陳 妍，蔡文琴，陳延儒，洪麗霞，巫小丹，黃冰靜，萬 茵，劉成梅，付桂明*

(1.南昌大學(xué)a.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室;b.食品學(xué)院;c.國際食品創(chuàng)新研究院，江西 南昌 330047；2.江西省樟樹貢酒業(yè)有限公司，江西 樟樹 331200)

特香型白酒是全國十二大香型白酒之一，其以整粒大米為釀造原料、新鮮谷殼為輔料，采用中高溫大曲為糖化發(fā)酵劑，以江西省特有的紅褚條石作為發(fā)酵容器，采用“三進四出”的混蒸續(xù)渣發(fā)酵工藝，“四出”是指蒸餾時將發(fā)酵池內(nèi)的酒糟從上至下分為四部分進行蒸餾，分別為面糟(一甑)、糧糟(中層，兩甑)以及底糟(一甑)。其中，底糟在蒸餾之后作為丟糟棄去，剩下三甑又繼續(xù)入池發(fā)酵，之前的面糟作為底糟入池，這就是所謂的“三進”。由于大米與酒糟混蒸，大米中米香成分蒸餾進入酒體中，原料經(jīng)過多次回窖發(fā)酵，不僅提高了原料的利用率，經(jīng)過多次發(fā)酵，也有利于累計風(fēng)味物質(zhì)。其具體的生產(chǎn)工藝如圖1所示[1-2]。

圖1 特香型白酒釀造工藝流程

大曲作為中國白酒生產(chǎn)的發(fā)酵劑，是白酒發(fā)酵過程中細菌，霉菌和酵母菌的載體之一[3]。大曲的生產(chǎn)采用自然接種方式，其微生物主要來自原材料和空氣，并在特定自然環(huán)境中逐漸適應(yīng)，以此形成復(fù)雜且獨特的微生物群落。研究證明中國白酒的香氣特征主要是來自于大曲中微生物群落代謝活動的結(jié)果[3-4]。而特香型白酒作為江西省特有香型的白酒，其獨特風(fēng)味的構(gòu)成與特香型白酒大曲獨一無二的制作工藝密不可分。這是因為特香型白酒大曲在制作過程中添加了一定比例的酒糟來提高大曲的酸度，從而定向的選擇了耐酸微生物在大曲上生長[5]。

酵母菌作為大曲中主要的微生物，同樣是影響白酒品質(zhì)和風(fēng)味的關(guān)鍵因素之一。大曲中的酵母菌除主要產(chǎn)乙醇的釀酒酵母外，還包含能夠產(chǎn)生大量酯酶并將糖、醛、有機酸等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酯、醇等芳香物質(zhì)的產(chǎn)香酵母[6]。產(chǎn)香酵母主要包括假絲酵母、異常漢遜酵母和畢赤酵母等[7-8]。近年來關(guān)于產(chǎn)香酵母的研究主要集中在從不同香型白酒大曲中篩選產(chǎn)香酵母，并將其應(yīng)用于白酒生產(chǎn)中，從而達到提高白酒中的總酯和各類脂肪酸乙酯含量的目的，使酒體更加協(xié)調(diào)、醇厚[9-10]。如從古井貢大曲中篩選出一株高產(chǎn)乙酸乙酯的異常威克漢姆酵母，將其用于濃香型白酒釀酒生產(chǎn)可以增加白酒的香氣，并提高白酒的品質(zhì)[11]。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，秋季生產(chǎn)的特香型白酒大曲中真菌含量豐富，且揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量較高。因此，本文擬采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)分離純化特香型白酒秋季大曲中的酵母菌菌株，對其進行生物學(xué)鑒定，并結(jié)合發(fā)酵力、酯化力及揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析。以期為完善和提高定向調(diào)控白酒釀造技術(shù)提供更多的高發(fā)酵力和產(chǎn)酯性能優(yōu)良的酵母菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品為江西省樟樹市樟樹貢酒業(yè)有限公司秋季(9，10月)生產(chǎn)大曲，曲房中各隨機挑選9,10兩個月份生產(chǎn)的大曲三塊，分別粉碎后過40目篩混合，于4 ℃保藏待用。

高粱粉、麩皮為市購；瓊脂粉，北京索萊寶科技有限公司；WLN培養(yǎng)基、麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基，青島海博生物科技有限公司；酵母菌DNA提取試劑盒、Taq酶，天根生化科技(北京)有限公司；4-甲基-2-戊醇，上海玉博生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZDX-35BI型坐式蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；Phenix 50-3A43L-A光學(xué)顯微鏡：鳳凰光學(xué)集團有限公司；PCR儀：賽默飛世爾科技有限公司；SP-756P紫外-可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；DVB/CAR/PDMS(50/30 μm)萃取頭：北京康林科技有限責(zé)任公司；6890N型氣相色譜質(zhì)譜儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 特香型白酒大曲中酵母菌的分離純化

