖尿病小鼠的血糖水平

由圖3a 可知，在ALA 干預(yù)期間 （第21～63天）模型組的空腹血糖濃度持續(xù)上升；與模型組相比，在第42 天時，低、中、高劑量ALA 組空腹血糖均顯著低于模型組（P≤0.05）；在實驗結(jié)束時（第63 天）中、高劑量組空腹血糖濃度同樣顯著低于模型組（P≤0.05）。此外，糖化血紅蛋白測定結(jié)果也表明ALA 可以改善Ⅱ型糖尿病小鼠干預(yù)期間的血糖狀況，以高劑量的ALA 效果最佳 （圖3b）。

圖3 ALA 改善Ⅱ型糖尿病小鼠的血糖水平（n=10～12）Fig.3 ALA improved the blood glucose levels in type Ⅱdiabetic mice（n=10-12）

2.4 ALA 改善Ⅱ型糖尿病小鼠的葡萄糖耐受性

由圖4a 可知，0 min 時中、高劑量ALA 組小鼠的血糖濃度顯著低于模型組（P≤0.05）；葡萄糖負(fù)荷15 min 時，各組小鼠血糖濃度升高達到峰值，模型組小鼠血糖濃度最高，低、中、高劑量ALA組小鼠血糖濃度明顯低于模型組 （P≤0.05），30 min 時低、中劑量組血糖濃度與模型組相比具有顯著差異 （P≤0.05），60 min 時中劑量組血糖濃度與模型組相比具有顯著差異（P≤0.05）。由圖4b 可知，模型組AUC 顯著高于對照組（P≤0.05），而中劑量組AUC 顯著低于模型組（P≤0.05）。上述結(jié)果表明ALA 可以改善Ⅱ型糖尿病小鼠的葡萄糖耐受性。

圖4 ALA 改善Ⅱ型糖尿病小鼠的葡萄糖耐受性（n=10～12）Fig.4 ALA can improve glucose tolerance in type Ⅱdiabetic mice （n=10-12）

2.5 ALA 對Ⅱ型糖尿病小鼠胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)的影響

如圖5a 所示，與對照組相比，模型組的空腹胰島素水平明顯升高（P=0.091）；與模型組相比，中劑量ALA 組胰島素水平明顯降低（P=0.066）；此外，中劑量ALA 顯著抑制了高脂飲食結(jié)合STZ誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病小鼠胰島素抵抗指數(shù)的顯著上升（P≤0.05，圖5b）。結(jié)果表明ALA 可以有效改善Ⅱ型糖尿病小鼠的胰島素抵抗。

圖5 ALA 降低Ⅱ型糖尿病小鼠的血清胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)（n=8）Fig.5 ALA reduced the insulin level and insulin resistance index in type Ⅱdiabetic mice （n=8）

2.6 ALA 對Ⅱ型糖尿病小鼠肝臟葡萄糖轉(zhuǎn)運及糖異生作用的影響

如圖6所示，與對照組相比，模型組Glut4的mRNA 表達水平極顯著下調(diào)（P≤0.01）；與模型組相比，低、中、高劑量ALA 組對糖尿病小鼠Glut4的mRNA 表達水平雖有上調(diào)作用，但差異不顯著（P＞0.05）；與對照組相比，模型組G6pc的mRNA 表達顯著上調(diào)（P≤0.05）；與模型組相比，ALA 高劑量組G6pc的mRNA 表達顯著下調(diào)（P≤0.05）。表明，ALA 可能通過抑制肝臟糖異生來有效降低Ⅱ型糖尿病小鼠的血糖水平。

圖6 ALA 對Ⅱ型糖尿病小鼠肝臟葡萄糖轉(zhuǎn)運及糖異生的影響（n=8）Fig.6 Effect of ALA on liver glucose transport and gluconeogenesis in type Ⅱdiabetic mice （n=8）

