馮月男，孔祥定,2，肖洪彬，王寬宇,2

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

乳腺癌是女性癌癥死亡的第二大主要原因，它的發(fā)展涉及多種細胞類型的多個過程，其早期診斷是預防這種疾病的最佳方法之一，同時，乳腺癌的診斷和治療正經(jīng)歷著從“千篇一律”的方法向個性化醫(yī)學時代轉(zhuǎn)變的過程。中藥方劑作為個性化治療癌癥，且具有殺傷癌細胞及提高免疫力等作用而備受關注。隨著對中藥藥理的深入研究，中藥治療癌癥的廣譜性和低毒性逐漸顯現(xiàn)出來。扶正消巖湯是黑龍江中醫(yī)藥大學王寬宇教授臨床有效方，研究表明該方治療乳腺癌有效，且前期實驗證明了扶正消巖湯能提高乳腺癌荷瘤小鼠的免疫功能，但由于中藥成分復雜，其所起作用的機制仍不明確。本研究擬觀察扶正消炎湯對乳腺癌4T1小鼠模型體質(zhì)量及體內(nèi)乳腺癌腫瘤生長的影響。

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）是一個整合了藥物代謝動力學、藥物化學和藥物-靶標蛋白網(wǎng)絡-疾病網(wǎng)絡的中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺[1]，本研究運用網(wǎng)絡藥物學方法探尋扶正消炎湯治療乳腺癌的活性成分、靶基因及信號通略，探討扶正消巖湯抗乳腺癌的作用機制。

1 動物實驗

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞 乳腺癌細胞株4T1購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 實驗動物SPF級健康雌性Balb/c小鼠30只，體質(zhì)量18～22 g，6～8周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0041。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學安全評價中心，12 h晝夜循環(huán)，室溫恒定在22～24℃，相對濕度55%～65%，小鼠飼養(yǎng)和使用符合國際動物倫理法，并經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準。

1.1.3 藥物 扶正消巖湯，方藥組成：黨參20 g，白術15 g，陳皮15 g，枸杞子15 g，山萸肉15 g，女貞子15 g，半枝蓮10 g，半夏10 g，莪術5 g，白芍10 g，茯苓10 g。上述中藥飲片購于黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，均符合《中華人民共和國藥典》（2015年版）要求；環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字H32020857，批號：18050825）。

1.1.4 試劑RPMI1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號：SH3080 9.01）；青鏈霉素（美國Hyclone公司，批號：SV30010）；胰酶[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號：25200-056]；二甲基亞砜（北京索萊寶科技有限公司，批號：D8371）；PBS（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：PB18052）。

1.1.5 主要儀器L500型臺式低速自動平衡離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司）；GSPX-Ⅱ型CO2恒溫培養(yǎng)箱（山東博科科學儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 鼠源乳腺癌細胞株4T1置于含1%青鏈霉素、10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細胞貼壁情況，生長狀態(tài)良好的細胞經(jīng)0.25%胰酶消化，選取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 分組與造模 小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，將細胞密度為1×107的乳腺癌4T1細胞于每只小鼠腋窩皮下接種0.2 mL，當瘤體積約為5 mm3時即認為成瘤。將30只成瘤小鼠隨機分為模型組，環(huán)磷酰胺組和扶正消巖湯高、中、低劑量組，每組6只。

1.2.3 實驗給藥 環(huán)磷酰胺組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，30 mg/kg，扶正消巖湯高、中、低劑量組小鼠灌胃給予扶正消巖湯，生藥量分別為20、10、5 g/kg；模型組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥2周，2周后脫頸處死取瘤組織進行指標的測定。

1.2.4 觀察指標

1.2.4.1小鼠給藥前后體質(zhì)量 小鼠成瘤后給藥前稱體質(zhì)量，記為給藥前體質(zhì)量；給藥14 d后，脫頸處死各組實驗小鼠，稱量小鼠體質(zhì)量，記為取材前體質(zhì)量；分離各組瘤體，稱取瘤質(zhì)量，并記錄取材前體質(zhì)量－瘤質(zhì)量。

1.2.4.2抑瘤率 將“1.2.4.1”中記錄的瘤質(zhì)量按照公式計算抑瘤率。抑瘤率計算公式：（模型組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料采用“均數(shù)±標準差”（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 網(wǎng)絡藥理學研究

