易 柳，王瑞穎，高元峰，林麗美，歐陽榮

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410207）

烏藥葉為樟科山胡椒屬植物烏藥Lindera aggregate(Sims)Kosterm的干燥葉，性辛、溫，歸脾、腎經(jīng)，具有溫中理氣、消腫止痛的功效，主治脘腹冷痛、小便頻數(shù)、風濕痹痛、跌打傷痛、燙傷，其以葉片嫩綠時采摘質(zhì)量佳[1]。烏藥葉藥用歷史悠久，在歷代古文獻中多有記載。烏藥葉最早收載于唐代《本草拾遺》：“炙研煎飲代茗，補中益氣，止小便滑數(shù)。”宋《開寶本草》也有記載：“烏藥……其葉及根嫩時采作茶片炙碾，服能補中益氣，偏止小便滑數(shù)。”明《食物本草》曰：“今人采……南燭、烏藥諸葉皆可為飲，以亂茶云?！泵鳌侗静菝审堋份d：“葉采入劑，下氣亦靈。但力遲緩，須醋浸炙?！泵鳌侗静菥V目》曰：“……烏藥以產(chǎn)天臺者為勝，其嫩葉炙碾煎飲代茗，補中益氣，止小便滑數(shù)?！鼻濉夺t(yī)林纂要》云：“溫中燥脾，消食殺蛔。治腹中寒痛?！贝送?，張茂江等[2]對烏藥葉的臨床應用也有所報道，其常以烏藥葉外敷治癰疽、內(nèi)服治胃痛。

現(xiàn)代研究表明，烏藥葉中含有氨基酸與蛋白質(zhì)、有機酸、甾體皂苷、酚類與糅質(zhì)、糖類、蒽醌、黃酮、香豆素與萜類內(nèi)酯、強心苷等化學成分[3-5]。研究[6-11]發(fā)現(xiàn)烏藥葉主要含有倍半萜類和黃酮類化合物，其中黃酮類化合物是烏藥葉發(fā)揮藥理作用的主要活性物質(zhì)。然而，現(xiàn)階段有關烏藥葉的研究并不多，且其質(zhì)量標準未明，極大地限制了其臨床運用。故而，本研究采用HPLC同時測定烏藥葉中4個主要的黃酮類成分含量，旨在構建湖南省內(nèi)不同地區(qū)烏藥葉的指紋圖譜并對其進行化學模式識別分析，以期為研究烏藥葉后續(xù)的藥效和作用機制提供物質(zhì)基礎，為提高烏藥植物資源的整體利用率提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑 烏藥新鮮葉采自湖南省長沙市、湘潭市、益陽市、醴陵市、衡山縣等不同地區(qū)，共16批樣本，皆經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院歐陽榮教授鑒定為樟科山胡椒屬植物烏藥Lindera aggregate(Sims)Kosterm的葉。不同產(chǎn)地烏藥葉樣本的采集地和采集時間見表1。

表1 烏藥新鮮葉采收地及采收時間

蘆丁對照品（批號：wkq19010203，純度：HPLC≥98%）、金絲桃苷對照品（批號：wkq19040913，純度：HPLC≥98%）、異槲皮苷對照品（批號：wkq19012403，純度：HPLC≥98%）、槲皮苷對照品（批號：wkq19031304，純度：HPLC≥98%）（四川省維克奇生物科技有限公司）；甲醇、乙腈均為色譜純；磷酸為分析純；水為超純水。

1.2 主要儀器Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Agilent HC-C18(2)（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱（美國安捷倫公司）；DYQC-30型醫(yī)用超聲波清洗機（連云港歐倍潔醫(yī)療設備有限公司）；WJX-A400型多功能高速搖擺粉碎機（上海緣沃工貿(mào)有限公司）；AE2204電子分析天平（湖南湘儀天平儀器設備有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent HC-C18(2)（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)，梯度洗脫：0~3 min，12%A；3~26 min，12~22.5%A；26~42 min，22.5~24%A；42~45 min，24~12%A。流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：343 nm；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取真空干燥至恒重的對照品蘆丁0.005 8 g、金絲桃苷0.005 8 g、異槲皮苷0.007 2 g和槲皮苷0.005 6 g，分別置于10 mL容量瓶內(nèi)，加入甲醇，定容，使其配成蘆丁0.58 mg/mL、金絲桃苷0.58 mg/mL、異槲皮苷0.72 mg/mL和槲皮苷0.56 mg/mL的單一對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 將采摘的烏藥新鮮葉用清水洗凈，自然風干，115℃殺青20 min，70℃下干燥7 h，粉碎后過0.45 mm（40目）金屬網(wǎng)篩。

