徐愛國 白瑪央宗 旦真次仁 高鵬

（1.西藏自治區(qū)高原生物研究所；2.西藏種質(zhì)資源庫，西藏 拉薩 850001；3.西藏自治區(qū)林芝市科學(xué)技術(shù)局，西藏 林芝 860000；4.西藏百菌農(nóng)業(yè)科技有限公司，西藏 拉薩 850000）

樺褐孔菌,又名斜生纖孔菌，學(xué)名為Inonotus obliquus(Fr.)Pilat，屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、褐臥孔菌屬，是一種珍稀的食藥用菌。據(jù)文獻(xiàn)資料顯示，樺褐孔菌是前蘇聯(lián)各共和國、波蘭、日本等國的民間常用藥物，主要分布于北半球北緯40°～50°的方位內(nèi)，俄羅斯北部、北歐、中國東北、日本北海道等地。根據(jù)文獻(xiàn)資料顯示和科研考察得知，樺褐孔菌在西藏自治區(qū)主要分布于林芝地區(qū)的米林、波密、察隅及日喀則地區(qū)的吉隆溝等地，但是資源量較小，隨著人們的大量采挖販賣，資源量更加稀少，在西藏樺褐孔菌產(chǎn)地原來鄰近村莊的山林已經(jīng)很難尋覓到樺褐孔菌子實(shí)體，若繼續(xù)通過采挖野生資源的方式既不能滿足人們需求，也不利于生態(tài)保護(hù)。因此，我們通過對(duì)西藏野生樺褐孔菌資源采集，對(duì)其菌種進(jìn)行分離鑒定，并在相同液體發(fā)酵條件下，以其包內(nèi)多糖和胞外多糖相加的總量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，初步篩選出西藏樺褐孔菌多糖高產(chǎn)菌株，以備以后進(jìn)一步研究利用。

1 菌種的分離鑒定

1.1 菌種來源

DZCR161 是西藏自治區(qū)林芝市科學(xué)技術(shù)局旦真次仁于林芝地區(qū)采集，為便于描述在本文中編為1號(hào)，GP2018 是長期于西藏從事大型真菌在種植工作的高鵬于吉隆分離得到，為便于描述在本文中編為2號(hào)，XAG2403 由西藏種質(zhì)資源庫采集保存，菌種保藏編號(hào)為AF0002051XAG2403，為便于描述在本文中編為3號(hào)。

1.2 菌種分離純化

選取干凈新鮮的樺褐孔菌子實(shí)體，先用氣吹吹去表面的灰塵等雜物，掰開在酒精燈火焰的無菌區(qū)域內(nèi)，用手術(shù)刀切取子實(shí)體內(nèi)部約麥粒大小子實(shí)體塊，接種到，接入裝有PDA 培養(yǎng)基斜面試管，要將挑取的組織盡量埋入培養(yǎng)基表層，每個(gè)子實(shí)體分離5 支試管并一一編號(hào)，將其置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察其萌發(fā)情況和生長特性，選取無雜菌污染，菌絲生長粗壯旺盛的試管進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，連續(xù)幾代后得到純化菌種（見圖1）。

圖1 純化的3株樺褐孔菌菌種

1.3 菌種鑒定

1.3.1 鑒定方法。將純化后的菌種菌絲體為實(shí)驗(yàn)材料，用CTAB 法提取DNA，采用區(qū)擴(kuò)增通用引物ITS4和ITS5 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測后將PCR 反應(yīng)產(chǎn)物送至測序公司進(jìn)行測序。對(duì)測得的ITS區(qū)段DNA 序列運(yùn)用GenBank 中的BLAST 工具軟件在DNA 序列數(shù)據(jù)庫中搜索同源DNA 序列并進(jìn)行比較分析，根據(jù)BLAST 搜索和比較的結(jié)果，結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征判斷真菌的物種或與其近緣的物種。

1.3.2 序列BLAST 過程。以序列1 號(hào)為例：用bioedit打開1 號(hào)的序列，將1 號(hào)序列復(fù)制粘貼入NCBI 的BLAST 框中進(jìn)行比對(duì)，得到BLAST 的結(jié)果，Per Ident高于99%（見圖2），alignments結(jié)果顯示序列比對(duì)結(jié)果與Inonotus obliquus是一致的（見圖3），展開序列，進(jìn)行下載，查看系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果，可以確認(rèn)BLAST 結(jié)果為Inonotus obliquus（見圖4）。

