楊振 張紅珠 張偉 付婷婷

濟南市第七人民醫(yī)院消化內科 250101

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，其病死率高居腫瘤病死率的第2 位［1-2］?；熓俏赴┬g后的主要治療措施，而耐藥性的產生直接關系化療的成功。以順鉑為代表的化療藥物是胃癌化療的一線藥物，長期用藥效果飽受耐藥性及毒副作用影響［3］。文獻指出，Yes 相關蛋白 1（yes-associated protein 1，YAP1）在多種惡性腫瘤中的差異表達與細胞的增殖關系密切［4-5］。徐崗等［6］研究發(fā)現，干擾 YAP1 可增強食管癌對順鉑的化療敏感性，提示YAP1可能在腫瘤耐藥形成中發(fā)揮作用。前期研究結果顯示，胃癌組織中YAP1蛋白表達明顯高于癌旁正常組織。目前關于胃癌中YAP1 與化療敏感性的研究尚未見報道，我們推測胃癌中YAP1蛋白的表達與順鉑敏感性相關。為驗證該觀點，2019 年1 月至2020 年12 月，本研究擬通過構建干擾胃癌細胞中YAP1 表達，探究YAP1對胃癌細胞順鉑敏感性的影響及作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 細胞 實驗用人正常胃上皮黏膜細胞GES1 和人胃癌細胞SGC-7901 購于美國模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640（Roswell Park Memorial Institute 1640）培養(yǎng)基、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；裂解液Trizol（美國Invitrogen 公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（美國Sigma公司）；實時熒光定量逆轉錄試劑盒、反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒（日本TaKaRa 公司）；鼠抗人β-actin 抗體、鼠抗人 YAP1 抗體、鼠抗人 IGF 抗體、鼠抗人Akt抗體、鼠抗人TGF-β抗體（美國Abcam公司）。

1.1.3 主要儀器 Ⅸ73 倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；7500 Real-Time 定量PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific-CN 公司）；Spectra Max iD5 酶標儀（美國molecular devices 公司）；PE2400 電泳儀、GelDOC2000 型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與傳代 人正常胃上皮黏膜細胞GES1 置于含10%胎牛血清RPMI1640 培養(yǎng)基中，人胃癌細胞SGC-7901 置于含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞鋪滿80%鏡下視野時采用0.25%含乙二胺四乙酸四鈉胰酶消化傳代。取對數生長期細胞進行功能實驗。

1.2.2 慢病毒感染人胃癌細胞株 YAP1 沉默重組慢病毒顆粒Lv-shRNA-YAP1 及陰性對照慢病毒顆粒Lv-shRNA-NC均委托廣州銳博生物技術有限公司構建。

取對數期生長細胞SGC-7901，離心后重懸調整濃度，按3.5×104個/孔接種于六孔板中，待細胞生長狀態(tài)良好達40%～60% 融合時，棄去培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌2次，向各孔中加入840μl轉染增強試劑和100 μl poly，隨后將Lv-shRNA-YAP1、Lv-shRNA-NC 各60μl 分別加入相應孔中。每隔24 h 換液1次，72 h后將六孔板置于倒置熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染效率，以慢病毒感染效率超過80%視為感染成功。

1.2.3 RT-PCR 實驗檢測mRNA 相對表達量 細胞總RNA 采用Trizol 法，用紫外分光光度儀測定總RNA 濃度與純度。按照mRNA 反轉錄試劑盒操作說明進行反轉錄，參照 SYBR?Premix Ex Taq TM 試劑盒說明進行 RT-PCR 檢測，計算相對定量結果。

1.2.4 免疫印跡試驗（Western blot，WB）檢測蛋白相對表達量 細胞棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次，加入適量混勻的細胞裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min 收集細胞，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min（半徑10 cm），取上清液。使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，以相同蛋白上樣量，煮沸變性后進行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后使用半干轉儀轉移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，1%脫脂牛奶稀釋一抗，4 ℃孵育過夜。次日TBST 洗脫，37 ℃孵育二抗1 h，PBS洗滌3次，ECL化學發(fā)光劑顯影。

1.2.5 細胞計數8（Cell Counting Kit-8，CCK8）實驗檢測細胞增殖能力及對不同濃度順鉑敏感性 收集對數生長期細胞，離心后重懸細胞，調整懸液細胞濃度至5 000個/ml，96孔板每孔加入細胞懸液100μl，每組3 個復孔，常規(guī)培養(yǎng)。分別于0 h、24 h、48 h、72 h 時于每孔加入10 μl CCK8 試劑，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中放置2 h，酶標儀測定其在450 nm處的吸光度（OD）值。以相對應OD 值表示細胞增殖能力大小，繪制細胞生長曲線。

