張靜美，陳曉陽，秦慶廣，徐學(xué)功

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，河南 鄭州 450046；2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)附屬鄭州市中醫(yī)院，河南 鄭州 450007）

冠心病（coronary heart disease，CHD）是一種常見的心血管疾病，具有高病發(fā)率、高死亡率的特點[1]。近年來，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，心血管疾病的病發(fā)率日益提高。冠狀動脈造影是診斷冠心病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在發(fā)現(xiàn)“罪犯血管”后，可以續(xù)行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention,PCI），簡稱PCI術(shù)，在一定程度上降低了由于急性心血管事件導(dǎo)致的高死亡率，但遠(yuǎn)端微栓塞進(jìn)入冠狀動脈微循環(huán)仍限制了進(jìn)一步的心肌搶救[2]。同時，PCI術(shù)后血管的再狹窄率居高不下，相關(guān)癥狀的控制情況仍不理想，西藥相關(guān)的副作用亦十分多見。中醫(yī)善于從整體出發(fā)，運用辨證論治的方法遣方用藥，可以有效改善冠狀動脈微循環(huán)，能夠較好地改善心功能，亦能在脂代謝、糖代謝、RASS系統(tǒng)調(diào)控等方面達(dá)到很好的“上游”治療目的，不僅彌補了單純介入治療的不足，同時能夠減少西藥的不良反應(yīng)。對于冠心病的中藥使用規(guī)律，已有學(xué)者做過大量研究，但冠心病PCI術(shù)后的中藥使用情況及相關(guān)藥理學(xué)作用機制的研究仍未得到學(xué)界重視[3-4]。

仝小林指出：“態(tài)靶辨證”是當(dāng)代中醫(yī)辨證論治的新模式，既要在宏觀整體層次去把握疾病本質(zhì)，更要從微觀靶點層次來提高辨證論治的精準(zhǔn)性[5]。徐學(xué)功教授師從于仝小林并長期從事于中西醫(yī)結(jié)合心血管領(lǐng)域的臨床與科研，在冠心病PCI術(shù)后的中醫(yī)藥治療方面秉承了仝小林“態(tài)靶辨證”的思想。徐學(xué)功教授認(rèn)為氣虛血瘀證是冠心病的主要證型，在PCI治療前，患者證型主要以血瘀為主，而PCI治療后的早期階段血瘀表現(xiàn)仍然明顯，進(jìn)入慢性期以后氣虛的本質(zhì)慢慢顯現(xiàn)，這主要是因為PCI治療在一定程度改善了患者標(biāo)實的狀況，但“絡(luò)脈”閉塞的情況仍然存在[6]。徐學(xué)功教授主張在傳統(tǒng)用藥的基礎(chǔ)上吸納西醫(yī)關(guān)于冠心病靶向治療的理念，以提高辨治的精準(zhǔn)性。故本文搜集整理了徐學(xué)功教授在“態(tài)靶辨證”思想指導(dǎo)下治療冠心病PCI術(shù)后的方藥，并利用數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析潛在的用藥規(guī)律與作用機制，為后續(xù)的臨床與科研提供一定幫助。

1 資料與方法

1.1 處方來源 從鄭州市中醫(yī)院門診與住院病歷系統(tǒng)調(diào)取徐學(xué)功教授治療冠心病PCI術(shù)后的中醫(yī)處方，日期選擇為2017年6月1日至2020年6月1日。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）方藥信息顯示完整，藥名、劑量清楚；（2）明確診斷為冠心病PCI術(shù)后；（3）使用方法為“口服”的方劑。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）未記錄具體方藥（包括單藥、處方不完整及無處方等類型）；（2）“口服”以外的其他使用方法，如塌漬、熏蒸、外用、穴位貼敷等；（3）同一病人或不同病人的相同方藥只錄入一次。

1.4 中藥錄入 根據(jù)《中藥學(xué)》和《中華藥典》確定中藥正名，去除炮制法、產(chǎn)地、別稱的影響，對部分藥物進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范化處理，比如姜半夏、法半夏、半夏統(tǒng)一為半夏，茯苓、云茯統(tǒng)一為茯苓等。先由一人操作中醫(yī)傳承輔助平臺軟件[7]，將上述處方錄入系統(tǒng)構(gòu)建方劑數(shù)據(jù)庫。為確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，由另外兩人進(jìn)行核對，核對完成后綜合結(jié)果進(jìn)行更正處理。

