劉明嶺,鄧日輝,徐 強,林昌松
(廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405)
狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)常見的并發(fā)癥[1]。隨著患者生命的延長,以及長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑,骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)的發(fā)病率逐漸上升,嚴重影響患者生活質(zhì)量,成為SLE的十大重要挑戰(zhàn)之一[2]。因此,臨床醫(yī)生應(yīng)關(guān)注LN繼發(fā)的OP。前期臨床研究表明,脾腎陽虛證是LN繼發(fā)OP的常見證型。然而中醫(yī)證型缺乏客觀標志物,為尋找LN繼發(fā)OP脾腎陽虛證的生物標志物,本研究收集了LN繼發(fā)OP脾腎陽虛證、非脾腎陽虛證患者的血清,以及健康自愿者的血清,采用UPOC-QTOF-MS的代謝組學方法篩選、分析各組血清中的差異離子,通過商業(yè)化軟件Progenesis QI(version 2.2)和華大自主研發(fā)的代謝組學R軟件metaX對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,并基于數(shù)據(jù)庫KEGG進行代謝物鑒定、分析,最終得出LN繼發(fā)OP脾腎陽虛證的可能代謝標志物。現(xiàn)報告如下。
1.1 診斷標準LN診斷參照2009年美國風濕病學會修訂的SLE分類診斷標準[3],經(jīng)腎活檢明確診斷為LN。OP的診斷標準參照《中國人骨質(zhì)疏松癥建議診斷標準》(第3稿)[4]。脾腎陽虛證辨證標準參照《狼瘡腎炎的診斷、辨證分型及療效評定(試行方案)》中脾腎陽虛證的診斷標準[5],主癥:面浮肢腫,甚至全身浮腫,畏寒肢冷,神疲乏力,腰膝酸冷。次癥:面色無華,便溏尿少,惡心嘔吐。舌脈:舌淡胖,苔白,脈沉細弱。符合2項主癥,或1項主癥,2項次癥,參考舌脈即可確定。
1.2 納入標準(1)符合LN、OP診斷標準,辨證為脾腎陽虛證(醫(yī)師要求具有主治醫(yī)師及以上職稱,以保證準確性);(2)年齡18~60歲;(3)知情同意,自愿加入本研究。
1.3 排除標準(1)妊娠或哺乳期患者;(2)合并心、腦、造血系統(tǒng)等其他嚴重原發(fā)性疾病及精神病患者;(3)合并甲狀腺疾病、甲狀旁腺疾病、糖尿病、非骨質(zhì)疏松性骨病、關(guān)節(jié)結(jié)核等;(4)嚴重感染等并發(fā)癥或已行透析治療的患者。
1.4 研究對象 本研究獲得廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(批號:NO.K〔2020〕068)。收集2019年6月至2020年1月在廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院住院的LN繼發(fā)OP患者。依據(jù)中醫(yī)證型,將患者分為脾腎陽虛證LN繼發(fā)OP組(PSYX組)與非脾腎陽虛證LN繼發(fā)OP組(FPSYX組),并募集健康志愿者作為健康對照組(Health組)。
1.5 主要試劑與儀器 甲醇(Merck,批號:06035,規(guī)格:2.5L/瓶),甲酸(Dikma,批號:50144,規(guī)格:50 mL/瓶);冷凍離心機(德國Eppendorf,型號:5430R),恒溫攪拌器(中國Biocomma,型號:BC1000),Waters 2D UPLC(英國Waters,型號:ACQUITY UPLCI-Class 2D),高分辨質(zhì)譜儀(英國Waters,型號:Xevo G2-XS QTOF),ACQUITY UPLC BEH C18 column(英國Waters,型號:3173810125135),水液凈化系統(tǒng)(美國Millipore Corporation,型號:Milli-Q Integral),冷凍真空濃縮機(丹麥Labogene,型號:MaxiVacbeta),液相色譜儀(英國Waters,型號:2777C UPLC system)。
