張欣

天津市環(huán)湖醫(yī)院高壓氧科 300350

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的自身免疫反應(yīng)異常引起的炎癥性脫髓鞘性疾病［1］。其具體發(fā)病原因尚未闡明，從自身免疫調(diào)節(jié)來看，CD4+Thl 細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)異常被認(rèn)為是導(dǎo)致MS 發(fā)病的原因，這是因?yàn)樵贛S 患者CNS 脫髓鞘斑塊中檢測到的淋巴細(xì)胞以T細(xì)胞為主，將髓鞘相關(guān)致敏T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移給小鼠可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型的建立［2］。有研究表明，在MS 患者CNS 內(nèi)免疫球蛋白合（Ig）合成與血漿Ig合成率不一致，表明CNS 局部有Ig 合成［3］。髓內(nèi)合成的Ig以IgG 寡克隆帶（OCB）的形式出現(xiàn)在患者腦脊液（CSF）中，這成為MS 疾病的特點(diǎn)，特異性O(shè)CB 已收錄在最新的McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)中［4］。2017年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已批準(zhǔn)使用消耗B 細(xì)胞單克隆抗體藥物ocrelizumab治療多發(fā)性硬化，不僅對復(fù)發(fā)型MS 有效，而且對一些原發(fā)進(jìn)展型 MS 患者也有效［5］。這表明 B 細(xì)胞在 MS 的發(fā)病中扮演著比以前更重要的角色。他汀類藥物主要通過抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-coA）還原酶，阻礙L-甲羥戊酸生成，從而起到降低血膽固醇和低密度脂蛋白（LDL）的作用，是臨床上常用的降脂藥物。1995 年首次發(fā)現(xiàn)該類藥物還具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以降低心臟移植患者的免疫排斥反應(yīng)，降低病死率。他汀類藥物免疫調(diào)節(jié)機(jī)制可能是通過抑制甲羥戊酸合成，減少下游產(chǎn)物合成，進(jìn)一步抑制小GTP 結(jié)合蛋白的激活達(dá)到調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)［6］。該藥物還可以影響免疫系統(tǒng)中細(xì)胞免疫及體液免疫的多個(gè)環(huán)節(jié)，包括T、B 細(xì)胞的增殖分化、抗原的呈遞、Thl/Th2 細(xì)胞因子的分泌、淋巴細(xì)胞歸巢等環(huán)節(jié)［7-8］。目前許多研究證實(shí)，他汀類藥物可減輕EAE，延長潛伏期，影響其病程轉(zhuǎn)歸。他汀類藥物對EAE 的治療作用是否與對B 細(xì)胞的調(diào)節(jié)相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)在研究阿托伐他汀治療EAE 的同時(shí)，探討阿托伐他汀對EAE 模型中自身反應(yīng)性B細(xì)胞的影響。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2021 年1 月至4 月，選取雌性C57BL/6小鼠45 只，體質(zhì)量 18～22 g，8～10 周齡，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［生產(chǎn)許可證號 SCXK（京）2016-0002，使用許可證號 SYXK（黑）2006-033］。均為清潔飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過程符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用條例》及3R原則。

1.2 主要試劑 MOG35-55，純度＞95%（美國sigma公司），百日咳毒素（PTX）（美國sigma 公司），完全福氏佐劑（CFA）（美國sigma 公司），卡介苗凍干粉（石家莊結(jié)核病防治研究所），F(xiàn)ITC 標(biāo)記抗-鼠CD19抗體（美國BD 公司），B細(xì)胞活化因子（BAFF）和增殖誘導(dǎo)配體（APRLI）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物工程公司），山羊抗小鼠IgG免疫組化試劑盒（北京博奧森生物制品公司），阿托伐他汀片（大連輝瑞制藥有限公司）。

