趙甜甜 滕圣敏 滿其榮 王祥閣 張新東

1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬滕州市中心人民醫(yī)院病理科，山東 277500；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬滕州市中心人民醫(yī)院腫瘤科，山東 277500

肺癌是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌總數(shù)的75%～80%，是肺癌最主要的病理類型，其5年總生存率低于15%，肺癌患者生存率低的原因包括肺癌確診較晚，并且有些難以有明確的病理診斷導(dǎo)致錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)，腫瘤出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，缺少明確判斷預(yù)后和監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)的標(biāo)志物等［1］。Ki-67 表達(dá)于增殖細(xì)胞中，是與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)的核蛋白，可用于判斷腫瘤的增殖性和侵襲性［2］。細(xì)胞橋粒芯蛋白（desmoglein，DSG）3 是構(gòu)成復(fù)層上皮橋粒的重要跨膜蛋白，橋粒是上皮細(xì)胞間的細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)，如果上皮細(xì)胞中的DSG3 表達(dá)異常，將會(huì)影響橋粒連接的形成，根據(jù)其自身的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，DSG3在腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)必然與腫瘤轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后相關(guān)。臨床上DSG3 在腫瘤中應(yīng)用較多的是作為鱗癌標(biāo)志物應(yīng)用于鑒別診斷鱗癌與其他類型腫瘤，最新研究顯示DSG3 在一些上皮性腫瘤如食管癌、直腸癌或頭頸部腫瘤等有異常表達(dá)，并且其表達(dá)量的減少或增多與腫瘤的致癌或抑癌過(guò)程明顯相關(guān)［3-4］。本研究使用免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）方法檢測(cè)DSG3 在肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌等NSCLC 組織中的表達(dá)，分析其與腫瘤增殖標(biāo)志物Ki-67 及與預(yù)后相關(guān)的臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，探討DSG3的表達(dá)狀態(tài)對(duì)NSCLC患者預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 收集滕州市中心人民醫(yī)院在2015 年7 月至2019 年12 月期間經(jīng)外科手術(shù)切除的NSCLC標(biāo)本72 例，包括肺鱗狀細(xì)胞癌30 例，肺腺癌42 例。其中男51 例，女 21 例。年齡范圍 46～80 歲，中位年齡 65 歲。所有標(biāo)本經(jīng)術(shù)后常規(guī)組織病理確診為肺鱗狀細(xì)胞癌或肺腺癌。本研究使用NSCLC患者手術(shù)切除的石蠟組織標(biāo)本做相關(guān)檢測(cè)，所有檢測(cè)符合滕州市中心人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的相關(guān)要求。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)（型號(hào)Leica BOND-MAX）購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；一抗DSG3（鼠抗人單克隆抗體，克隆號(hào)：5G11）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Ki-67（鼠抗人單克隆抗體，克隆號(hào)：MIB-1）購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司；二抗免疫顯色試劑購(gòu)自上海徠卡生物系統(tǒng)公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測(cè)方法和結(jié)果判讀 所有標(biāo)本使用10%中性甲醛緩沖液固定12～24 h，經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)固定、脫水、透明后，石蠟包埋，做連續(xù)切片，切片厚度為4～5μm，裱貼于黏附載玻片（已經(jīng)APES 處理）上，于65 ℃烤片30 min，全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)染色，染色程序結(jié)束后，脫水透明，中性樹(shù)膠封片。更換不同批次的抗體時(shí)均設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。免疫組化結(jié)果判讀由兩位高年資主治醫(yī)師共同閱片。DSG3陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果為細(xì)胞膜有棕褐色顆粒沉著，當(dāng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于腫瘤細(xì)胞總數(shù)的10%或灶性區(qū)域出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)時(shí)即可定義為DSG3 表達(dá)陽(yáng)性；Ki-67 陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果為位于細(xì)胞核的棕褐色顆粒，表達(dá)值是陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的比值，需至少計(jì)數(shù)500個(gè)腫瘤細(xì)胞。