2.7 ALA 改善Ⅱ型糖尿病小鼠代謝內(nèi)毒素血癥及炎癥狀態(tài)

由圖7a 可知，與對照組相比，模型組小鼠的LPS 水平極顯著上升（P≤0.01）；與模型組相比，中劑量ALA 組小鼠的LPS 水平顯著降低（P≤0.05）。與對照組相比，模型組小鼠的MCP-1、TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA 表達水平極顯著上調(diào) （P≤0.01）；與模型組相比，高劑量ALA 顯著降低MCP-1、TNF-α 的mRNA 表達（P≤0.05）。

圖7 ALA 可改善Ⅱ型糖尿病小鼠代謝內(nèi)毒素血癥及炎癥狀態(tài)（n=8）Fig.7 ALA improved the metabolic endotoxemia and inflammation in type Ⅱdiabetic mice （n=8）

2.8 ALA 改善Ⅱ型糖尿病小鼠的脂質(zhì)代謝紊亂

由圖8a 可知，與對照組相比，糖尿病模型組小鼠的TG、TC 水平均極顯著升高（P≤0.01），而HDL-C 水平則極顯著下降（P≤0.01）。與模型組相比，中、高劑量ALA 組小鼠的TG、TC 水平顯著降低（P≤0.05）。與對照組相比，模型組小鼠的Fiaf、LPL、Pparα 的mRNA 表達水平顯著下調(diào)（P≤0.05）；與模型組相比，高劑量ALA 可顯著增加Pparα 的mRNA 表達水平（P≤0.05），ALA 對Fiaf、LPL的mRNA 表達水平也具有一定的提升作用（圖8b）。上述結(jié)果表明ALA 可改善Ⅱ型糖尿病小鼠的脂質(zhì)代謝紊亂。

圖8 ALA 可改善Ⅱ型糖尿病小鼠的脂代謝紊亂（n=8）Fig.8 ALA improved the lipid metabolism disorder in type Ⅱdiabetic mice （n=8）

3 討論

肥胖、高血糖、高胰島素血癥和高脂血癥是Ⅱ型糖尿病的關(guān)鍵特征。研究中常采用高脂飼料結(jié)合STZ 誘導(dǎo)小鼠Ⅱ型糖尿病模型[14]。在本實驗的第40 天后，模型組小鼠體質(zhì)量顯著高于對照組，表明高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖導(dǎo)致糖尿病小鼠體質(zhì)量持續(xù)增加，ALA 可以有效減少糖尿病小鼠體質(zhì)量增加（圖2）。有研究發(fā)現(xiàn)富含ALA 的亞麻籽油有助于降低Ⅱ型糖尿病肥胖小鼠的體質(zhì)量[16]，這與本研究結(jié)果一致。

空腹血糖及糖化血紅蛋白是診斷糖尿病的常規(guī)指標(biāo)，與口服葡萄糖耐受量、血清胰島素及胰島素抵抗指數(shù)相結(jié)合可反映機體的血糖調(diào)節(jié)能力、胰島β 細胞功能和胰島素敏感性[17]。有研究表明n-3 多不飽和脂肪酸[18]、亞麻籽油[19]可增加胰島素的敏感性，使用低濃度的胰島素可達到同樣的葡萄糖清除效果。在本研究中，ALA 顯著降低了糖尿病小鼠的空腹血糖水平、糖化血紅蛋白含量（圖3），顯著改善了葡萄糖耐受不良（圖4）及胰島素抵抗（圖5），研究結(jié)果表明ALA 可改善糖尿病小鼠血糖調(diào)節(jié)能力和胰島素敏感性，降低糖尿病小鼠血糖水平。