1.6 觀察指標 收集研究對象的一般資料,包括年齡、性別、病程、骨折病史、股骨頭壞死病史,以及糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、鈣劑、維生素D、雙膦酸鹽使用史;檢測腰椎及髖部骨密度;分析患者中醫(yī)證型。所有研究對象均在07:00:00空腹抽取靜脈血4 mL。置于肝素化的EP管中,離心10 min(10 000 g,4℃),分離上層血清,置于干凈的2 mL EP管中,儲存于-80℃冰箱中備檢。
1.7 檢測方法 代謝物提取、檢測方法步驟見圖1。
圖1 實驗流程圖
1.7.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC BEH C18column(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,Waters,UK)進行色譜分離,色譜柱柱溫為50℃,流速為0.4 mL/min,其中A流動相為水和0.1%甲酸,B流動相為甲醇和0.1%甲酸。對代謝物采用以下梯度進行洗脫:0~2 min,100%流動相A;2~11 min,0%~100%流動相B;11~13 min,100%流動相B;13~15 min,0%~100%流動相A。每個樣本的上樣體積為5 μL。
1.7.2 質(zhì)譜條件 利用高分辨串聯(lián)質(zhì)譜Xevo G2-XS QTOF(Waters,UK)分別進行正負離子模式采集,從色譜柱上洗脫下來的小分子。正離子模式下,毛細管電壓和錐孔電壓分別為3.0 kV和40.0 V。負離子模式下,毛細管電壓及錐孔電壓分別為2.0 kV和40.0 V。采用MSE模式進行Centroid數(shù)據(jù)采集,一級掃描范圍為50~1 200 Da,掃描時間為0.2 s,對所有先驅(qū)離子按照20 eV到40 eV的能量進行碎裂,采集所有的碎片信息,掃描時間為0.2 s。在數(shù)據(jù)采集過程中,對LE信號每3 s進行實時質(zhì)量校正。同時,每隔10個樣本進行一次混合后質(zhì)控樣本的采集,用于評估在樣本采集過程中儀器狀態(tài)的穩(wěn)定性。
1.8 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計學方法 臨床數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件,計量資料采用“中位數(shù)(四分位間距)”[M(P25,P75)]表示。不符合正態(tài)分布的計量資料采用非參數(shù)檢驗,計數(shù)資料采用χ2檢驗。實驗數(shù)據(jù)使用軟件MassLynx4.1(Waters,UK)進行分析,峰提取主要通過商業(yè)軟件Progenesis QI(version 2.2)(來源:Thermo Fisher Scientific,USA)實現(xiàn),包括峰對齊、峰提取、歸一化、去卷積和化合物鑒定等步驟。質(zhì)量控制-局部多項式回歸擬合信號校正,得到的數(shù)據(jù)采用多變量PLS-DA模型前兩個主成分的VIP值,結(jié)合單變量分析差異倍數(shù)(fold-change)和t檢驗的P值來篩選差異表達的代謝物。篩選條件[6]:(1)VIP≥1;(2)fold-change≥1.2或者≤0.8333;(3)P<0.05。三者取交集,得到共有的離子即差異離子。代謝通路分析基于數(shù)據(jù)庫KEGG、HMDB。
代謝組學數(shù)據(jù)分析軟件metaX(版本:1.0.3,來源:Beijing Genomics Institute,CN)[7],可進行單變量和多變量分析,從而獲得組間差異代謝物,組間比較采用t檢驗。以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 研究對象基本情況 非脾腎陽虛證包括熱毒熾盛證1例,肝腎陰虛證3例,氣陰兩虛證2例。PSYX組與FPSYX組的各項臨床資料比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3組均為女5人,男1人,在年齡、病程、骨折史、股骨頭壞死史方面比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PSYX組、FPSYX組骨密度明顯低于Health組(P<0.01)。(見表1)
表1 研究對象一般資料