2.1 扶正消巖湯所含化學成分的收集與藥物調(diào)控靶標基因預測 以扶正消巖湯中半枝蓮、黨參、莪術、半夏、陳皮、枸杞、山萸肉、女貞子、白術、茯苓、白芍、當歸組成12味中藥為關鍵詞通過搜索TCMSP數(shù)據(jù)庫中所含化合物成分和靶基因，遵循藥物活性成分篩選條件，優(yōu)選口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug-like，DL）≥0.18的成分為候選活性成分[2]。通過Uniprot（www.uniprot.org）將復方中藥對應靶基因轉(zhuǎn)換為標準名稱簡寫。

2.2 乳腺癌疾病相關基因收集 將關鍵詞Breast Cancer錄入GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/），收集疾病相關基因。

2.3 構建化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡 扶正消巖湯作用基因與乳腺癌致病基因取交集，將扶正消巖湯有效化學成分和交集基因?qū)隒ytoscape構建“化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡（PPI）的構建 為探索靶點蛋白之間的相互作用，把“3.3”取得的交集基因錄入在線STRING軟件（http://string-db.org），繪制PPI網(wǎng)絡圖，利用插件CentiScape將置信度設為0.9，得出核心基因[3]。

2.5 GO生物功能富集分析與KEGG通路富集分析 把“3.4”所得的核心基因上傳至Cytoscape軟件，進行靶點的生物功能富集分析（GO富集分析）和信號通路富集分析（KEGG富集分析）[4]。

3 結 果

3.1 各組小鼠給藥前后體質(zhì)量比較 各組小鼠給藥前和取材前體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。取材后，扶正消巖湯高、中、低劑量組和環(huán)磷酰胺組小鼠體質(zhì)量增長均高于模型組（P＜0.01或P＜0.05）；扶正消巖湯高劑量組小鼠體質(zhì)量增長明顯高于環(huán)磷酰胺組（P＜0.05）；扶正消巖湯中、低劑量組小鼠體質(zhì)量增長與環(huán)磷酰胺組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組小鼠給藥前后體質(zhì)量比較（±s，g）

表1 各組小鼠給藥前后體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01；與環(huán)磷酰胺組比較，cP<0.05

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3.2 各組小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率比較 扶正消巖湯低、中、高劑量組和環(huán)磷酰胺組小鼠瘤質(zhì)量均低于模型組（P＜0.01或P＜0.05），說明扶正消巖湯和環(huán)磷酰胺均可抑制小鼠腫瘤生長，其中扶正消巖湯高、中、低劑量組的抑瘤率分別為51.6%、42.9%、25.1%，呈劑量依賴性；環(huán)磷酰胺組抑瘤率為92.3%。（見表2）

表2 各組小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率比較

3.3 扶正消巖湯有效化學成分分析及化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡的構建 通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，建立了包括1 320個化合物在內(nèi)的扶正消巖湯化學成分數(shù)據(jù)庫，其中符合OB≥30%，且DL≥0.18條件的候選化學成分共186個，合并藥味間共有成分，藥物有效成分共107個，扶正消巖湯中十二味藥共對應11 337個靶點，與有效成分對應的靶點有1 003個。乳腺癌致病基因13 229個，將藥物與疾病的基因取交集，共得到117個疾病與藥物的交集基因。Cytoscape構建扶正消巖湯“化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡。（見圖1）

圖1 扶正消炎湯與乳腺癌化合物-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡

4.4 PPI網(wǎng)絡的構建 為了更好地理解扶正消巖湯抗乳腺癌的作用機制，基于PPI關系利用STRING軟件構建了相關靶點的PPI網(wǎng)絡（見圖2）。PPI網(wǎng)絡包含117個蛋白質(zhì)節(jié)點，1 105條相互作用關系（連線），其中排在前30的核心基因結果見圖3。

圖2 扶正消炎湯與乳腺癌的蛋白互作網(wǎng)絡

圖3 扶正消巖湯防治乳腺癌的核心基因

3.5 扶正消巖湯防治乳腺癌靶標基因功能分析 將117個靶點導入Cytoscape中進行生物信息學分析，經(jīng)富集分析發(fā)現(xiàn)扶正消巖湯治療乳腺癌參主要通過調(diào)節(jié)有機環(huán)狀化合物、激素、脂質(zhì)、無機物、類固醇激素、化學應激、凋亡信號通路等生物過程發(fā)揮作用;在細胞構成中，膜筏所占比例最大；在分子功能中，半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、DNA結合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉(zhuǎn)錄因子結合、核受體活性關系較大。（見圖4）