1.3 EAE 模型的建立 參考 Sundaram G 等［9］方法：將MOG35-55用0.01 mol/L PBS 緩沖液稀釋成5 mg/ml，然后按等比加入CFA，CFA 中加入卡介苗濃度為4 mg/ml，將二者裝在玻璃注射器內(nèi)在冰上不斷來回抽打使混合液充分乳化，滴1 滴在水中不溶解為止，用10%水合氯醛（3 ml/kg）將小鼠麻醉后，將乳化好的抗原乳劑按每只0.2 ml 在小鼠脊柱兩側(cè)分4 點(diǎn)皮下注射，免疫開始為第0 天，免疫第0 天及第2 天分別腹腔注射PTX 400 ng/只。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 依據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)將小鼠分為對照物、EAE 組、他汀治療組。對照組（15只）：使用0.01 mol/L PBS 緩 沖 液 與 CFA 乳 化 免 疫 C57BL/6 小 鼠 。EAE 組（15只）：用MOG35-55肽段、CFA、PTX 免疫C57BL/6小鼠建立EAE 模型。他汀治療組（15 只）：免疫完成第3 天開始灌服阿托伐他汀至處死，1次/d，劑量為10 mg（/kg·d）［10-11］。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的評估 免疫開始當(dāng)天，每日對各組小鼠稱重及神經(jīng)功能評分，評分標(biāo)準(zhǔn)參考國際通用Knoz 標(biāo)準(zhǔn)。0 分：無臨床癥狀；1 分：尾巴肌張力降低；2 分：后肢無力或癱瘓；3 分：后肢癱瘓，靠健側(cè)肢體移動(dòng)；4 分：后肢癱瘓，可出現(xiàn)四肢癱瘓；5分：瀕死狀態(tài)或死亡［12］。

1.6 小鼠腦組織病理學(xué)觀察 各組小鼠于發(fā)病高峰期（21 d），達(dá)最大平均臨床評分處死。用4%水合氯醛麻醉小鼠，首先用冷生理鹽水灌注心臟，然后再用4%多聚甲醛灌注，直至小鼠內(nèi)臟變白身體僵硬，固定成功后，在冰板上剝離腦和脊髓，4%多聚甲醛浸泡過夜，石蠟包埋待用。進(jìn)行各組小鼠腦HE染色和腦免疫組化，均嚴(yán)格按照說明書步驟執(zhí)行。

1.7 脾臟B 細(xì)胞流式檢測 頸椎脫臼處死小鼠，取出脾臟，獲得脾臟細(xì)胞懸液。用吸管將脾細(xì)胞懸液吸入10 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min（離心半徑12 cm），棄上清；沉淀加3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，室溫放置5 min，使其充分裂解，1 000 r/min 離心 5 min（離心半徑 12 cm），棄上清；加2 ml PBS洗2次，1 000 r/min離心5 min（離心半徑12 cm），棄上清；用RPMI1640 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，臺盼蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)；計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使用含2×106/ml 細(xì)胞懸液。將獲得的細(xì)胞懸液加入PBS 緩沖液分裝于EP 管中（根據(jù)細(xì)胞數(shù)量，每個(gè) EP 管約 2×106細(xì)胞），4 ℃，1 000 r/min 離心 5 min（離心半徑12 cm），小心棄上清；加入100μl 1%BSA、0.1%疊氮鈉的PBS 重懸細(xì)胞，分別加入異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記抗-鼠CD19 抗體標(biāo)記，4 ℃避光孵育 30 min；加 1 ml PBS 洗 1 次，4 ℃，1 000 r/min 離心5 min（離心半徑12 cm）；加入300 μl 1%多聚甲醛固定過夜，使用BD流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.8 各組小鼠外周血BAFF 和APRLI 檢測 將小鼠用4%的水合氯醛麻醉后，剪去眼睛周圍毛發(fā)及胡須，采用摘眼球法取外周血，取出外周血后-20 ℃冰箱保存。ELISA 測定小鼠外周血中BAFF 和APRLI 濃度，按照說明書步驟執(zhí)行。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用（）表示，各組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠發(fā)病情況 EAE 組小鼠最早從第9天開始發(fā)病，陸續(xù)出現(xiàn)食欲減退、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍等。隨后出現(xiàn)CNS 受損癥狀：尾巴張力下降、癱瘓，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)四肢癱瘓、尿便失禁及死亡，同時(shí)伴有體質(zhì)量下降。癥狀從發(fā)病開始1 周左右達(dá)到高峰。與EAE 組相比，他汀治療組小鼠最早第10 天起病，他汀治療組平均發(fā)病時(shí)間較晚，發(fā)病率及死亡率減低，臨床癥狀較輕，體質(zhì)量下降程度改善。對照組未出現(xiàn)任何臨床癥狀，體質(zhì)量緩慢持續(xù)增長。各組雌性C57BL/6小鼠發(fā)病情況比較見表1。