器官損傷及脂肪組織積累與糖尿病密切相關(guān)。在本研究中，ALA 顯著降低了糖尿病小鼠肝臟指數(shù)（表2），進而有可能改善了糖尿病小鼠的肝臟功能異常。脂肪過度積累會導(dǎo)致其功能失調(diào)，胰島素敏感性降低，ALA 顯著改善了糖尿病小鼠附睪脂肪、腎周脂肪沉積的現(xiàn)象（表2）。此外，胃腸道會分泌各種細胞因子，不僅促進食物消化，還可影響胰島素的釋放和外周組織的胰島素響應(yīng)性。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，糖尿病模型組小鼠腸道指數(shù)顯著增加，ALA 顯著降低了糖尿病小鼠腸道指數(shù)（表2），推測ALA 可能通過恢復(fù)腸道長度進而改善胃腸道功能。

肝臟葡萄糖代謝失調(diào)在糖尿病的發(fā)病機理中起著至關(guān)重要的作用[20]。肝臟是一種胰島素敏感性組織，它通過調(diào)節(jié)葡萄糖利用與糖異生之間的相互作用在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起作用[21]。G6pc基因在肝臟中表達量的增加會促進非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖，進而轉(zhuǎn)運至血管中提高血糖水平[22]。在本研究中，ALA 顯著降低了糖尿病小鼠肝臟G6pc的表達水平（圖6），抑制肝臟糖異生來改善糖尿病小鼠血糖水平。

胰島素抵抗的發(fā)生與炎癥密切相關(guān)，炎癥因子能干擾胰島素信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，也可與氧化應(yīng)激過程相互作用加重胰島素抵抗，而LPS 是炎癥啟動的主要誘導(dǎo)因子[23]。MCP-1 是一種將免疫細胞募集到炎癥部位的蛋白；TNF-α 是一種抑制胰島素分泌并誘導(dǎo)β 細胞凋亡的促炎性細胞因子，在胰島素的產(chǎn)生中起著關(guān)鍵作用[24]。研究顯示，抑制MCP-1受體[25]及抑制TNF-α 表達[26-27]，可改善Ⅱ型糖尿病小鼠胰島素抵抗和肝脂肪變性。另有研究報道，富含ALA 的亞麻籽油和n-3 PUFA 可影響胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，抑制炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NFκB 的轉(zhuǎn)錄活性，從而減少促炎性細胞因子的表達[28-29]。在本研究中糖尿病小鼠血清LPS 水平及肝臟MCP-1、TNF-α、IL-1β 和IL-6的mRNA 表達水平顯著增加，ALA 干預(yù)42 d 后使糖尿病小鼠血清LPS 水平及炎癥因子MCP-1、TNF-α 的表達水平顯著降低（圖7），該結(jié)果與上述前人研究結(jié)果基本一致。

血脂紊亂是糖尿病眾多典型并發(fā)癥之一[30]。機體內(nèi)脂肪代謝與糖代謝有密切關(guān)系，糖尿病患者由于胰島素分泌不足或細胞對胰島素作用不敏感，使葡萄糖進入肌肉細胞受阻，從而造成葡萄糖的利用率降低，血糖升高。脂肪分解產(chǎn)生大量游離脂肪酸，血液中存在的大量游離脂肪酸使得肌肉細胞對葡萄糖的消耗利用度更差，形成糖尿病的惡性循環(huán)[31]。有研究顯示，富含ALA 的亞麻籽油[32]和紫蘇油[33]均可改善糖尿病小鼠的高甘油三酯血癥。在本研究中，ALA 能使糖尿病小鼠血清中TG、TC 含量顯著降低（圖8a）。此外，本研究還檢測了肝臟中與TG 代謝密切相關(guān)的幾種功能基因的表達。與模型組相比，ALA 高劑量組表現(xiàn)出較高水平的Pparα 的mRNA 表達（圖8b），表明ALA 可能通過上調(diào)Pparα 的mRNA 表達來改善糖尿病小鼠脂質(zhì)代謝狀態(tài)。

綜上所述，ALA 可能通過抑制肝臟糖異生，降低肝臟組織炎癥，增加胰島素敏感性，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝來改善糖尿病小鼠高血糖、高脂血癥。本研究結(jié)果為進一步研究ALA 降糖、降脂分子機理研究以及相關(guān)保健食品的研發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。