馮曉敏 湯永峰 徐娟 李惠 可飛 韓梅

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院南京市婦幼保健院病理科，江蘇 210029；2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院江蘇省中醫(yī)院病理科 210029

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生在子宮內(nèi)膜的一組惡性上皮性腫瘤，是僅次于宮頸癌的第2 常見婦科惡性腫瘤。子宮內(nèi)膜樣癌作為Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌的一種，預(yù)后好，5 年生存率約90%［1］，然而，患者生存率的高低除了與組織學(xué)分級相關(guān)之外，還與子宮深肌層浸潤（＞1/2）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓及宮頸間質(zhì)浸潤有關(guān)［2-3］。Murray等［4］在2003年第1次描述了低級別子宮內(nèi)膜樣癌一種特別的肌層浸潤模式：微囊性、拉長及碎片狀（MELF）的浸潤模式，鏡下可見到微囊狀、拉長及碎片狀的腺體，表面被覆嗜酸性胞漿、扁平的細(xì)胞，局部可見到腫瘤細(xì)胞簇狀及單個胞漿淡染的細(xì)胞；周圍可見疏松的、黏液樣的間質(zhì)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MELF 浸潤多發(fā)生在低級別子宮內(nèi)膜樣癌中，與子宮深肌層浸潤、脈管癌栓及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等預(yù)后不良因素有關(guān)［5-7］。本研究回顧性研究183 例低級別子宮內(nèi)膜樣癌患者，對比分析具有MELF 浸潤與無MELF 浸潤的低級別子宮內(nèi)膜樣癌的臨床病理學(xué)特征及相關(guān)分子表達(dá)，并對患者進(jìn)行隨訪，希望對具有MELF 浸潤模式的低級別子宮內(nèi)膜樣癌的臨床處理及預(yù)后評估提供更多證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016 年4 月至2020 年12 月于江蘇省中醫(yī)院及南京市婦幼保健院進(jìn)行全子宮切除、雙側(cè)附件切除和盆腔（或加腹主動脈旁）淋巴結(jié)清掃手術(shù)的183 例低級別子宮內(nèi)膜樣癌病例，通過具有MELF 浸潤與無MELF浸潤篩選出研究組和對照組，對比分析其臨床病理學(xué)特征及相關(guān)分子特征。

1.2 方法及試劑 將低級別子宮內(nèi)膜樣癌標(biāo)本常規(guī)4%中性甲醛固定，上機(jī)、脫水、浸蠟、包埋，切片之后進(jìn)行HE 染色。 使用羅氏全自動免疫組織化學(xué)儀（VentanaBenchMark XT）進(jìn)行免疫組化標(biāo)記。細(xì)胞角蛋白（CK）抗體自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司購買，D2-40、CD34、抗體則來自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，p53 蛋和MMR 蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）抗體購自福州邁新公司。每個抗體均設(shè)有陽性對照，為已確定表達(dá)陽性的組織，陰性對照用PBS 代替一抗進(jìn)行染色。CK 以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，D2-40 和 CD34 陽性可顯示脈管，p53 和 MMR 蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核，p53 判讀陽性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒。p53 彌漫強陽性（＞70%）或全部陰性時，判為p53 突變型，反之判為p53 野生型，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 蛋白細(xì)胞核均呈棕褐色為表達(dá)正常，如果有1 種及以上MMR 蛋白核無著色為表達(dá)缺失。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以例（%）表示分類變量，比較采用Pearson 卡方及Fisher 精確概率檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床病理學(xué)特征 患者年齡為（57.6±6.2）歲（48～69 歲）。按照2014 版國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期+Ⅱ期患者170例，Ⅲ期+Ⅳ期患者13例。術(shù)后同時進(jìn)行放化療者有79 例，只行化療者有104 例。統(tǒng)計結(jié)果顯示，伴MELF 浸潤的研究組與無MELF 浸潤的對照組相比，浸潤子宮肌層深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓方面的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表1。

