王 雙，王婷婷，田俊娜，張 蕻，施懷生，趙思俊，樸晉華

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619；2.山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西 太原 030001）

學(xué)習(xí)記憶障礙是一種臨床常見病癥，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，不僅影響了人們的工作和生活，嚴(yán)重者還會(huì)誘發(fā)其他疾病。近年來，中醫(yī)藥在改善學(xué)習(xí)記憶障礙方面越來越受到研究者們的關(guān)注[1]。

益智方是在經(jīng)典名方六味地黃丸的基礎(chǔ)上經(jīng)化裁重組而得，方中熟地黃質(zhì)潤(rùn)入腎，填精益髓，滋補(bǔ)陰精，養(yǎng)血補(bǔ)虛，為君藥；山茱萸、山藥為臣藥，山茱萸可補(bǔ)養(yǎng)肝腎，并且能夠攝精，山藥雙補(bǔ)脾腎，此三味藥既能夠補(bǔ)腎固精又可以補(bǔ)脾來助后天生化之源；遠(yuǎn)志具有安神益智的功效，可治驚悸、健忘、失眠，《神農(nóng)本草經(jīng)》有言，其“補(bǔ)不足，除邪氣，利九竅，益智慧，耳聰目明，不忘，強(qiáng)志倍力。”益智仁健脾補(bǔ)腎，與上四味藥合用，共奏補(bǔ)腎固精之功。本方以補(bǔ)為主，具有填精益髓、養(yǎng)血補(bǔ)虛、安神益智的功效。現(xiàn)代研究表明熟地黃[2]、山茱萸[3]、山藥[4]、遠(yuǎn)志[5]及益智仁[6]等中藥對(duì)學(xué)習(xí)記憶障礙具有明顯的改善作用。

本實(shí)驗(yàn)以東莨菪堿致記憶障礙小鼠為動(dòng)物模型，分別通過跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)及Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)指標(biāo)，考察益智方改善學(xué)習(xí)記憶障礙的藥理作用及其機(jī)制，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種SPF級(jí)雄性小鼠60只，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（京）2019-0010。小鼠在山西省食品藥品檢驗(yàn)所屏障環(huán)境飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度24～26℃，相對(duì)濕度45%～55%，期間自由進(jìn)食和進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)期間小鼠健康狀況良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠采用CO2安樂死，實(shí)驗(yàn)經(jīng)山西省食品藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 藥物與試劑 益智方，生藥臨床擬用量為14 g/d，將熟地黃、山茱萸、山藥、遠(yuǎn)志和益智仁除去雜質(zhì)后，取處方量浸泡，加入10倍于藥材質(zhì)量的水煎煮2次，每次煎煮1 h，過濾，合并濾液并離心，濃縮藥液到所需濃度；按體表面積計(jì)算，20 g小鼠相當(dāng)60 kg成人用量的0.003倍，小鼠的生藥等效劑量為14 g×0.003/0.02（kg）=2 g/kg。以等效劑量作為低劑量，中、高劑量分別為低劑量的2、4倍。東莨菪堿（鄭州賽科藥業(yè)科技有限公司，批號(hào)：20190316）；乙酰膽堿（ACh）ELISA試劑盒（批號(hào)：202008）、膽堿乙酰酯酶（AchE）ELISA試劑盒（批號(hào)：202008）、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）ELISA試劑盒（批號(hào)：202008）[盈芯生物科技（上海）有限公司]。

1.3 主要儀器SDT-8跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)、PAT-8避暗實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)、WMT-100 Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；T-2000電子天平（美國(guó)雙杰兄弟集團(tuán)有限公司）。

1.4 造模與給藥 將60只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、益智方低劑量組、益智方中劑量組、益智方高劑量組，每組12只。益智方低、中、高劑量組小鼠灌胃給予益智方溶液，生藥劑量分別為2、4、8 g/kg；空白組和模型組小鼠灌胃給予等體積純化水，灌胃體積10 mL/kg，1次/d，連續(xù)30 d。給藥30 d結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。行為學(xué)測(cè)試期間持續(xù)給藥，在每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)前30 min，除空白組外，其余各組小鼠分別腹腔注射東莨菪堿（5 mg/kg）制備學(xué)習(xí)記憶障礙模型，空白組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水[7]。據(jù)行為學(xué)相應(yīng)的測(cè)試指標(biāo)（跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)的潛伏期、錯(cuò)誤次數(shù)，以及Morris水迷宮的逃避潛伏期、逃逸平臺(tái)滯留時(shí)間和有效進(jìn)入次數(shù)），模型組與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明造模成功。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)[8]持續(xù)給藥第31天，將小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)先適應(yīng)環(huán)境3 min，然后再將小鼠放置反應(yīng)箱內(nèi)的銅柵上，立即通以36 V的交流電，如此訓(xùn)練5 min。24 h后為測(cè)試階段。記錄小鼠第一次跳下高站臺(tái)的時(shí)間即為跳臺(tái)潛伏期時(shí)間，3 min內(nèi)受到電擊的次數(shù)即錯(cuò)誤次數(shù)。