收集對數生長期細胞制成細胞懸液，調整細胞濃度至5 000 個/ml，96 孔板每孔加入細胞懸液 100 μl，每組 3 個復孔，常規(guī)培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μl CCK8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀測定其在450 nm處的OD值，測定順鉑抑制胃癌細胞增殖的半數抑制濃度（IC50）及胃癌細胞SGC-7901對不同濃度順鉑敏感性。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞運動能力 各組細胞按2×105個/孔接種于6 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)，待細胞貼壁為單層細胞狀態(tài)時，于超凈臺中，采用無菌10μl槍頭垂直于6孔板劃線，各做3 條橫線與垂直的豎線，采用PBS 緩慢沖洗6 孔板，去除劃線處理的細胞。常規(guī)培養(yǎng)24 h，于光學顯微鏡下觀察劃痕處細胞運動情況。細胞運動率（%）=（初始劃痕寬度-24 h后劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。

1.2.7 Transwell 實驗檢測細胞遷移能力 取對數生長期細胞制成5×105個/ml 無血清細胞懸液，每個Transwell 小室中加入200 μl 細胞懸液，并在24 孔板每孔對應加入600μl的完全培養(yǎng)基，將小室放入孔中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，進行固定及染色。計數穿過微孔移到濾膜下層的細胞總數，共計數中央及四周各5個視野并取其平均值。

1.2.8 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 50 μl Matrigel 膠包被于Transwell 小室底部，37 ℃靜置 2 h，進行Matrigel 膠預處理。取對數生長期細胞制成1×106個/ml 無血清細胞懸液，向每個鋪膠的Transwell 小室中加入200 μl細胞懸液，并在24孔板每孔對應加入600μl的完全培養(yǎng)基，然后將小室放入孔中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，進行細胞固定及染色。計數穿過微孔移到濾膜下層的細胞總數。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差表示，多組數據間比較采用方差分析，兩組數據間均數比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 YAP1 在人胃癌細胞SGC-7901 中的表達情況與正常胃上皮黏膜細胞 GES1［mRNA（1.00±0.03），蛋白（1.00±0.02）］比較，YAP1 在胃癌細胞SGC-7901 中呈高表達［mRNA（6.43±0.43），蛋白（2.54±0.13）］，差異均有統(tǒng)計學意義（t=11.821、8.371，均P＜0.05）。見圖1。

圖1 YAP1 在人胃癌細胞SGC-7901 中的表達情況（A 為YAP1 mRNA 在人胃癌細胞SGC-7901 中的表達情況，B 為YAP1 蛋白在人胃癌細胞SGC-7901中的表達情況）

2.2 慢病毒轉染效率評價 熒光顯微鏡下觀察可見，胃癌細胞SGC-7901 感染慢病毒顆粒Lv-shRNA-YAP1、Lv-shRNA-NC 培養(yǎng)72 h 后，可見80%以上細胞有明顯綠色熒光標志，提示慢病毒感染效率良好。見圖2。

圖2 慢病毒轉染效率評價（左側列為光學顯微鏡下慢病毒轉染情況；右側列為熒光顯微鏡下慢病毒轉染情況，綠色熒光蛋白 ×40）

2.3 YAP1 對人胃癌細胞SGC-7901 增殖能力的影響空白對照組胃癌細胞在24 h、48 h、72 h 的增殖能力分別為（0.44±0.05）、（0.72±0.05）、（0.97±0.04），Lv-shRNA-NC 組分別 為 （0.40±0.05） 、（0.68±0.04） 、（0.92±0.05） ，Lv-shRNA-YAP1 組 分 別 為（0.34±0.04），（0.52±0.04），（0.73±0.05），與 空 白 對 照 組 和 Lv-shRNA-NC 組 比 較 ，Lv-shRNA-YAP1組胃癌細胞在24 h、48 h、72 h的增殖能力均明顯較低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖3。

圖3 YAP1對人胃癌細胞SGC-7901增殖能力的影響

2.4 YAP1 對人胃癌細胞SGC-7901 運動能力的影響空白對照組的細胞運動距離（82.32±4.53）%，Lv-shRNA-NC組 為（84.42±5.42）% ，Lv-shRNA-YAP1 組 為（51.42±5.31）% ，Lv-shRNA-YAP1 組 與 空 白 對 照 組 和Lv-shRNA-NC 組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖4。