2.2 病理學(xué)檢查

2.2.1 巨檢 183 例低級別子宮內(nèi)膜樣癌標(biāo)本中，134 例表現(xiàn)為宮腔內(nèi)腫物，49 例表現(xiàn)為內(nèi)膜輕度不規(guī)則增厚。研究組24 例標(biāo)本中，18 例宮腔內(nèi)可見大小不等的質(zhì)脆腫物，易碎伴/不伴出血壞死，切面呈灰白灰黃色，腫瘤侵及肌層，腫物最大徑1.5～12.0 cm；6 例腫塊不明顯，僅表現(xiàn)為內(nèi)膜輕度不規(guī)則增厚。研究組與對照組的低級別子宮內(nèi)膜樣癌標(biāo)本巨檢情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2.2 鏡下 經(jīng)典型低級別子宮內(nèi)膜樣癌肌層內(nèi)可見腺泡狀或乳頭狀生長的腫瘤性腺體，可伴有少量實性成分。MELF 浸潤模式除了上述組織學(xué)特征之外，還可見微囊性、拉長的裂隙樣及碎片狀腺體，上皮細(xì)胞呈立方或扁平狀，細(xì)胞漿呈淡染、嗜酸性（圖1A、B、D）。MELF 浸潤模式一般出現(xiàn)在腫瘤浸潤的前沿部分；MELF浸潤腺體周圍可出現(xiàn)疏松的黏液樣、水腫的纖維間質(zhì)（圖1B）；部分病例可見到單個細(xì)胞或嗜酸性的腫瘤細(xì)胞簇，這些細(xì)胞與泡沫樣組織細(xì)胞相似，在細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間可見到淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的浸潤（圖1A、B）。部分病例可見脈管內(nèi)癌栓（圖1C、E、F）；部分病例可見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，大多數(shù)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中可見被膜下竇內(nèi)單個細(xì)胞、嗜酸性腫瘤細(xì)胞簇或微囊性、拉長型腺體（圖2）；而無MELF 浸潤的低級別子宮內(nèi)膜樣癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞多呈巢團(tuán)狀分布，少見單個細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

圖1 具有微囊性、拉長及碎片狀（MELF）肌層浸潤特征的低級別子宮內(nèi)膜樣癌的鏡下情況。A、B 為疏松的黏液及炎細(xì)胞背景中可見到微囊性、拉長（A）及碎片狀（B）的腺體，被覆上皮呈立方、扁平狀（HE ×200），C 為脈管內(nèi)可見到嗜酸性的腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞簇（HE ×200），D 為CK 顯示MELF 腺體及細(xì)胞陽性（EnVision法 ×200），E為CD34標(biāo)記脈管（EnVision法 ×200），F(xiàn)為CK標(biāo)記脈管內(nèi)癌栓（EnVision法 ×200）

圖2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表現(xiàn)。A、B 為淋巴結(jié)被膜下竇內(nèi)可見細(xì)胞漿呈嗜酸性的單個腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞簇，黑色箭頭所指（HE ×200），C、D為細(xì)胞角蛋白顯示被膜下陽性的腫瘤細(xì)胞及腺體（EnVision法 ×200）

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果 CK 免疫標(biāo)記可顯示不易分辨的MELF 型腺體、單個細(xì)胞及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。CK、D2-40、CD34 同時陽性可顯示脈管內(nèi)癌栓。研究組24 例低級別子宮內(nèi)膜樣癌中，21 例可見脈管癌栓，15 例可見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其中6 例可見腹主動脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。對照組159 例低級別子宮內(nèi)膜樣癌中，39 例可見脈管癌栓，4 例可見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其中2 例可見腹主動脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究組和對照組的突變型p53 表達(dá)率分別為16.7%（4/24）和6.3%（10/159）。研究組和對照組的MSH2-MSH6 缺失率分別為8.3%（2/24）和1.3%（2/159），MLH1-PMS2 缺失率分別為 4.2%（1/24）和 7.5%（12/159），PMS2 缺失率分別為 0 和9.4%（15/159），MSH6 缺失率分別為 4.2%（1/24）和 3.1%（5/159）。見表1。

2.4 隨訪結(jié)果 183例患者隨訪時間為（32.2±6.5）個月（7～56個月）。隨訪期間內(nèi)，研究組有2例復(fù)發(fā)，1例失訪。對照組有1例復(fù)發(fā)，3例失訪，其余未見進(jìn)展。去掉失訪病例和無進(jìn)展病例，兩組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組低級別子宮內(nèi)膜樣癌的臨床病理特征及分子分型相關(guān)蛋白表達(dá)[例（%）]