1.2.2 隨訪 采用電話、門診和住院的方式隨訪患者的總生存期。隨訪截止時(shí)間是2019 年12 月。隨訪時(shí)間13～52 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間是28 個(gè)月。總生存期是從確診腫瘤開(kāi)始，至因任何原因引起死亡或隨訪截止日期的時(shí)間。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Graph pad6.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)并作圖。各計(jì)量資料均符合正態(tài)分布。各組 Ki-67 表達(dá)值以（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；使用χ2檢驗(yàn)計(jì)算分析DSG3 表達(dá)相關(guān)影響因素；使用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并通過(guò)Log-rank檢驗(yàn)比較兩組生存曲線之間的差異。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC 組織DSG3 和Ki-67 的表達(dá)水平 使用免疫組化方法檢測(cè)72 例NSCLC 標(biāo)本中DSG3 和Ki-67 的表達(dá)，包括肺鱗狀細(xì)胞癌30 例，肺腺癌42 例。結(jié)果顯示DSG3 表達(dá)陽(yáng)性29 例，陰性 43 例，陽(yáng)性表達(dá)率40.28%；肺鱗狀細(xì)胞癌組與肺腺癌組Ki-67表達(dá)分別為（35.00±14.02）%、（28.81±13.83）%，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.067）；DSG3 陽(yáng)性組與 DSG3 陰性組 Ki-67 表達(dá)分別為（27.07±12.21）%、（34.30±14.74）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.032），DSG3 陽(yáng)性組的 Ki-67 表達(dá)值明顯低于 DSG3 陰性組。

2.2 NSCLC 組織DSG3表達(dá)相關(guān)影響因素分析 72例NSCLC 標(biāo)本中，DSG3 表達(dá)陽(yáng)性29 例，陽(yáng)性表達(dá)率40.28%。DSG3表達(dá)狀態(tài)與腫瘤的病理類型明顯相關(guān)，肺鱗狀細(xì)胞癌組DSG3 陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于肺腺癌組（P＜0.001）；DSG3 表達(dá)陽(yáng)性與腫瘤分化程度相關(guān)（P=0.033），腫瘤分化越差，DSG3 陽(yáng)性表達(dá)率越低；DSG3 表達(dá)陽(yáng)性與淋巴結(jié)是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P=0.016），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的DSG3 陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于無(wú)轉(zhuǎn)移組；DSG3表達(dá)狀態(tài)與其余臨床病理特征均無(wú)明顯相關(guān)性（均P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 NSCLC組織中DSG3表達(dá)相關(guān)影響因素分析

2.3 DSG3 表達(dá)與NSCLC 患者預(yù)后的關(guān)系 使用Kaplan-Meier法對(duì)72例NSCLC患者進(jìn)行生存分析，DSG3表達(dá)陽(yáng)性組患者中位生存時(shí)間26 個(gè)月，DSG3 表達(dá)陰性組患者中位生存時(shí)間30 個(gè)月；患者的總生存期在DSG3 陽(yáng)性表達(dá)組與DSG3陰性表達(dá)組無(wú)明顯差異（P=0.204）。見(jiàn)圖1。

圖1 NSCLC患者DSG3陽(yáng)性組（29例）與DSG3陰性組（43例）的生存曲線

3 討 論

目前發(fā)現(xiàn) DSG 有 4 種亞型，為 DSG1、DSG2、DSG3、DSG4，它與橋粒膠蛋白（desmocollin，DSC）組成鈣黏素超家族，并與橋粒斑蛋白（desmoplakin，DP）共同組成細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)橋?；虬霕蛄＃?］，橋粒連接通過(guò)影響細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的形成、增殖和分化過(guò)程。一些臨床研究和體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)明確證實(shí)DSG3 的表達(dá)水平與腫瘤的臨床分期和轉(zhuǎn)移有關(guān)［6-7］。DSG3 也是鱗狀上皮細(xì)胞比較敏感、特異的標(biāo)志物，有文獻(xiàn)報(bào)道，DSG3在肺鱗狀細(xì)胞癌組織中有大量表達(dá)［8］。之前的研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC 組織中，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)DSG3 的表達(dá)可有效區(qū)分肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌，尤其是在低分化肺癌標(biāo)本，可提高肺癌診斷準(zhǔn)確率，更好地指導(dǎo)臨床治療［9］。

Ki-67是存在于細(xì)胞核基質(zhì)的增殖抗原，它表達(dá)于細(xì)胞分裂周期除靜止期（G0 期）以外的各個(gè)時(shí)期，一旦增生期結(jié)束，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Ki-67就會(huì)迅速降解。所以Ki-67表達(dá)水平的高低反映腫瘤細(xì)胞的增殖速度，常被臨床應(yīng)用為評(píng)估肺癌預(yù)后的指標(biāo)［10］。本研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，Ki-67表達(dá)在肺鱗狀細(xì)胞癌組與肺腺癌組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。既往有研究，DP 表達(dá)的缺失與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，DP 的表達(dá)與Ki-67 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)［11］，但迄今暫未查詢到 DSG3 與Ki-67 表達(dá)關(guān)系的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，DSG3 陽(yáng)性組Ki-67 表達(dá)低于DSG3 陰性組，與上述研究結(jié)果大體相一致，這提示DSG3 表達(dá)陽(yáng)性的NSCLC 患者預(yù)后較陰性組好。但值得注意的是，Ki-67 并不是影響NSCLC 患者預(yù)后的獨(dú)立因素，由于其本身和腫瘤的病理類型、臨床分期和組織學(xué)分級(jí)等與腫瘤預(yù)后因素有一定的相關(guān)性［12］。