表1 各組雌性C57BL/6小鼠發(fā)病率、死亡率、體質(zhì)量變化、發(fā)病時(shí)間、最高評分比較

2.2 各組腦組織病理學(xué)改變 EAE 組小鼠側(cè)腦室旁、腦干、小腦都出現(xiàn)了不同程度白質(zhì)脫髓鞘改變，腦實(shí)質(zhì)內(nèi)小血管擴(kuò)張充血，周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，聚集成團(tuán)，以淋巴、單核細(xì)胞為主，主要集中在白質(zhì)、灰白質(zhì)交界區(qū)。他汀治療組上述部位也有白質(zhì)脫髓鞘改變，炎性細(xì)胞浸潤程度較EAE組有不同程度減輕。光鏡下對照組小鼠腦組織無明顯改變。見圖1。

圖1 各組雌性C57BL/6小鼠腦組織病理切片（HE ×400）。A：EAE 組雌性C57BL/6 小鼠腦組織病理切片；B：他汀治療組雌性C57BL/6 小鼠腦組織病理切片；C：對照組雌性C57BL/6 小鼠腦組織病理切片

2.3 腦免疫組化 EAE 組小鼠腦組織內(nèi)可見較多IgG滲出，表現(xiàn)為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞漿、神經(jīng)纖維網(wǎng)、腦脊膜和小血管內(nèi)皮呈現(xiàn)棕褐色，而他汀治療組小鼠腦組織IgG滲出少于EAE組；對照組腦組織內(nèi)未見IgG表達(dá)。見圖2。

圖2 各組雌性C57BL/6 小鼠腦組織內(nèi)IgG 水平（免疫組化 ×400）。A：EAE 組雌性 C57BL/6 小鼠腦組織內(nèi) IgG 水平；B：他汀治療組雌性C57BL/6 小鼠腦組織內(nèi)IgG 水平；C：對照組雌性C57BL/6小鼠腦組織內(nèi)IgG水平

2.4 各組小鼠脾臟活化B細(xì)胞比例比較 EAE組活化B 細(xì)胞比例為（50.014±2.631）%，他汀治療組為（39.864±1.788）%，對照組為（34.514±1.470%）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，EAE組小鼠脾臟活化B細(xì)胞比例明顯高于對照組（P=0.000 152），他汀治療組小鼠脾臟中活化B 細(xì)胞比例明顯低于EAE 組（P=0.011 140）。見圖3、4。

圖3 各組雌性C57BL/6 小鼠脾臟活化B 細(xì)胞比例比較。A：EAE 組雌性C57BL/6 小鼠脾臟活化B 細(xì)胞比例；B：他汀治療組雌性C57BL/6 小鼠脾臟活化B細(xì)胞比例；C：對照組雌性C57BL/6小鼠脾臟活化B細(xì)胞比例

圖4 各組雌性C57BL/6小鼠脾臟B細(xì)胞百分比比較

2.5 小鼠外周血APRLI 和BAFF 濃度測定 EAE 組小鼠外周血 APRLI、BAFF 濃度分別為（1.780±0.194）μg/L、（199.066±20.566）μg/L，他汀治療組分別為（1.689±0.155）μg/L、（137.600±15.085）μg/L，對照組分別為（1.343±0.205）μg/L和（151.066±15.708）μg/L；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，EAE 組小鼠外周血中APRLI 和BAFF 濃度較對照組無明顯升高（P=0.134 7、P=0.127 2），他汀治療組較EAE 組無明顯降低（P=0.719 9、P=0.112 6）。見圖5。

圖5 各組雌性C57BL/6 小鼠外周血APRLI 和BAFF 濃度比較。A：各組雌性C57BL/6 小鼠外周血APRLI濃度比較；B：各組雌性C57BL/6小鼠外周血BAFF濃度比較