圖4 YAP1對人胃癌細胞SGC-7901運動能力的影響（A為劃痕實驗光學顯微鏡觀察結果 ×40；B為劃痕實驗細胞運動率計算結果）

2.5 YAP1 對人胃癌細胞SGC-7901 遷移能力的影響空白對照組細胞遷移為（543±43）個，Lv-shRNA-NC 組為（523±51）個、，Lv-shRNA-YAP1組為（432±44）個，與空白對照組和Lv-shRNA-NC 組細胞比較，Lv-shRNA-YAP1 組細胞遷移能力明顯較低，組間差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖5。

圖5 YAP1對人胃癌細胞SGC-7901遷移能力的影響（A為Traswell細胞遷移實驗光學顯微鏡觀察結果，龍膽紫染色 ×40；B為Tras?well細胞遷移實驗計數結果）

2.6 YAP1 對人胃癌細胞SGC-7901 侵襲能力的影響空白對照組細胞侵襲為（586±54）個，Lv-shRNA-NC 組（573±54）個，Lv-shRNA-YAP1組（485±53）個。與空白對照組和Lv-shRNA-NC 組細胞比較，Lv-shRNA-YAP1 組細胞侵襲能力明顯較小，組間差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖6。

圖6 YAP1 對人胃癌細胞SGC-7901 侵襲能力的影響（A 為Traswell 細胞侵襲實驗光學顯微鏡觀察結果，龍膽紫染色 ×40；B 為Traswell細胞侵襲實驗計數結果）

2.7 順鉑對人胃癌細胞SGC-7901 增殖的抑制作用當順鉑濃度為 0.5 μg/ml、1.0 μg/ml、2.0 μg/ml、4.0 μg/ml、8.0 μg/ml 時，Lv-shRNA-YAP1 組胃癌細胞 SGC-7901 存活率均明顯低于空白對照組和Lv-shRNA-NC 組（P＜0.05），空 白 對 照 組 順 鉑 對 細 胞 的 IC50為（4.43±0.32）μg/ml，Lv-shRNA-NC 組順鉑對細胞的 IC50為（4.18±0.42）μg/ml，Lv-shRNA-YAP1組順鉑對細胞的IC50為（1.48±0.33）μg/ml，明顯低于空白對照組和Lv-shRNA-NC 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同順鉑濃度對人胃癌細胞SGC-7901增殖的抑制作用

2.8 YAP1 影響人胃癌細胞SGC-7901 順鉑敏感性的信號通路作用 空白對照組細胞中IGF、Akt、TGF-β 的mRNA 和蛋白相對表達量分別為（1.00±0.03）、（1.00±0.02）、（1.00±0.04），（1.00±0.02）、（1.00±0.04）、（1.00±0.03），Lv-shRNA-YAP1 組 分 別 為（0.58±0.03）、（0.62±0.03）、（0.39±0.03），（0.78±0.03）、（0.73±0.03）、（0.74±0.05），順鉑組 分 別 為（0.67±0.02）、（0.73±0.03）、（0.40±0.02），（0.72±0.04）、（0.74±0.04）、（0.77±0.05），Lv-shRNA-YAP1 組和順鉑組細胞中IGF、Akt、TGF-β的mRNA和蛋白相對表達量明顯優(yōu)于空白對照組細胞（均P＜0.05），Lv-shRNA-YAP1+順鉑組細胞中 IGF、Akt、TGF-β 的 mRNA 和蛋白相對表達量［（0.70±0.02）、（0.68±0.03）、（0.34±0.04），（0.51±0.03）、（0.46±0.03）、（0.55±0.05）］則明顯低于Lv-shRNA-YAP1 組和順鉑組（均P＜0.05）。與空白對照組細胞比較，Lv-shRNA-YAP1 組細胞中 IGF、Akt、TGF-β 的 mRNA 和蛋白相對表達量均明顯較低（均P＜0.05），順鉑組細胞中IGF、Akt、TGF-β mRNA 和蛋白相對表達量也明顯低于空白對照組細胞（均P＜0.05），Lv-shRNA-YAP1+順鉑組細胞中IGF、Akt、TGF-β 的 mRNA、蛋白相對表達量則進一步低于Lv-shRNA-YAP1 組和順鉑組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

3 討 論

胃癌的發(fā)生受多基因共同作用影響，與環(huán)境、生活習慣、遺傳、幽門螺桿菌感染等危險因素密切相關［7］?；熓俏赴┦中g治療及保守治療的主要治療措施，在胃癌的臨床治療中一直占據著重要地位。順鉑作為DNA 直接作用鉑類藥物，是胃癌化療的一線臨床藥物，但順鉑耐藥的發(fā)生仍在一定程度上限制了化療干預的有效性［8］。尋找有效方法逆轉胃癌對順鉑的耐藥性，提高患者的臨床療效迫在眉睫。