1.3.2 酵母菌菌株鑒定

1.3.2.1 菌落形態(tài)觀察

被檢菌接種在WLN培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)36 h，選取單個菌落并觀察其顏色、形狀、光滑度、濕潤度等特征。

1.3.2.2 酵母菌細胞形態(tài)學(xué)觀察

被檢菌接種在YPD斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)36 h，呂氏美蘭染液染色，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.3.2.3 酵母菌子囊孢子觀察

結(jié)合嬰幼兒配方乳粉進口貿(mào)易的具體情況，參考前人的研究成果，本文認(rèn)為可能影響嬰幼兒配方乳粉進口的因素主要有國內(nèi)市場規(guī)模、國內(nèi)產(chǎn)量、進口平均價格、匯率水平以及國產(chǎn)產(chǎn)品和進口產(chǎn)品的質(zhì)量安全水平等因素。

被檢菌接種在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，用孔雀綠芽胞染液對其進行染色，晾干后在油鏡下觀察子囊孢子。

1.3.2.4 酵母菌分子生物學(xué)鑒定

分別將形態(tài)學(xué)上不同的菌種活化后，液體培養(yǎng)至對數(shù)生長期。用酵母DNA提取抽提試劑盒進行菌株總DNA提取。利用通用引物ITS1(5’CTTggTCATTTAgAggAAgTAA3’)/ITS4(5’TCCTCCgCTTATTgATATgC3’)對酵母5.8S rDNA ITS區(qū)序列進行PCR擴增，擴增條件參照崔小亮等[12]的方法。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心Genbank數(shù)據(jù)庫中利用Blast程序進行核酸序列比對。

1.3.3 酵母菌發(fā)酵力、酯化力的分析

酵母菌種按2%(v/w)接種量接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)20 d，制得麩曲樣品，參考QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用方法》測定酵母菌的發(fā)酵力和酯化力[13]。

1.3.4 酵母菌產(chǎn)揮發(fā)性代謝產(chǎn)物含量分析

樣品制備：取5 g麩曲樣品加入20 mL超純水中，加1%氯化鈣固體粉末，浸泡過夜，超聲30 min后，8 000 r·min-1離心10 min，上清液用0.22 μm有機膜過濾。

運用固相微萃取聯(lián)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(SPME-GCMS)對揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進行測定與分析[14]，取8.0 mL樣品，放入裝有2.0 g NaCl的頂空進樣瓶中，內(nèi)標(biāo)為4-甲基-2-戊醇。將頂空瓶于50 ℃恒溫萃取30 min。萃取后進行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

氣相色譜的工作參數(shù)：氣相色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣：氦氣；流速：1 mL·min-1；升溫程序：起始溫度為33 ℃，保持3 min，再以3 ℃·min-1的速率升溫到180 ℃，保持10 min，最后以6 ℃·min-1的速率升溫到230 ℃，保持20 min。進樣口溫度為250 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源：電子轟擊(EI)；檢測器電壓：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；質(zhì)量掃描范圍：28～500 u。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本文重復(fù)3次實驗。采用Excel 2013、Origin 9.0和SPSS 25.0軟件進行制圖與數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌初篩結(jié)果

大曲原料經(jīng)過分離純化后初步篩選得到40株酵母菌，根據(jù)WLN培養(yǎng)基上的菌落特征可以看出，部分酵母菌差異明顯(有些菌落表面粗糙有褶皺，有些表面呈現(xiàn)淡淡的綠色，且菌落大小不一)，又通過比較菌落形態(tài)特征、顯微鏡下細胞形態(tài)及有無子囊孢子形態(tài)的差異，將篩選得到的酵母菌共分為6組，(圖2和表1)。

A：菌落形態(tài)，B：細胞形態(tài)，C：子囊孢子形態(tài)(藍色)圖2 特香型白酒大曲酵母菌形態(tài)圖

表1 特香型白酒大曲中酵母菌的菌落及細胞形態(tài)特征

2.2 酵母菌26S rRNA分子生物學(xué)鑒定

每組3株，共挑選出18株長勢健壯，綜合特性良好的酵母菌株，對其進行分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果如表2所示。