1.5.2 避暗實(shí)驗(yàn)[9]持續(xù)給藥第33天，先將各組小鼠放入避暗箱（黑色長(zhǎng)方形避暗箱分明暗兩室，暗室箱底通有電流）的明室中，不通電的情況下自由活動(dòng)3 min；再將小鼠趕到暗室通電，每只訓(xùn)練5 min，在間隔24 h后正式實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠面部背向洞口放入明室，拉開隔板，并同時(shí)啟動(dòng)計(jì)時(shí)器，小鼠第一次到達(dá)暗室的時(shí)間即為潛伏期；進(jìn)入暗室受到電擊的次數(shù)即錯(cuò)誤次數(shù)。記錄每只小鼠的潛伏期和5 min內(nèi)小鼠進(jìn)入暗箱的錯(cuò)誤次數(shù)。

1.5.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[10]Morris水迷宮由直徑150 cm、高70 cm的圓形水池組成，池中等分劃為4個(gè)象限，水中加入鈦白粉使其渾濁，水面高于平臺(tái)表面1～2 cm，水溫控制在（24.0±0.5）℃，采用圖像采集系統(tǒng)記錄小鼠的逃避潛伏期、逃逸平臺(tái)滯留時(shí)間、有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)等。（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：持續(xù)給藥第35天，在水池中第Ⅱ象限的中心位置放置平臺(tái)，每天依次在每個(gè)象限訓(xùn)練每只小鼠，若小鼠60 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，則將小鼠引導(dǎo)至平臺(tái)上，其潛伏期為60 s，無(wú)論小鼠60 s內(nèi)是否能找到平臺(tái)，均讓其在平臺(tái)停留15 s，并記錄小鼠入水至找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期。（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：在末次定位航行試驗(yàn)結(jié)束24 h后進(jìn)行1次空間探索實(shí)驗(yàn)，先撤走平臺(tái)，隨后將小鼠面向池壁放入水中，入水口選擇平臺(tái)對(duì)面的Ⅳ象限，時(shí)間為60 s，記錄小鼠穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)和原平臺(tái)象限游泳區(qū)域進(jìn)入次數(shù)作為檢測(cè)指標(biāo)來反映空間記憶能力。

1.5.4 腦組織中相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠迅速斷頭取腦，并凍存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。測(cè)定前，精確稱量小鼠腦組織質(zhì)量，加入9倍量的生理鹽水制成10%組織勻漿液，待測(cè)；4℃、3 000 r/min下離心20 min，然后取上清液，按照試劑盒說明書的方法步驟檢測(cè)ACh、AchE、ChAT的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠跳臺(tái)潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)比較 與空白組比較，模型組小鼠跳臺(tái)潛伏期顯著縮短（P<0.01），錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加（P<0.01），表明造模成功。與模型組比較，益智方低、中、高劑量組小鼠跳臺(tái)潛伏期均顯著延長(zhǎng)（P<0.05或P<0.01），錯(cuò)誤次數(shù)均顯著減少（P<0.01）。提示益智方能明顯改善東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。（見圖1）

圖1 各組小鼠跳臺(tái)潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)比較（±s，n=12）

2.2 各組小鼠避暗潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)比較 與空白組比較，模型組小鼠避暗潛伏期顯著縮短（P<0.01），錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加（P<0.01），表明造模成功。與模型組比較，益智方低、中、高劑量組小鼠小鼠避暗潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.01或P<0.05），錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少（P<0.01）。提示益智方能明顯改善東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。（見圖2）

圖2 各組小鼠避暗潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)比較（±s，n=12）

2.3 各組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較 定位航行實(shí)驗(yàn)：在連續(xù)5 d定位航行實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，空白組小鼠找到平臺(tái)的潛伏期逐漸縮短，與空白組比較，模型組小鼠找到平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.01），表明造模成功。與模型組比較，益智方高劑量組小鼠在第1、2、4天找到平臺(tái)的潛伏期明顯縮短（P<0.05）；益智方的低、中、高劑量組小鼠在第5天找到平臺(tái)的潛伏期明顯縮短（P<0.05）。（見圖3）

圖3 各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較（±s，n=12）

各組小鼠訓(xùn)練第5天的典型游泳熱力圖見圖4。空白組小鼠以最短的時(shí)間找到了平臺(tái)，而模型組小鼠表現(xiàn)為沿著池壁尋找平臺(tái)，無(wú)法確定平臺(tái)位置，益智方高劑量組小鼠尋找平臺(tái)的模式明顯優(yōu)于模型組，益智方低、中劑量組小鼠尋找平臺(tái)模式稍遜，但最終均確定了平臺(tái)的位置。提示益智方能明顯改善東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