2.2 質(zhì)量控制結(jié)果 質(zhì)量控制的離子流圖表明,儀器的穩(wěn)定性良好。(見圖2)
圖2 QC樣本TIC重疊圖
2.3 單變量分析 采用t檢驗和變異倍數(shù)分析。在統(tǒng)計分析過程中,進一步統(tǒng)計檢驗得到P值。最終結(jié)果以火山圖形式呈現(xiàn)差異倍數(shù)(Fold change)和P值兩個指標,通常以差異倍數(shù)≥1.2或≤0.833 3,P<0.05作為篩選差異代謝物的條件。結(jié)果表明FPSYX組與Health組的差異代謝物較多,而PSYX組與FPSYX組的差異代謝物明顯減少。(見圖3)。
圖3 組間比較單變量分析火山圖
2.4 多變量分析
2.4.1 主成分分析PCA主要用于觀察實驗?zāi)P椭械慕M間分離趨勢,以及是否有異常點出現(xiàn),同時從原始數(shù)據(jù)上反映組間和組內(nèi)的變異度。結(jié)果表明FPSYX組的離散較大,說明該組受試者的代謝物差異較大,而PSYX組與Health組較集中。(見圖4)。
圖4 組間比較PCA模型圖
2.4.2 PLS-DA分析 使用metaX軟件建立每兩個組之間的PLS-DA模型,若模型參數(shù)(R2和Q2)值較高,則當前PLS-DA模型較為可靠,同時對該模型參數(shù)R2和Q2進行置換檢驗,次數(shù)為200次。組間兩兩比較結(jié)果表明,與Health組比較,PSYX組與FPSYX組的R2和Q2值均較高,代謝物差異較大。而與FPSYX組比較,PSYX組的R2和Q2值均較低,代謝物差異較小。(見圖5)3組間比較,R2和Q2值較高,代謝物差異較大。(見圖6)
圖5 組間兩兩比較的PLS-DA圖
圖6 3組間比較的PLS-DA圖
2.5 鑒定到的差異 生物標志物基于數(shù)據(jù)庫HMDB、KEGG分析,與FPSYX組、Health組比較,PSYX組的N-(1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)羥胺、10-氧-11,15-植物二烯酸、2,3-二諾-8-異前列腺素上調(diào),9,10-環(huán)氧十八碳三烯酸醚烯酸、烯二酸、脫鎂葉綠酸鹽A、根霉素b、磷酸-大麻素、16α-羥雌酮、2-羥雌酮、16-葡萄糖醛酸-雌三醇、1α,25雙羥維生素D3、反式-3-氯-2-丙烯-1-醇下調(diào)。這些差異代謝物與化學致癌作用,α-亞麻酸代謝,逆行內(nèi)源性大麻素信號通路,激素的生物合成,氯代烷烴和氯代烯的降解等多個代謝通路相關(guān)。差異離子及鑒定結(jié)果見表2。
表2 鑒定的生物標志物及代謝通路
對篩選出來的差異離子進行聚類分析,用熱圖形式呈現(xiàn)。相對于整體水平,F(xiàn)PSYX組Phospho-anandamide水平升高,PSYX組trans-3-Chloro-2-propene-1-ol、1alpha,25-Dihydroxyvitamin D3、Rhizocticin B、Pheophorbide a、2-Hydroxyestrone水平降低。Health組2,3-Dinor-8-iso prostaglandin F1alpha水平降低,Pheophorbide a水平升高。(見圖7)
圖7 樣品生物標志物歸一化峰面積的熱圖和聚類圖
LN目前尚無對應(yīng)的中醫(yī)病名,根據(jù)水腫、蛋白尿、管型尿、膿尿、少尿或無尿等主要臨床表現(xiàn),LN可歸屬于中醫(yī)學中“水腫”“尿濁”“隆閉”“虛勞”等范疇。LN病因復(fù)雜,可分為內(nèi)因、外因。內(nèi)因主要是先天稟賦不足、后天失調(diào)、勞累過度或七情所傷,外因主要是外感風寒濕熱之邪,氣血、經(jīng)絡(luò)不通,日久及腎。葉任高、孫偉均認為其病機以腎虛、瘀、熱、毒為主,其中以腎虛為本,與陰虛關(guān)系最為密切,瘀、熱、毒為標[8-9]。隨著疾病的發(fā)展,又變生出濕濁、溺毒等病理產(chǎn)物,日久可形成氣陰兩虛、脾腎氣(陽)虛等證候。陰虛、熱毒、濕熱、瘀血是本病的病機關(guān)鍵。
脾為后天之本,氣血生化之源;腎為先天之本,藏精主骨生髓,骨的生長發(fā)育依賴氣血、腎精的滋養(yǎng)。脾陽虛,則水谷精微化生不足,腎陽不足,精不化氣,則導(dǎo)致骨骼失養(yǎng),骨枯不榮,發(fā)為“骨痿”,即OP的發(fā)生。陳喆[10]采用補脾益腎法治療脾腎陽虛證骨質(zhì)疏松癥患者,發(fā)現(xiàn)不僅可以改善癥狀,而且可以提高骨密度,從而證實了脾腎陽虛是OP的重要病機。