1.5 用藥規(guī)律分析 運用中醫(yī)傳承輔助平臺頻數(shù)統(tǒng)計功能，篩選出高頻藥物，得到藥物四氣、五味、歸經(jīng)等結(jié)果。其次，將支持度個數(shù)設(shè)置為20，置信度設(shè)置為0.6，進(jìn)行組方規(guī)律分析與規(guī)則分析。

1.6 核心藥物有效成分及靶點獲取 將核心藥物組合藥物逐次輸入到TCMSP[8]數(shù)據(jù)庫中（https://tcmspw.com/tcmsp.php），設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18進(jìn)行篩選，得到核心藥物有效成分及作用靶點，將上述靶點導(dǎo)入到UniProt數(shù)據(jù)庫[9]（https://www.uniprot.org/）中獲取所有靶點的基因名。

1.7 疾病-藥物共同靶基因的獲取 在人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards[10]（https://genecards.weizmann.ac.il/v3/）中以“coronary heart disease”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，獲取冠心病的靶基因，將上述藥物靶基因與疾病靶基因?qū)氲紻raw Venn Diagram網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中繪制韋恩圖，并得到“疾病-藥物”共同靶基因。

1.8 關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述“疾病-藥物”共同靶基因?qū)氲絊TRING網(wǎng)站[11]（https://string-db.org/）中，選取物種為“Homo sapiens”，得到靶點蛋白之間的相互作用關(guān)系。導(dǎo)出蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)文件后，利用Cytoscape[12]軟件優(yōu)化圖形，并根據(jù)度值獲取PPI[13]網(wǎng)絡(luò)中排名前10的關(guān)鍵基因（Hub Gene）。PPI網(wǎng)絡(luò)中，靶點以節(jié)點顯示，以邊相連接，關(guān)鍵靶點的邊更加密集，表示在PPI網(wǎng)絡(luò)所起到的作用就更大。

1.9 GO富集分析與KEGG富集分析 將“疾病-藥物”共同基因?qū)氲紻avid數(shù)據(jù)庫中，選擇物種為“Homo sapiens”進(jìn)行GO生物功能富集分析[14]與KEGG信號通路富集分析[15]。

1.10 成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖 將藥物活性成分、作用靶點、信號通路導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件中，構(gòu)建活性成分-作用靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1 處方獲取與用藥規(guī)律分析 根據(jù)上述納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入111首方劑。將其導(dǎo)入中醫(yī)傳承輔助平臺軟件，對111首方劑中的中藥進(jìn)行用藥頻數(shù)分析，共使用179味中藥，頻次前10名的藥物見圖1。藥物歸經(jīng)、四氣、五味統(tǒng)計結(jié)果見圖2~4。點擊中醫(yī)傳承輔助平臺的“藥物模式”，得到13個高頻藥對，包含中藥10味，見表1。點擊中醫(yī)傳承輔助平臺的“規(guī)則分析”，得到藥物組合規(guī)則分析。“關(guān)聯(lián)規(guī)則”的含義：當(dāng)某藥物出現(xiàn)在一首方劑中，其相伴隨的藥物組合出現(xiàn)的概率。藥物規(guī)則分析，見表2。點擊中醫(yī)傳承輔助平臺的“網(wǎng)絡(luò)展示”功能，得到10味中藥之間相互關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)展示圖，見圖5。

圖1 使用頻數(shù)排名前10的藥物

圖2 藥物歸經(jīng)統(tǒng)計分析圖

圖3 藥物四氣屬性頻數(shù)分布

圖4 藥物五味屬性頻數(shù)分布

表1 根據(jù)關(guān)聯(lián)規(guī)則分析得到的高頻藥物組合

表2 藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

圖5 藥物組合網(wǎng)絡(luò)展示圖

2.2 核心藥物的有效成分及靶標(biāo) 從TCMSP網(wǎng)站共得到川芎有效成分7個，丹參有效成分50個。再將上述有效成分分別輸入到TCMSP網(wǎng)站再次檢索，得到有效成分作用靶點，去重后共計61個，然后再將這些靶點蛋白導(dǎo)入到Uniprot網(wǎng)站轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的基因名。

2.3 “疾病-藥物”共同靶基因 從GeneCards網(wǎng)站獲取到冠心病靶基因6 810個，將疾病與藥物靶點導(dǎo)入到Draw Venn Diagram網(wǎng)站進(jìn)行韋恩圖分析，得到“疾病-藥物”共同靶基因53個。（見圖6）