目前，腫瘤細胞耐藥的相關機制并未完全明了，有研究認為，細胞耐藥與細胞的增殖、凋亡紊亂有關［9-10］。研究發(fā)現，過表達原鈣黏蛋白10 可抑制人胃癌細胞BGC823 的增殖，并通過下調磷脂酰肌醇-3激酶、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白、p70 核糖體蛋白S6 激酶mRNA 和蛋白表達，增強腫瘤細胞的順鉑化療敏感性［11］。劉蒙等［12］研究也指出，靶向沉默CDH10 可通過抑制順鉑耐藥細胞的增殖能力，提高胃癌細胞對順鉑的敏感性，提示細胞增殖調節(jié)在腫瘤細胞的順鉑耐藥敏感中發(fā)揮著重要作用。YAP1 是一種具有多種功能的細胞內連接蛋白和轉錄共激活因子，是果蠅蛋白激酶（Hippo）信號轉導通路的重要組成因子，在細胞增生和凋亡平衡的維持中扮演著重要角色［13］。研究指出，YAP1表達異常可導致Hippo 信號通路活化，打破細胞增殖與凋亡平衡，調節(jié)細胞向惡性轉化［14］。近年來研究發(fā)現，YAP1表達升高與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，其在結腸癌、卵巢癌、乳腺癌等多種水體腫瘤中活性增強，提示其具有潛在的致癌潛能［15-17］。有關胃癌與 YAP1 的研究指出，YAP1 在胃癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織，且其表達水平與患者的 TNM 分期具有明顯相關關系［18］。吳衛(wèi)莉等［19］研究也指出，YAP1 高表達與胃癌臨床分期及不良預后密切相關，提示YAP1 可能作為預測胃癌的分子標志物。但關于YAP1 與胃癌化療敏感性的研究仍鮮有報道。本研究通過構建YAP1靶向沉默慢病毒，并感染胃癌細胞形成穩(wěn)定沉默YAP1 的細胞株，于體外實驗中探索性探究YAP1 對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲等生物學行為能力的影響，結果顯示，胃癌細胞中YAP1相對表達量明顯高于正常胃黏膜上皮細胞，且沉默YAP1 表達，胃癌細胞增殖、運動、遷移、侵襲能力明顯降低，提示YAP1 與胃癌細胞的增殖、運動、遷移、侵襲密切相關。體外順鉑敏感性實驗結果顯示，在不同順鉑濃度下，沉默YAP1 組胃癌細胞存活率及順鉑對細胞的IC50均明顯較低，為（1.48±0.33）μg/ml，表明抑制YAP1可改善胃癌細胞對順鉑的敏感性。

有研究發(fā)現，髓母細胞中YAP1 可誘導IGF 表達，并通過改善Akt活性強化細胞的放射抵抗力，促進放療后腫瘤細胞的生長，促進細胞再生［20］。與此同時也有研究指出，TGF-β 是YAP1 調節(jié)細胞生長、分化過程中的一個重要的轉錄共激活因子，在胞內信號分子SMADs 蛋白的協助下，YAP1 可參與TGF-β 的信號轉導作用，參與細胞分化過程和分化進程的調節(jié)［21］。基于此，本研究對沉默YAP1及順鉑干預后，不同組別胃癌細胞中YAP1及其下游相關基因和蛋白的表達水平進行檢測，結果發(fā)現，感染Lv-shRNA-YAP1 和順鉑干預的胃癌細胞中IGF、Akt、TGF- β 的 mRNA 和 蛋 白 相 對 表 達 量 較 低 ，Lv-shRNA-YAP1 聯合順鉑干預胃癌細胞中IGF、Akt、TGF-β mRNA 和蛋白相對表達量則進一步降低，提示沉默YAP1聯合順鉑干預對YAP1及其下游靶基因的調節(jié)作用更為顯著，表明靶向沉默YAP1表達逆轉胃癌細胞順鉑敏感性可能也下調下游IGF、Akt、TGF-β基因及蛋白表達有關。

綜上所述，YAP1蛋白在胃癌細胞SGC-7901中高表達，靶向沉默 YAP1 表達可通過下調 IGF、Akt、TGF-β 表達，抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖、遷移、侵襲，提高腫瘤細胞的順鉑敏感性。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。