本研究是在前期LN繼發(fā)OP相關(guān)證候臨床研究的基礎(chǔ)上進一步開展的研究。本團隊前期統(tǒng)計了66例LN繼發(fā)OP患者的中醫(yī)證型,脾腎陽虛證占83.33%(55/66)。
本研究通過高通量代謝組學分析LN繼發(fā)OP脾腎陽虛證的生物標志物,發(fā)現(xiàn)了多種內(nèi)源性代謝物質(zhì)發(fā)生改變,涉及激素合成、代謝物降解等多個通路,與炎癥、損傷、免疫紊亂、骨細胞及骨代謝異常、腸道菌群失調(diào)有關(guān),揭示了LN繼發(fā)OP脾腎陽虛證可能的物質(zhì)基礎(chǔ)。
N-(1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基)羥胺,即PhIP,是一種致癌雜環(huán)芳香胺,對心、肺、肝、腎蛋白質(zhì)有氧化損傷[11]和化學致癌作用[12]。α-亞麻酸攝入量與骨密度呈正相關(guān)[13],在人體內(nèi)還可發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用[14]。反式-3-氯-2-丙烯-1-醇屬于氯代烷烴和氯代烯的降解物質(zhì),與菌群調(diào)節(jié)有密切關(guān)系[15-16]。研究提示PSYX組患者該物質(zhì)明顯上調(diào),可引起腎損傷,導(dǎo)致腎性骨?。沪?亞麻酸下調(diào),降低骨密度,導(dǎo)致炎癥、免疫失調(diào)。PhIP屬“濁物”,應(yīng)排泄出去,而α-亞麻酸屬于“精微物質(zhì)”,應(yīng)吸收。反式-3-氯-2-丙烯-1-醇可理解為“脾氣”“脾陽”的功能反應(yīng)。因脾陽虛,“升清降濁”功能下降,導(dǎo)致清者不升,濁者不降。因此,PhIP上調(diào),α-亞麻酸、反式-3-氯-2-丙烯-1-醇下調(diào)可能是脾陽虛衰的生物標志物。2,3-二諾-8-異前列腺素是花生四烯酸代謝通路中重要的炎癥介質(zhì),有促進或抑制骨與軟骨代謝的作用[17]。ZHANG A H等[18]應(yīng)用UPLC/MS方法探討了去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的生物標志物,發(fā)現(xiàn)花生四烯酸代謝等10種生物標志物顯著上調(diào)。脫鎂葉綠酸A是卟啉的衍生物,其和紫紅素18的氯素大環(huán)可結(jié)合重組RANKL,抑制RANK-RANKL相互作用,抑制RANKL依賴的模型細胞激活和RANK表達前體向破骨細胞分化[19],從而起到抗骨質(zhì)疏松的作用。本研究提示,脾腎陽虛證和非脾腎陽虛證LN繼發(fā)OP患者,2,3-二諾-8-異前列腺素明顯上調(diào),脫鎂葉綠酸A顯著下調(diào),提示這2種物質(zhì)可能是LN繼發(fā)OP的重要生物標志物。
雌激素(16α-羥雌酮、2-羥雌酮、16-葡萄糖醛酸-雌三醇)及1α,25雙羥維生素D3在骨代謝中扮演重要角色。2-羥雌酮、16α-羥雌酮、雌三醇均可增加骨量,提高骨密度,防止骨質(zhì)疏松的發(fā)生[20-22]。1α,25雙羥維生素D3是人體所必需的活性維生素D3,可通過調(diào)節(jié)鈣磷代謝,促進成骨樣細胞活性和骨形成蛋白合成,調(diào)節(jié)OPG、RANKL的表達[23],從而提高骨密度。雌激素、1α,25雙羥維生素D3的作用與中醫(yī)學中“天癸”“腎氣”的作用相似,均為腎所主。研究提示PSYX組的上述激素水平明顯下調(diào),考慮與腎陽虛衰有密切關(guān)系,可能是腎陽虛的生物標志物。楊新軍[24]發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后脾腎陽虛證OP患者血清25-OHD3水平顯著降低,與本研究較一致。
本研究屬非靶向高通量代謝組學分析,所檢測出的離子眾多,雖經(jīng)不斷篩選、對比鑒定、分析,但只能判定潛在分子標志物,尚需靶向分析驗證。此外,本研究結(jié)果也存在大量無法分析的分子,具體通路和作用無法得知。由于本研究的樣本量小,未必能代表整體,下一步將擴大檢測樣本量,減小偏倚。