精密稱取上述干燥的烏藥葉粉末1.0 g，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，浸泡1 h，稱定質(zhì)量，超聲處理1 h，放冷，加甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，過濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液。將續(xù)濾液稀釋5倍，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 分別取空白溶劑、混合對照品溶液和供試品溶液，在上述色譜條件下依法測定。結(jié)果顯示，4種對照品色譜峰相應的保留時間處，空白溶劑無干擾，各成分峰形較好且均能達到基線分離，分離度均大于1.5；理論塔板數(shù)按槲皮苷計均不低于5 000。

2.3.2 線性關系考察 精密量取混合對照品溶液，將混合對照品溶液用甲醇稀釋成一系列的梯度濃度溶液后，按照相應的色譜條件測定。以待測化合物濃度對峰面積進行線性回歸，得到各成分標準曲線。結(jié)果顯示，在定量范圍內(nèi)各化合物的線性良好，各成分回歸方程及相關系數(shù)見表2。

表2 各成分回歸方程及相關系數(shù)

2.3.3 精密度試驗 精密稱取烏藥葉樣品1.0 g，按上述方法制成供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷峰面積的RSD（n=6）分別為0.60%、1.60%、0.94%、0.46%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液按照上述色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，測得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷峰面積的RSD（n=6）分別為0.12%、1.20%、1.57%、0.28%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復性試驗 精密稱取烏藥葉樣品6份，每份約1.0 g，按照上述方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣，測定蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷的峰面積，計算RSD值分別為1.82%、1.90%、1.62%、1.17%，表明重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取醴陵烏藥葉樣品6份，每份約1.0 g，精密稱定，分別精密加入蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷對照品溶液0.130、0.260、0.375、14.500 mL，再加入甲醇34.735 mL，按照上述方法制備供試品溶液，分別進樣，測定蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷的峰面積，加樣回收率見表3。

表3 各成分的加樣回收率測定結(jié)果（n=6）

2.4 HPLC法同時測定烏藥葉中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷的含量 將16批烏藥葉樣本按照“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，并按照“2.1”項下的色譜條件，分別進樣，記錄蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷的峰面積，通過回歸方程，計算各樣本中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮苷的含量。（見表4）

表4 不同產(chǎn)地烏藥葉藥材中黃酮類成分的含量測定（n=3）

2.5 指紋圖譜的建立及相似度分析

2.5.1 指紋圖譜的建立 取不同產(chǎn)地的16批烏藥葉，按“2.2.2”項下樣品處理方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，采用“2012版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，以S1為參照圖譜，時間窗寬度為0.1，通過多點校正、全譜峰匹配，得到16批烏藥葉指紋圖譜共有模式及對照譜圖譜，見圖1。經(jīng)匹配后標定了9個共有峰，經(jīng)過與對照品色譜圖及保留時間對比，發(fā)現(xiàn)異槲皮苷和槲皮苷峰最為明顯。

圖1 16批烏藥葉指紋圖譜圖

2.5.2 相似度評價 以對照圖譜為參照，對16批烏藥葉指紋圖譜進行相似度評價，結(jié)果16批烏藥葉相似度為0.840~0.989，表明相似度良好。（見表5）

表5 不同產(chǎn)地烏藥葉生品相似度分析

2.6 化學模式識別分析

2.6.1 聚類分析 應用SPSS 24.0軟件，以共有峰的峰面積為變量，進行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果顯示，16批烏藥葉樣本可分為4類，Ⅰ類：S3~S4，Ⅱ類：S1、S16，Ⅲ類：S2、S5、S8，Ⅳ類：S6~S7、S9~S15。其中S6~S7、S9~S15均采自湖南益陽地區(qū)，由此說明同一產(chǎn)地不同批次樣本間差異較小。Ⅰ類中S3、S4分別采自湘潭、長沙；Ⅱ類中S1、S16分別采自醴陵、衡山；Ⅲ類中S2、S5采自衡山，S8采自益陽，Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類中的某些樣本雖采自不同地區(qū)，卻歸為同一類，推測可能與不同批次樣本的生長環(huán)境和采收時間等有關。（見圖2）