3 討 論

具有MELF 浸潤模式的子宮內(nèi)膜樣癌是一類比較特殊的子宮內(nèi)膜樣癌，由 Murray 等［4］在 2003 年首次提出。此類腫瘤主要表現(xiàn)為子宮肌層內(nèi)可見MELF 的腺體及單個腫瘤細(xì)胞，周圍可見纖維水腫的黏液樣間質(zhì)以及大量的炎細(xì)胞。研究表明，MELF浸潤模式通常發(fā)生在低級別子宮內(nèi)膜樣癌中，且脈管癌栓及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較常出現(xiàn)。Hertel 等［8］也發(fā)現(xiàn)，MELF 型肌層浸潤的存在與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，但是大多數(shù)形態(tài)學(xué)不典型，低倍鏡很難識別。國外關(guān)于MELF浸潤模式的子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生率在10%～20%之間［8］，國內(nèi)相關(guān)報道較少，我們觀察了2 家三甲醫(yī)院的近5 年MELF型子宮內(nèi)膜樣癌的病理報告檢出率均小于5%。本文回顧性分析低級別子宮內(nèi)膜樣癌183例，檢出24例伴MELF浸潤的低級別子宮內(nèi)膜樣癌（發(fā)生率為13.1%）。

本研究中，研究組患者臨床表現(xiàn)多為陰道不規(guī)則出血、月經(jīng)紊亂或絕經(jīng)后出血，巨檢有18 例子宮內(nèi)膜可見大小不一的腫物，6 例表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜不同程度的增厚。其中3 例合并子宮腺肌癥，5 例合并子宮平滑肌瘤，以上臨床特征與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。其他相關(guān)研究也證實，單純子宮內(nèi)膜樣癌患者與同時合并子宮腺肌癥的子宮內(nèi)膜癌患者的無病生存率和總生存率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義［9］。

鏡下可見MELF 浸潤模式大多數(shù)發(fā)生在低級別子宮內(nèi)膜樣癌中，多位于腫瘤浸潤的最前面，以微囊性、裂隙樣腺體及碎片狀、單個腫瘤細(xì)胞在肌層中浸潤為特征，腺體被漿呈淡染、嗜酸性；最具有特征的是其周圍間質(zhì)呈疏松黏液、水腫樣，并見到不同種類的炎性細(xì)胞浸潤。具有MELF 結(jié)構(gòu)的低級別子宮內(nèi)膜樣癌常伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，鏡下多表現(xiàn)為淋巴結(jié)被膜下竇內(nèi)單個腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞簇或微囊性腺體，胞漿豐富且呈嗜酸性。CK、D2-40、CD34 共同表達(dá)可顯示脈管癌栓和淋巴結(jié)內(nèi)的轉(zhuǎn)移灶。目前尚無識別MELF 結(jié)構(gòu)的特異性指標(biāo)，主要依靠形態(tài)學(xué)診斷，上述形態(tài)學(xué)特征和腫瘤的間質(zhì)背景可以幫助識別MELF 形態(tài)。越來越多的研究表明，與普通型低級別子宮內(nèi)膜樣癌相比，MELF形態(tài)特征的腫瘤細(xì)胞周圍間質(zhì)炎細(xì)胞中T 淋巴細(xì)胞和CD68 陽性的巨噬細(xì)胞較少，而間質(zhì)富于T 淋巴細(xì)胞才是預(yù)后良好的指標(biāo)［10］，腫瘤周圍浸潤灶中巨噬細(xì)胞的減少也通常與預(yù)后不良有關(guān)［11］。