3 討 論

B 細(xì)胞是人體內(nèi)的免疫細(xì)胞，發(fā)揮特異性體液免疫作用，因此B 細(xì)胞功能紊亂可導(dǎo)致許多自身免疫性疾病發(fā)生。對于B 細(xì)胞在MS 發(fā)病機(jī)制中作用的理解仍在不斷發(fā)展，腦脊液中存在的寡克隆帶、腦膜中存在的B 細(xì)胞濾泡樣結(jié)構(gòu)及靶向B 細(xì)胞消耗治療的有效性，都是B 細(xì)胞參與MS 發(fā)病的重要證據(jù)［13］。已有研究證明，治療性抗CD20單克隆抗體的有效性和相對可容忍的不良反應(yīng)，說明其具有良好的利益 風(fēng) 險(xiǎn)比［14］。James ML 等［15］使用 64 cu-rituximab-pet 技術(shù)，在EAE 小鼠CNS檢測到B細(xì)胞，較對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），將來可以在MS 患者中使用它來評估檢測和監(jiān)測B 細(xì)胞在疾病進(jìn)展和治療。此外，這些IgG 分泌的B細(xì)胞被局限在病變區(qū)，證實(shí)有膠質(zhì)細(xì)胞活化、脫髓鞘和神經(jīng)退行性變。本實(shí)驗(yàn)使用MOG35-55多肽段成功誘導(dǎo)EAE 模型，與對照組比較，EAE 組小鼠脾臟中B 細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的比例明顯增加，腦組織免疫組化也可見較多IgG滲出。這表明MOG33-55肽段可以使B細(xì)胞活化增殖，活化的B細(xì)胞及自身抗體參與了EAE 的發(fā)病。B 細(xì)胞被抗原激活后可轉(zhuǎn)變?yōu)闈{細(xì)胞，具有產(chǎn)生特異性抗體的能力，這在EAE發(fā)病機(jī)制中有重要作用。Mannara F 等［16］證明在被動(dòng)EAE 模型B細(xì)胞是明顯增多的，這些B細(xì)胞與IgG的共同定位及其在脫髓鞘區(qū)的主要分布提示IgG 分泌B 細(xì)胞參與了被動(dòng)EAE 的神經(jīng)退行性過程，提示存在抗體分泌細(xì)胞。Al-Ani MR等［17］研究證明，給予20μg/只小鼠的利妥昔單抗治療，可以降低EAE 臨床評分，減少B 細(xì)胞在小鼠腦血管周圍間隙的浸潤，并能抑制炎癥和脫髓鞘。本研究和上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論相似，表明B 細(xì)胞及其分泌自身抗體在EAE 發(fā)病中有一定作用。

BAFF 和APRLI 為腫瘤壞死因子超家族成員，對B 細(xì)胞的發(fā)育、存活、Ig 的產(chǎn)生和T 細(xì)胞共刺激起重要的作用。BAFF 和APRLI 表達(dá)異?？墒棺陨矸磻?yīng)性B 細(xì)胞逃脫自身檢測點(diǎn)死亡信號，使異常B 細(xì)胞免于凋亡，從而參與許多自身免疫性疾病的發(fā)生。Piazza F 等［18］對 30 例初發(fā)性 MS 患者和79 例對照組（急性或慢性炎癥性或非炎癥性神經(jīng)疾?。┻M(jìn)行研究表明，與健康對照組相比，MS 患者CSF 和血清中 BAFF 和 APRIL 水平升高。Huntington ND 等［19］研究證明，BAFF/APRIL 拮抗劑 hBCMA-Fc 在 MS 動(dòng)物模型治療中是有效的，觀察到B 細(xì)胞數(shù)量和Ig 滴度顯著減少，可以抑制CNS炎癥和脫髓鞘，從而抑制EAE臨床發(fā)病和進(jìn)展，減輕臨床癥狀。上述研究表明，BAFF/APRIL 調(diào)節(jié)異常參與了MS或EAE 的發(fā)病。BAFF/APRIL 是否可以作為MS 發(fā)病的生物標(biāo)志物，或新的治療靶點(diǎn)？本實(shí)驗(yàn)測定了各組小鼠外周血BAFF和APRLI平均濃度變化，EAE組較對照組沒有明確增高，他汀治療組較EAE組無明顯降低（均P＜0.05）。這和Sursiakova NV 等［20］發(fā)表的 BAFF 濃度在 EAE 中是正常的結(jié)論相一致，結(jié)果表明EAE 發(fā)病與外周血BAFF、APRLI 濃度變化無關(guān)，BAFF及APRLI在EAE發(fā)病中的作用有待進(jìn)一步研究。