圖4 各組小鼠Morris水迷宮訓(xùn)練第5天定位航行典型游泳熱力圖（n=12）

2.3.2 各組小鼠逃逸平臺(tái)滯留時(shí)間和有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)比較 空間探索實(shí)驗(yàn)：與空白組比較，模型組小鼠逃逸平臺(tái)滯留時(shí)間明顯縮短（P<0.01），60 s內(nèi)有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)明顯減少（P<0.01），表明造模成功。與模型組比較，益智方低、中、高劑量組小鼠逃逸平臺(tái)滯留時(shí)間均明顯延長(zhǎng)（P<0.05或P<0.01）；益智方低、中、高劑量組小鼠60 s內(nèi)有效進(jìn)入次數(shù)明顯增加（P<0.05或P<0.01）。提示益智方能明顯改善東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。（見圖5）

圖5 各組小鼠逃逸平臺(tái)滯留時(shí)間和有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)比較（±s，n=12）

2.4各組小鼠腦組織中ACh、ChAT、AchE含量比較 與空白組比較，模型組小鼠腦組織中ACh、ChAT含量明顯減少（P＜0.05或P＜0.01），AchE含量明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，益智方中、高劑量組小鼠腦組織中ACh和ChAT的含量顯著增加（P<0.05或P<0.01），而AChE含量顯著減少（P<0.05）。益智方低劑量組小鼠腦組織中ACh、ChAT、ChAE含量與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組小鼠腦組織中ACh、AchE、ChAT含量比較（±s）

表1 各組小鼠腦組織中ACh、AchE、ChAT含量比較（±s）

注：與空白組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01

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3 討 論

學(xué)習(xí)記憶是人體生理發(fā)育過程中一個(gè)極其復(fù)雜的過程，涉及多個(gè)系統(tǒng)、多個(gè)環(huán)節(jié)、多種因素。東莨菪堿是一種抗膽堿藥，能使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能減退，被廣泛應(yīng)用于藥理評(píng)價(jià)和作用機(jī)制探討[11]。本研究成功復(fù)制了東莨菪堿所致的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型。

Morris水迷宮是現(xiàn)今研究者們所公認(rèn)的用來測(cè)試空間學(xué)習(xí)記憶行為學(xué)的經(jīng)典方法，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在水中尋找平臺(tái)對(duì)腦組織中海馬體的學(xué)習(xí)記憶功能反應(yīng)極其強(qiáng)烈，常被用來測(cè)試AD患者或測(cè)試年齡相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶障礙的研究[12]；跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)和避暗實(shí)驗(yàn)都是用來測(cè)試動(dòng)物在受到電刺激時(shí)對(duì)其制造出不利的環(huán)境影響，經(jīng)過若干次訓(xùn)練，通過被動(dòng)躲避方式躲避其不利環(huán)境給它們帶來的不利影響，從而評(píng)價(jià)其學(xué)習(xí)記憶能力。

ACh廣泛存在于腦內(nèi)且是一種重要的中樞膽堿神經(jīng)遞質(zhì)，能維持膽堿能系統(tǒng)正常運(yùn)行和長(zhǎng)期記憶的生理基礎(chǔ)。研究表明，癡呆患者腦組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)中普遍存在Ach含量降低，Ach在腦中含量的減少可以引起學(xué)習(xí)記憶障礙[13]，可推測(cè)膽堿能通路的受損與學(xué)習(xí)記憶能力的下降具有因果關(guān)系。AchE作為ACh的關(guān)鍵水解酶，通過水解ACh控制膽堿能神經(jīng)元突觸間的信息傳遞，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)記憶功能的調(diào)控，AchE含量升高可造成腦內(nèi)ACh含量不足導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降[14]；ChAT是ACh的合成酶，ACh由膽堿、乙酰輔酶A協(xié)助，并在膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）催化下合成，兩者的含量及活性直接影響ACh的含量且共同維持著ACh的動(dòng)態(tài)平衡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益智方高劑量組小鼠腦組織中AchE含量顯著減少，ACh、ChAT含量顯著增加，可推測(cè)其益智作用是通過調(diào)控AchE進(jìn)而影響了Ach、ChAT含量，從而改善小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力。

以熟地黃、山茱萸、山藥、遠(yuǎn)志、益智仁為主的復(fù)方在治療記憶減退、老年健忘等方面的應(yīng)用越來越多。現(xiàn)代研究表明[15-21]，熟地黃、遠(yuǎn)志、益智仁均可改善東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶障礙模型小鼠抑制的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能及大腦中乙酰膽堿的功能，其作用機(jī)制可能為通過提高ChAT活性、抑制AChE活性來增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量益智方可顯著提高東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶障礙模型小鼠腦組織ChAT含量，減少AchE含量，與文獻(xiàn)相符。研究[22-26]表明，山茱萸多糖、山藥多糖可通過增強(qiáng)腦組織的ATP酶活性、抑制衰老的相關(guān)信號(hào)節(jié)點(diǎn)和通路來減緩東莨菪堿致小鼠腦組織中Aβ的形成，且能通過降低Tau蛋白磷酸化來改善學(xué)習(xí)記憶障礙。

綜上所述，益智方可以改善小鼠東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙，該方可能通過膽堿能通路調(diào)節(jié)機(jī)體腦內(nèi)ACh水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)膽堿能的相關(guān)神經(jīng)功能，從而改善學(xué)習(xí)記憶功能。由此可知，益智方可能主要通過調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)達(dá)到改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用。