圖6 “藥物-疾病”共同基因韋恩圖

2.4 關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò) 將上述53個共同基因?qū)氲絊TRING數(shù)據(jù)庫后得到關(guān)鍵PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7。將PPI網(wǎng)絡(luò)以TSV格式保存后，在Cytoscape軟件中打開，根據(jù)度值得到排名前10的Hub基因（核心基因），見圖8。

圖7 關(guān)鍵靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)

圖8 度值排名前10的Hub基因

2.5 GO富集分析與KEGG通路富集分析 將上述53個“疾病-藥物”共同靶基因?qū)氲紻avid數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析，與KEGG通路富集分析，根據(jù)Pvalue排名將結(jié)果可視化其中，GO和KEGG就是基于不同的分類思想而儲存的基因相關(guān)功能的數(shù)據(jù)庫。基因本體富集分析（GO分析），包括3個方面，即生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。根據(jù)GO富集分析結(jié)果顯示，“丹參-川芎”有效成分具有類固醇結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性等多個生物功能，能夠影響細(xì)胞核、突觸、突觸后模等多個細(xì)胞組分，從而參與DNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控、乙酰膽堿受體信號傳導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)信號通路傳導(dǎo)、心率調(diào)節(jié)、突觸傳遞等多個生物過程，進(jìn)而治療冠心病PCI術(shù)后的各種心血管相關(guān)癥狀。KEGG通路富集分析顯示，“丹參-川芎”藥對有效成分可以參與癌癥相關(guān)信號通路、乙型肝炎信號通路、PI3K-Akt信號通路、甲狀腺激素信號通路等。（見圖9~12）

圖9 生物過程富集分析結(jié)果

圖10 細(xì)胞組分富集分析結(jié)果

圖11 分子功能富集分析結(jié)果

圖12 KEGG信號通路富集分析結(jié)果

2.6 “丹參-川芎”藥對成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)分析 為了更清晰地展現(xiàn)“丹參-川芎”藥對成分、核心靶點與通路之間的關(guān)系，使用Cytoscape軟件構(gòu)建通路-活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖包含節(jié)點與邊。黃色節(jié)點代表藥物有效成分，綠色節(jié)點代表中藥名稱，藍(lán)色節(jié)點代表靶基因，紅色節(jié)點代表信號通路。邊表示節(jié)點之間的聯(lián)系，邊越多，則節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)圖中的作用越大。網(wǎng)絡(luò)圖可以直觀展示出“丹參-川芎”具有通過多成分、多靶點、多通路相互協(xié)調(diào)作用于冠心病PCI術(shù)后的特點。（見圖13）