表2 酵母菌26S rRNA測序比對結(jié)果

2.3 酵母菌理化指標(biāo)測定結(jié)果

發(fā)酵力可反映酵母菌利用可發(fā)酵糖類產(chǎn)生二氧化碳和酒精的能力，酯化力可反映酵母菌催化己酸和乙醇生成己酸乙酯的能力，這兩個指標(biāo)均是評價酵母菌發(fā)酵性能是否優(yōu)良的重要指標(biāo)[15,16]。因此，本研究對篩選出的8種酵母菌進行了發(fā)酵力和酯化力的測定，結(jié)果如圖3所示，SaccharomycescersvisiaeNCUF 303.1發(fā)酵力顯著高于其它酵母(P<0.05)，可達到5.22 U·g-1。產(chǎn)香酵母中PichiaanomalaNCUF 308.1、MillerozymafarinoseNCUF 307.1和CandidaglabrataNCUF 306.1的發(fā)酵力較高。而TrichosporonasahiiNCUF 301.1發(fā)酵力幾乎為0，說明該種酵母菌可發(fā)酵糖類產(chǎn)生二氧化碳和乙醇的能力是這8株酵母菌種最弱的。

酯化力結(jié)果如圖4所示，WickerhamomycesanomalusNCUF 304.1和CandidaglabrataNCUF 306.1的酯化力顯著高于其它酵母菌株(P<0.05)，分別為60.00和53.08 U·g-1。產(chǎn)香酵母酯化力的高低在一定程度上反映其產(chǎn)生香氣物質(zhì)的能力[17]。這一結(jié)果表明相比于其它產(chǎn)香酵母，W.anomalusNCUF 304.1和C.glabrataNCUF 306.1可能具有產(chǎn)生更多揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的能力，從而有效改善白酒的香氣成分。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)S.cersvisiaeNCUF 303.1酯化力較低。這可能是因為釀酒酵母在白酒釀造過程中作用主要是產(chǎn)生酒精，故其發(fā)酵力強，酯化力弱[18]。

圖3 酵母菌發(fā)酵力

圖4 酵母菌酯化力

2.4 酵母菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物含量測定結(jié)果

采用SPME-GCMS對8株酵母菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進行分析，結(jié)果如附表1所示。研究發(fā)現(xiàn)8株酵母菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物差別較大。其中，W.anomalusNCUF 304.1和P.anomalaNCUF 308.1固態(tài)發(fā)酵物中均檢測到揮發(fā)性物質(zhì)30種，但其具體種類不同，W.anomalusNCUF 304.1產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物含量最高，可達7.73 mg·kg-1(圖5)，這與酯化力的結(jié)果基本一致。其中，苯乙醇占W.anomalusNCUF 304.1產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)總含量的39.1%。苯乙醇是白酒中的重要香氣物質(zhì)，也是其他呈味化合物的前體物質(zhì)[19]。P.anomalaNCUF 308.1揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中不僅也發(fā)現(xiàn)了大量的苯乙醇，同時，也是唯一檢出產(chǎn)生乙酸乙酯的產(chǎn)香酵母。乙酸乙酯是白酒中主要的風(fēng)味物質(zhì)，呈香蕉或是蘋果的水果香、有刺激感，帶澀味，可賦予白酒清香感[20]。

T.asahiiNCUF 301.1固態(tài)發(fā)酵只檢測到了18種揮發(fā)性物質(zhì)，但其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物含量僅次于W.anomalusNCUF 304.1。其中，醛酮類物質(zhì)含量最多，這些物質(zhì)在白酒香氣方面起輔助作用，過量則會使白酒有明顯的刺激感和辛辣味[21]。C.glabrataNCUF 306.1、M.farinoseNCUF 307.1、P.kudriavzeviiNCUF 302.1和T.delbrueckiiNCUF 301.1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量也各不相同，而S.cersvisiaeNCUF 303.1固態(tài)發(fā)酵物中揮發(fā)性物質(zhì)含量很少，產(chǎn)酯能力弱。正是由于特香型白酒大曲中含有眾多種類不同的產(chǎn)香酵母，產(chǎn)生種類與含量豐富的揮發(fā)性物質(zhì)，才成就了特香型白酒的獨特風(fēng)味。

圖5 不同酵母菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物含量變化

3 結(jié)論

本研究首次從秋季生產(chǎn)的特香型白酒大曲中共分離鑒定出8種酵母菌，并發(fā)現(xiàn)這8株酵母菌中S.cersvisiaeNCUF 303.1發(fā)酵力最高(5.22 U·g-1)，W.anomalusNCUF 304.1酯化力(60.00 U·g-1)顯著高于其它酵母菌。并結(jié)合SPME-GCMS技術(shù)，對這8株酵母菌固態(tài)發(fā)酵下產(chǎn)揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量測定。最終發(fā)現(xiàn)W.anomalusNCUF 304.1產(chǎn)揮發(fā)性代謝產(chǎn)物含量最高。本研究結(jié)果可為定向調(diào)控白酒釀造中微生物結(jié)構(gòu)提供優(yōu)良的酵母菌種，為推動特香型白酒行業(yè)規(guī)范化的發(fā)展提供理論研究基礎(chǔ)。

附表1 酵母菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物種類和含量

續(xù)附表1 酵母菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物種類和含量