有文獻(xiàn)統(tǒng)計，在464 例子宮內(nèi)膜樣癌中，其中伴MELF浸潤的子宮內(nèi)膜樣癌60 例（60/464，12.9%），對比有與無MELF 浸潤的子宮內(nèi)膜樣癌時，發(fā)現(xiàn)有MELF 浸潤者更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（18.3%比1.2%）［6］。也有研究證實淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是子宮內(nèi)膜癌的獨立危險因素［12］，合并腹主動脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者比盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后更差［13］。本研究183 例低級別子宮內(nèi)膜樣癌中，研究組患者在深肌層浸潤發(fā)生率、脈管癌栓陽性率、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率方面明顯高于對照組（分別為 91.6% 比 17.6%、87.5% 比 3.1%、62.5% 比2.5%），與Joehlin 等［6］的研究結(jié)果相似。本研究同時發(fā)現(xiàn)，研究組的腹主動脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率亦明顯高于對照組（25.0%比1.3%）。有研究發(fā)現(xiàn)，合并盆腔淋巴結(jié)或腹主動脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者的5 年生存為44%～52%［14］，而具有MELF浸潤的子宮內(nèi)膜樣癌通常伴有更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。Mariani等［15-16］研究認(rèn)為出現(xiàn)深肌層浸潤是患者發(fā)生肺、肝等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要預(yù)測指標(biāo)，也是低級別子宮內(nèi)膜癌患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和死亡的重要因素，建議臨床醫(yī)生對深肌層浸潤患者進(jìn)行積極的術(shù)后輔助治療。

2020 年第5 版世界衛(wèi)生組織分類依據(jù)子宮內(nèi)膜樣癌的分子特征將其分為4 型：POLE（polymerase epsilon）-超突變型、MMR（mismatch repair）-缺失型、p53 突變型和無特異性分子特征型。近年來，對于具有MELF 浸潤模式的子宮內(nèi)膜樣癌的分子研究也取得了一定的進(jìn)展。

眾所周知，子宮內(nèi)膜癌是遺傳性非息肉病性大腸癌（hereditary nonpolyposis colortal cancer，HNPCC）家族中最常見的腸外腫瘤之一，HNPCC 是一種由錯配修復(fù)基因MMR突變引起的常染色體顯性遺傳病，又稱林奇綜合征。MMR蛋白主要有4 種（MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2），林奇綜合征中最常見的突變基因為MLH1 和MSH2，4 個蛋白質(zhì)只有兩兩配對（MLH1-PMS2 和MSH2-MSH6）后才可以有效的發(fā)揮生物學(xué)功能，MSH2 突變可導(dǎo)致MSH2-MSH6 的表達(dá)缺失，MSH6突變一般只導(dǎo)致MSH6表達(dá)缺失；MLH1突變可導(dǎo)致 MLH1-PMS2 表達(dá)缺失，PMS2 突變一般只導(dǎo)致PMS2 表達(dá)缺失［17］。有研究對4 種MMR 蛋白進(jìn)行免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，具有MELF 浸潤模式的腫瘤中MSH2-MSH6缺失發(fā)生率比無MELF 浸潤的子宮內(nèi)膜癌更高（MELF 型為7.14%，無MELF型為3.96%），而無MELF浸潤模式的腫瘤中更容易發(fā)生 MLH1-PMS2 表達(dá)缺失（無 MELF 型為 32.67%，MELF 型為21.43%），表明它們可能具有不同的分子特征，會有不同的臨床處理［18］。本研究中，研究組MSH2-MSH6 缺失率和MSH6 單獨缺失率均高于對照組，而研究組的MLH1-PMS2缺失率及PMS2單獨缺失率均低于對照組，與上述研究結(jié)果有相似的傾向性，同時也發(fā)現(xiàn)研究組中由MSH2 突變導(dǎo)致的MSH2-MSH6 缺失發(fā)生率較高。有研究表明，MSH2 突變導(dǎo)致女性患癌的風(fēng)險最高［19］。但本研究中，研究組與對照組中的MSH2-MSH6 的缺失發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而MMR 基因突變是否會影響預(yù)后及個體化的臨床治療，還有待于更大樣本量的研究進(jìn)一步證實。

p53為腫瘤抑制基因，是人類惡性腫瘤中最容易發(fā)生改變的基因，目前在子宮內(nèi)膜癌中被廣泛研究，p53 突變約占所有低級別子宮內(nèi)膜樣癌的10%，多見于高級別子宮內(nèi)膜樣癌，約50%的高級別子宮內(nèi)膜樣癌可發(fā)生p53 突變，而低級別子宮內(nèi)膜樣癌突變比率較少。本研究對象均為低級別子宮內(nèi)膜樣癌，發(fā)現(xiàn)研究組比對照組更容易發(fā)生p53 突變，突變型 p53 表達(dá)率分別為 16.7%（4/24）和 6.3%（10/159）。突變型p53 屬于轉(zhuǎn)錄因子，它能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和惡化。p53 突變是子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后不良的重要因素之一，也和子宮內(nèi)膜癌患者生存期的長短有著直接關(guān)系［20］。