圖4 扶正消巖湯防治乳腺癌作用生物過程分析

3.6 KEGG通路富集分析 經(jīng)通路富集分析發(fā)現(xiàn)扶正消巖湯抗乳腺癌的作用通路有113條，P<0.05有113條，P<0.01有93條通路，評分最高的5條通路的相關基因及評分，見表1。其中PI3K-Akt、癌癥中的MicroRNA、MAPK、TNF、NF-κB 5個信號通路是扶正消巖湯主要作用的通路，具體作用基因見表3。

表3 扶正消巖湯抗乳腺癌作用通路相關基因

4 討 論

扶正消巖湯中黨參和半枝蓮為君藥，半枝蓮有清熱解毒、散瘀消腫的功效，黨參具有補中益氣、健脾益肺的功效?，F(xiàn)代研究表明黨參具有抗癌功效，與半枝蓮配伍達到扶正祛邪的雙重功效；臣藥半夏與莪術具有破血消積、行氣止痛的功效，用于癥瘕痞塊的治療，且兩者均具有抗腫瘤作用；再臣以白芍養(yǎng)血斂陰止痛，白術益氣健脾，扶助正氣，共同增強君藥扶正祛邪之功；陳皮行氣止痛，燥濕化痰，枸杞子、山萸肉、女貞子滋陰補腎，諸味臣藥共助君藥扶正之功，提高機體整體的抗癌效應；佐藥以茯苓利水消腫，亦可增強白術益氣健脾功效，具有扶正祛邪之功，當歸活血化瘀，補血行氣，諸藥合用，共奏扶正消巖之功[5-6]。

實驗結果顯示，扶正消巖湯可以有效抑制小鼠體內(nèi)乳腺癌腫瘤的生長，且可以促進小鼠體質(zhì)量增加，同時經(jīng)網(wǎng)絡藥理學篩選出扶正消巖湯主要作用于乳腺癌的5條通路，前期實驗中對扶正消巖湯干預乳腺癌小鼠的細胞凋亡通路進行了研究，研究結果顯示扶正消巖湯可以下調(diào)Bcl-2、Caspase-9、VEGF的表達，這與篩選出的PI3K-AKT信號通路中的3個基因相重合，因此，推測扶正消巖湯的抗腫瘤機制可能通過干預PI3K-AKT信號通路來發(fā)揮作用。

PI3K-AKT信號通路在腫瘤發(fā)生中起重要作用，并能調(diào)節(jié)關鍵的細胞功能，包括腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，幾乎在所有人類腫瘤（包括乳腺癌）中都發(fā)現(xiàn)了PI3K-AKT信號通路的改變[7-10]。PI3K在細胞因子等胞外信號刺激下，使磷脂酰肌醇的羥基磷酸化、激活PIP3，并迅速結合其關鍵下游靶標AKT，進而使其磷酸化形成有激酶活性的磷酸化p-AKT，活化的AKT通過調(diào)控Bcl-2、Caspase-9等下游基因參與腫瘤的形成和發(fā)展過程。Bcl-2家族作為PI3K-AKT的下游分子，在調(diào)控細胞凋亡的過程中占有重要地位。Bcl-2家族分為抗凋亡和促凋亡兩類因子，均在細胞中起協(xié)同作用，在細胞凋亡過程中發(fā)揮開關的作用，其中抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xl，主要定位于細胞線粒體外膜，維持線粒體膜的穩(wěn)定性[11]；促凋亡因子Bax為Bcl-2的顯性抑制因子，可與Bcl-2形成異二聚體，從而使Bcl-2抗凋亡能力下降并促進腫瘤細胞凋亡[12-13]。而PI3K-AKT信號能夠通過調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白的表達，引起B(yǎng)ax從細胞質(zhì)向線粒體的外膜移動進而發(fā)生寡聚化，促進線粒體外膜上離子通道的形成，使線粒體膜的完整性被破壞，降低線粒體膜電位，最終誘導細胞凋亡[14-17]。因此，了解PI3K-AKT途徑對于了解乳腺癌的發(fā)展和進程，作為潛在治療靶點的作用，以及該途徑在乳腺癌患者中的預后和診斷價值具有重要意義。下一步我們將對本文分析的結果進行驗證，深入探討扶正消巖湯抗乳腺癌的作用機制，為其新藥開發(fā)提供實驗依據(jù)。