圖13 藥物成分-靶點通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

本研究采用數(shù)據(jù)挖掘的分析方法，研究了徐學(xué)功教授治療冠心病PCI術(shù)后的111首方藥，共179味藥物。利用中醫(yī)傳承輔助平臺，發(fā)現(xiàn)頻數(shù)排名前10的依次為甘草、丹參、川芎、黃芪、當(dāng)歸、桂枝、赤芍、茯苓、人參、紅花，可見藥物功效主要集中在活血、補氣、溫陽通脈等方面。歸經(jīng)排名靠前的藥物分別為心經(jīng)、脾經(jīng)、肝經(jīng)、肺經(jīng)、胃經(jīng)等，以歸心經(jīng)最多。藥物四氣屬性分布排名為溫、寒、平、熱、涼，藥物溫性頻數(shù)高達(dá)510，占比近50%，反映了治療冠心病PCI術(shù)后以溫通心脈為主的治療大法。而五味屬性排名依次為甘、苦、辛等。根據(jù)關(guān)聯(lián)規(guī)則發(fā)現(xiàn)高頻藥物組合排名靠前的有川芎-丹參、川芎-黃芪、川芎-甘草、紅花-川芎、川芎-當(dāng)歸、丹參-黃芪、丹參-甘草、赤芍-丹參、黃芪-甘草、甘草-茯苓、甘草-桂枝、甘草-當(dāng)歸、黨參-甘草。而藥物置信度排名為川芎—＞丹參、紅花—＞川芎、黃芪—＞丹參、赤芍—＞丹參、黃芪—＞甘草、茯苓—＞甘草、桂枝—＞甘草、黨參—＞甘草?？梢姟暗?川芎”藥對在治療冠心病PCI術(shù)后中具有重要作用，同時黃芪在使用頻數(shù)與配伍關(guān)系上排名也較高，這與徐學(xué)功教授在冠心病PCI術(shù)后氣虛血瘀本質(zhì)的認(rèn)識是一致的?！侗静菥V目》曰：“丹參活血，通心包絡(luò)，治疝痛?！薄秳e錄》云：“丹參養(yǎng)血，去心腹痼疾結(jié)氣，腰脊強腳痹，除風(fēng)邪留熱。久服利人。”《日華子本草》云：“川芎治一切血，補五勞，調(diào)眾脈，破癥結(jié)宿血，養(yǎng)新血……及排膿消瘀血?！笨梢娭嗅t(yī)學(xué)早就認(rèn)識到“丹參-川芎”具有活血、化瘀、通心脈的作用。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，得到了“丹參-川芎”藥對與疾病的共同基因，并通過PPI網(wǎng)絡(luò)獲取了其中度值前10名的核心基因為TP53、MYC、EGFR、FOS、IL-6、ESR1、CCND1、VEGFA、CASP3、ERBB2。骨髓細(xì)胞瘤癌基因（MYC）具有轉(zhuǎn)錄因子的作用，可促進(jìn)眾多靶基因的表達(dá)，從而在細(xì)胞、組織和生物體水平上調(diào)控凋亡、增殖和代謝等生理過程。還可以通過驅(qū)動免疫細(xì)胞中多種代謝基因的表達(dá)，從而免疫細(xì)胞的分化和激活等起到調(diào)控作用[16]。有研究表明雌激素受體1（ESR1）的CC基因型與次要等位基因-397C在男性中有較高的冠心病風(fēng)險，另外一項Meta分析也佐證了這個觀點[17-18]。血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）信號傳導(dǎo)對心肌融合具有直接影響，能夠以劑量依賴性方式調(diào)節(jié)心臟的形態(tài)發(fā)生，還可以調(diào)節(jié)正常或病理性血管內(nèi)皮生長[19-20]。

根據(jù)GO富集分析結(jié)果顯示，“丹參-川芎”有效成分具有類固醇結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性等多個生物功能，能夠影響細(xì)胞核、突觸、突觸后模等多個細(xì)胞組分，從而參與DNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控、乙酰膽堿受體信號傳導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)信號通路傳導(dǎo)、心率調(diào)節(jié)、突觸傳遞等多個生物過程，進(jìn)而治療冠心病PCI術(shù)后的各種心血管相關(guān)癥狀。

KEGG通路富集分析顯示，“丹參-川芎”藥對有效成分可以參與癌癥相關(guān)信號通路（Pathways in cancer）、乙型肝炎信號通路（Hepatitis B）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、甲狀腺激素信號通路（Thyroid hormone signaling pathway）等信號通路。有研究表明以丹參為主要組成的方劑可以降低磷酸酶基因，通過PI3K-Akt信號通路抑制大鼠細(xì)胞凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷，還可以制炎癥和氧化應(yīng)激水平從而保護(hù)心肌，降低動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)[21-22]。丹參酚酸B可以調(diào)控VEGF等靶點，而促進(jìn)心肌梗死后的血管新生[23-24]。另外，丹參中的二氫異丹參酮Ⅰ、丹酚酸B等成分可以廣泛介導(dǎo)多個癌癥相關(guān)信號通路，對細(xì)胞的分化、增殖、凋亡起到作用[25-26]。研究表明川芎可以作用于雌激素受體α（ESRα）和缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）等促進(jìn)血管生成，還可以通過PI3KAkt信號通路顯著降低血脂水平及動脈粥樣硬化程度[27-28]。

綜上所述，本研究利用數(shù)據(jù)挖掘的方法分析了“態(tài)靶辨證”指導(dǎo)下的徐學(xué)功教授治療冠心病PCI術(shù)后的中醫(yī)處方，從宏觀癥候與微觀作用機制作出闡釋，說明了“態(tài)靶辨證”客觀的科學(xué)性。通過數(shù)據(jù)挖掘得到了核心藥物組合“丹參-川芎”，隨后利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了該核心藥物組合中的活性成分治療冠心病PCI術(shù)后潛在的作用機制，為后續(xù)的中醫(yī)藥治療及機制研究提供了一定的參考。