圖2 16批烏藥葉聚類分析

2.6.2 主成分分析 應用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)標準化后進行主成分分析，首先篩選出特征值大于1且貢獻率大于85%的成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異較大的2個主成分的特征值均大于1，其累計貢獻率大于85%，即這2個主成分包含了9個共有成分的89.002%的信息，符合主成分分析條件。結(jié)果烏藥葉第一主成分特征值為6.267，貢獻率為69.632%；第二主成分特征值為1.743，貢獻率為19.370%（見表6）。碎石圖結(jié)果顯示，上述的2個主成分的坡度較陡，表明這2個主成分是評價烏藥葉質(zhì)量的代表性成分（見圖3A）。以9個共有峰的峰面積為變量，導入SIMCA 16.0軟件，繪制主成分得分圖（見圖3B）。結(jié)果表明主成分分類結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致，但長沙地區(qū)的烏藥葉樣本不在置信區(qū)間內(nèi)，結(jié)合兩項分析，說明同一產(chǎn)地不同批次樣品間差異較小，不同地區(qū)烏藥葉的質(zhì)量仍存在著一定的差異。

表6 烏藥葉主成分特征值及累計方差貢獻率

圖3 16批烏藥葉主成分分析結(jié)果

3 討 論

湖南地區(qū)的烏藥植物資源十分豐富。目前，烏藥植物主要取其塊根入藥[12]，而地上部分的藥用價值尚未被開發(fā)，出現(xiàn)“湖南烏藥作柴燒”的現(xiàn)象，以致烏藥植物資源嚴重浪費。盡管烏藥葉在歷代文獻中多有記載，藥用歷史悠久，但臨床上烏藥葉的藥用利用率極低?；瘜W成分研究發(fā)現(xiàn)，烏藥葉中含有多類成分，其中黃酮類成分是其發(fā)揮藥理作用的主要活性物質(zhì)，然而烏藥葉的質(zhì)量標準不清。參考其他文獻[13-20]，本研究構建了烏藥葉黃酮類成分含量測定方法。（1）提取方法考察方面：進行單因素考察，對比了甲醇超聲提取與70%乙醇回流提取的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)兩種提取方法所得烏藥葉中的黃酮類成分含量差異不明顯，且超聲提取方便、快捷，故而本研究采用甲醇超聲法制備供試品溶液。（2）HPLC方法構建方面：①波長方面，考察了250~360 nm波段，發(fā)現(xiàn)在343 nm的條件下，基線較穩(wěn)且峰形最好，最終確定343 nm作為檢測波長；②進樣量方面，考察了10、20 μL，根據(jù)實際需要以及峰形峰寬，確定進樣量為10 μL；③柱溫方面，考察了25~35℃，根據(jù)色譜圖峰形、峰高，確定柱溫為30℃；④流速方面，考察了1.0、1.2 mL/min，從色譜圖峰形、峰高來看，兩種流速無明顯差異，考慮到色譜柱的使用壽命，最終確定流速為1.0 mL/min。此外，在上述確定的HPLC條件下，我們對烏藥葉中的槲皮素和山奈酚也進行了含量考察分析，發(fā)現(xiàn)其含量極低，故在本研究中未采用這兩個成分作為定量分析的指標。本研究對烏藥葉中的4個黃酮類成分進行含量測定，結(jié)果顯示16批烏藥葉樣品中各成分的含量高低不同，說明不同地區(qū)烏藥葉的質(zhì)量存在著一定差異。

本研究通過分析湖南多個產(chǎn)地16批烏藥葉指紋圖譜，共確認了9個共有峰，指認了其中2個重要成分，分別為異槲皮苷、槲皮苷。在色譜分析的基礎上，采用聚類分析對16批烏藥葉樣本進行研究，發(fā)現(xiàn)具有明顯的分類趨勢，大致分為4類，其中個別樣品與同產(chǎn)地其他批次樣品差異較大，這可能與樣品采收季節(jié)等條件有關。在不同生長時期，植物內(nèi)各成分的含量隨時間變化，這提示著藥材需在適宜的時間采收，才能保證藥材的質(zhì)量。我們采用主成分分析篩選出導致樣品不同分類差異的主成分，發(fā)現(xiàn)這2個主成分的累計方差貢獻率為89.002%，說明了前2個主成分能夠概括原有數(shù)據(jù)的絕大部分信息，推測異槲皮苷、槲皮苷對主成分有較大影響，為烏藥葉的多成分含量測定提供了依據(jù)。