圖2 BLAST結(jié)果

圖3 alignments結(jié)果

圖4 系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果

2 多糖高產(chǎn)菌株篩選實(shí)驗(yàn)

2.1 液體培養(yǎng)基制作

1L培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200g 去皮切成細(xì)條、玉米粉10g、豆粕粉10g，加入1000mL 水中煮沸30min，煮熟8 層紗布過濾，取濾液后補(bǔ)足1000mL，加入磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂2g，葡萄糖20g，消泡劑5g，攪拌均勻，分裝入500mL 三角瓶內(nèi)，每瓶裝入培養(yǎng)基月300mL，塞上棉塞，報(bào)紙包扎封口后在，高壓滅菌鍋內(nèi)121℃，滅菌30min 后取出，冷卻至25℃待用。

2.2 液體發(fā)酵

將分裝好的液體培養(yǎng)基，在超凈工作臺(tái)分別接入1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)三個(gè)菌種，接種時(shí)每個(gè)三角瓶接入長滿菌種的斜面培養(yǎng)基約0.5cm2一塊，每個(gè)菌種接種5 瓶培養(yǎng)基，接種在磁力攪拌器上25℃攪拌培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分鐘，10 天后檢查三角瓶內(nèi)菌絲球濃密、健壯、均勻、無污染后使用。

2.3 多糖提取

2.3.1 胞外多糖的提取。發(fā)酵結(jié)束后，取1L 發(fā)酵液用中速濾紙，抽慮分離菌絲體和發(fā)酵液，將發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)為原體積1/4 左右，然后加入4 倍體積的95%乙醇，充分?jǐn)嚢枋苟嗵浅恋沓鰜?，?℃下靜置過夜，用95%的乙醇反復(fù)沖洗多糖沉淀，以除去摻雜于其中的還原糖和小分子物質(zhì)，得到下層沉淀在45℃干燥5h后，得到胞外粗多糖，稱重記錄，1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)菌種1L 發(fā)酵液中提取的胞外多糖分別為14.2g、10.8g、14.0 g。

2.3.2 胞內(nèi)多糖的提取。取1L 發(fā)酵液發(fā)酵液，過濾得菌絲體60℃烘干至恒重，將菌體粉碎，加入30 倍體積的去離子水充分破碎，破碎后在80℃下浸提2 h，提取液減壓濃縮至原體積的1/5，加3 倍體積的無水乙醇沉淀，靜置數(shù)小時(shí)后過濾，沉淀物烘干得到樺褐孔菌胞內(nèi)多糖，稱重記錄，1 號(hào)、2 號(hào)、3 號(hào)菌種1L 發(fā)酵液中菌絲體內(nèi)提取的胞內(nèi)多糖分別為8.7g、8.0g、11.5g。

2.3.3 多糖高產(chǎn)菌株篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，相同液體發(fā)酵條件下，以其包內(nèi)多糖和胞外多糖相加的總量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，3 號(hào)菌種1L 發(fā)酵液所得多糖總量最多為25.5g；其次是1 號(hào)菌種22.9g，2 號(hào)菌種18.8g，見表1。

表1 多糖產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)表

3 結(jié)論

通過分子鑒定來自與西藏的3 株野生樺褐孔菌1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)菌種均為Inonotus obliquus(Fr.)Pilat。

通過對(duì)3 株菌菌株液體發(fā)酵，以相同條件下每個(gè)菌株產(chǎn)胞內(nèi)、胞外多糖的總量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，初步篩選出由西藏種質(zhì)資源庫采集保存的菌種保藏編號(hào)為AF0002051XAG2403 的菌種是西藏野生樺褐孔菌多糖高產(chǎn)菌株。

4 下一步研究思考

通過西藏樺褐孔菌液體發(fā)酵代謝產(chǎn)物和分子實(shí)體營養(yǎng)成分對(duì)比，進(jìn)一步論證用液體發(fā)酵方法替代樺褐孔菌子實(shí)體的可能。

用分子育種技術(shù)對(duì)西藏樺褐孔菌菌株進(jìn)行選育、液體發(fā)酵多糖高產(chǎn)工藝優(yōu)化以及多糖提取工藝優(yōu)化來實(shí)現(xiàn)樺褐孔菌多糖的高產(chǎn)，進(jìn)而進(jìn)行產(chǎn)品開發(fā)研究。