有臨床試驗(yàn)證實(shí)，他汀類藥物對MS 有一定治療作用［21］。研究表明，高劑量辛伐他汀能有效減緩繼發(fā)進(jìn)展型MS 患者腦萎縮的進(jìn)展，該研究隨機(jī)雙盲將140 例晚期繼發(fā)進(jìn)展型MS 患者分為安慰劑組和辛伐他汀組（80 mg/d），分別于不同時(shí)間段進(jìn)行頭MRI 掃描，結(jié)果顯示高劑量辛伐他汀能將腦萎縮發(fā)生率降低43%，殘疾進(jìn)展減少40%［22］。也有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，他汀類藥可以抑制復(fù)發(fā)-緩解型 EAE［23］。本研究表明，與EAE 組相比，他汀治療組發(fā)病時(shí)間較晚，發(fā)病率及死亡率減低，臨床癥狀較輕，體質(zhì)量下降程度改善，表明阿托伐他汀對EAE 有治療作用。但這種治療作用是通過何種機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，目前尚不清楚。Lawman S 等［24］實(shí)驗(yàn)表明，狼瘡易感NZB/WF1小鼠服用阿托伐他汀可導(dǎo)致血清抗dsDNA IgG 抗體顯著減少，疾病改善與MHCII 在單核細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞上的表達(dá)降低減少，CD80 和CD86 在B 淋巴細(xì)胞上的表達(dá)降低相關(guān)，證實(shí)阿托伐他汀通過體液免疫途徑可以延緩自發(fā)性自身免疫疾病的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)通過B 細(xì)胞流式檢測證明，他汀治療組小鼠脾臟中活化B 細(xì)胞比例較EAE 組降低；推測阿托伐他汀對EAE 小鼠的治療作用可能與下調(diào)異常B 細(xì)胞比例及對體液免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。阿托伐他汀對B 細(xì)胞的作用可能與以下途徑相關(guān)。⑴抑制B 細(xì)胞增殖。體外實(shí)驗(yàn)證明，他汀類藥物可以抑制MS 患者外周血B 細(xì)胞及T 細(xì)胞增殖，也可以顯著減少外周血B 細(xì)胞表面趨化因子受體CxCR3 和CCR5 表達(dá)［25］。洛伐他汀通過降低細(xì)胞膜Cho、細(xì)胞內(nèi)活性氧、瞬時(shí)受體電位陽離子通道6 蛋白表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)Ca2+來抑制惡性B 細(xì)胞增殖［26］。⑵促進(jìn)B 細(xì)胞凋亡及分布異常。也有研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物也可對B 細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響，在給大鼠服用辛伐他汀后，檢測藥物組大鼠脾臟和淋巴結(jié)B 細(xì)胞比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B 細(xì)胞數(shù)量均有顯著下降。免疫熒光標(biāo)記法證實(shí)，辛伐他汀可能是通過抑制淋巴細(xì)胞歸巢作用導(dǎo)致B 淋巴細(xì)胞數(shù)量下降，并不是直接促進(jìn)B 細(xì)胞凋亡，外周淋巴器官中淋巴細(xì)胞無法獲得存活信號也可以間接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加［27］。

綜上所述，阿托伐他汀藥物可通過多種途徑參與EAE發(fā)病的調(diào)節(jié)，而對體液免疫的調(diào)節(jié)作用是重要的一部分。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿托伐他汀對EAE 的治療作用可能與其下調(diào)異常B 細(xì)胞比例有關(guān)，但并不能確定這種作用通過何種機(jī)制實(shí)現(xiàn)，這也是后續(xù)研究的方向，為尋找靶向B 細(xì)胞治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。