子宮內(nèi)膜癌是目前已知POLE 基因突變比例最高的惡性腫瘤［21］。許多研究表明POLE 突變型子宮內(nèi)膜癌可能會有更好的預(yù)后，但并不是所有的研究都證明這種情況的存在［22-24］。He 等［25］的研究表明 POLE 突變型腫瘤并不總是有良好的預(yù)后，特別是當(dāng)POLE 突變型與MELF 浸潤模式同時存在時，MELF 型浸潤增加了15.1 倍的腫瘤進(jìn)展風(fēng)險，而這種現(xiàn)象在POLE 野生型亞組中并不存在。因此推測MELF浸潤模式可能是POLE 突變型腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)展風(fēng)險的一個可能的預(yù)測因子，但是連接MELF 和POLE 突變的生物學(xué)機(jī)制仍然是未知的。本研究POLE 基因的相關(guān)實驗正在進(jìn)行中，結(jié)果尚不完整，后續(xù)結(jié)果我們會進(jìn)一步報道。

總之，子宮內(nèi)膜樣癌的分子分型對于確定患者治療方案、評估預(yù)后及篩查林奇綜合征有著很重要的意義，掌握MELF型子宮內(nèi)膜樣癌特殊的分子學(xué)特征，有望為患者的個體化治療及預(yù)后評估提供新思路。

本研究對183 例低級別子宮內(nèi)膜樣癌患者進(jìn)行了隨訪，隨訪時間為（32.2±6.5）個月（7～56 個月），隨訪期間內(nèi)，研究組中有2例復(fù)發(fā)，對照組中有1例復(fù)發(fā)，兩組對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。研究組中2 例患者分別在術(shù)后36 個月和39 個月復(fù)發(fā)，對照組中1 例患者在術(shù)后54 個月復(fù)發(fā)，也有研究發(fā)現(xiàn)MELF 浸潤型子宮內(nèi)膜樣癌患者的復(fù)發(fā)間隔時間較短［26］。另外本研究中，研究組與對照組的深肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓及隨訪結(jié)果方面，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），提示MELF 浸潤模式可能為低級別子宮內(nèi)膜樣癌的不良預(yù)后因子。MELF 浸潤模式是否能夠成為子宮內(nèi)膜樣癌的獨立預(yù)后因素尚有爭議。Hertel等［8］研究證實，MELF 浸潤模式是子宮內(nèi)膜樣癌的獨立預(yù)后因素，更容易出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)，但MELF 浸潤對子宮內(nèi)膜樣癌患者總體生存率無影響。與之相反，也有部分研究表明MELF 浸潤模式并不能成為子宮內(nèi)膜樣癌低生存率的獨立相關(guān)因素［5］。

綜上所述，MELF浸潤模式作為子宮內(nèi)膜樣癌一種特殊的浸潤方式，其發(fā)生可能與多種基因協(xié)作機(jī)制有關(guān)。病理醫(yī)師應(yīng)熟練掌握其特殊的形態(tài)學(xué)特征，當(dāng)發(fā)現(xiàn)MELF 浸潤時，應(yīng)仔細(xì)評估肌層浸潤深度、脈管癌栓及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，必要時行免疫組化檢測輔助診斷，同時建議將其臨床病理學(xué)特征與分子分型相結(jié)合，共同用于子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險評估中，以更有效的明確對預(yù)后的影響，也有望為臨床提供更精確和個體化的治療方案，因本研究病例數(shù)和隨訪時間有限，MELF 浸潤對患者總體生存率是否有影響，還需大樣本量的研究及長期隨訪。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。