DSG3 廣泛分布在皮膚、食管、直腸、肺等器官，它是自身免疫性疾病天皰瘡的自身抗原，天皰瘡患者體內(nèi)含有針對(duì)DSG3的抗體，由于DSG3是上皮細(xì)胞間連接的重要結(jié)構(gòu)，DSG3表達(dá)的缺失可導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞橋粒間隙增加，因此出現(xiàn)上皮棘層細(xì)胞松解和水皰形成［13］。由于其自身結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)，DSG3在腫瘤細(xì)胞中的異常表達(dá)必然與腫瘤轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后相關(guān)，但DSG3 的作用是致癌還是抑癌，眾多研究結(jié)果并不一致［14］。本研究用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)DSG3 在肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DSG3 陽(yáng)性表達(dá)率在鱗癌組明顯高于腺癌組，這可能與DSG3 是鱗癌組織特異性標(biāo)志物有關(guān)。本研究選取了與腫瘤預(yù)后相關(guān)的一些指標(biāo)包括年腫瘤大小、分化程度和是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，分析其是否與DSG3 的表達(dá)有相關(guān)性，結(jié)果顯示DSG3的表達(dá)與腫瘤分化程度有關(guān)，腫瘤的分化程度越差，DSG3 的陽(yáng)性表達(dá)率越低，這與一些研究結(jié)果相同［15-16］。Xin 等［17］在研究口腔鱗癌 DSG3 的異常表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)DSG3表達(dá)減少與腫瘤分化差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高等腫瘤惡性行為相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)DSG3陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。根據(jù)以上統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示DSG3表達(dá)陽(yáng)性預(yù)示腫瘤分化程度較好，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率低，預(yù)后好于DSG3陰性表達(dá)者。

為進(jìn)一步明確DSG3的預(yù)后意義，我們就患者的總生存期進(jìn)行了回訪，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示NSCLC 患者的總生存期在DSG3 陽(yáng)性組和DSG3 陰性組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因：一是癌癥的發(fā)生發(fā)展是由多因素共同參與，雖然DSG3的表達(dá)影響腫瘤的分化和進(jìn)展，但在患者的預(yù)后方面它可能不起決定性作用，因此DSG3的表達(dá)狀態(tài)對(duì)患者的總生存期沒(méi)有影響；二是近年來(lái)的分子靶向治療主要針對(duì)肺腺癌患者，如EGFR 陽(yáng)性突變患者其在應(yīng)用靶向藥物后生存期較使用普通化療方案患者生存期可延長(zhǎng)3～4 倍［18］，而DSG3 表達(dá)陽(yáng)性率，肺鱗狀細(xì)胞癌高于肺腺癌，并且靶向治療在肺鱗狀細(xì)胞癌患者中研究應(yīng)用少，所以分子靶向治療方案的應(yīng)用延長(zhǎng)了肺腺癌患者的總生存期，從這一點(diǎn)上不能明確說(shuō)明DSG3是否影響患者的預(yù)后。

綜上所述，本研究從臨床病理特征和與Ki-67 相關(guān)性表達(dá)兩個(gè)方面上說(shuō)明DSG3 的表達(dá)狀態(tài)對(duì)NSCLC 患者的預(yù)后有一定影響，但也有研究顯示不同的結(jié)果，認(rèn)為NSCLC患者DSG3 表達(dá)陽(yáng)性預(yù)示不良的預(yù)后［19］。NSCLC 患者生存率較低的原因是肺癌確診較晚，有些難以有明確的病理診斷導(dǎo)致錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)，缺少明確判斷預(yù)后和監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)的標(biāo)志物，DSG3既可以輔助病理醫(yī)生明確診斷肺癌的病理類型，又可以輔助臨床醫(yī)生判斷患者預(yù)后，從而指導(dǎo)治療，所以DSG3不失為一個(gè)重要的腫瘤標(biāo)志物。在下一步的工作中我們需要做進(jìn)一步的相關(guān)研究，在研究對(duì)象的選擇上入組標(biāo)準(zhǔn)更加統(tǒng)一化，并且擴(kuò)大樣本量，以得出明確結(jié)論。

利益沖突：作者已申明文章無(wú)相關(guān)利益沖突。