沈彩紅，孫 林，黃文杰，沈永奇，盧永剛，孫一帆△

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳鐵中心醫(yī)院：1.感染科；2.檢驗科；3.腫瘤科；4.肝膽外科，廣西柳州 545007)

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其在腫瘤中的發(fā)病率位列第4，病死率位列第3[1]。肝癌具有較高的發(fā)病率和病死率，急切需要有效的早期診斷。目前，肝癌早期診斷較為理想的血清標(biāo)志物為甲胎蛋白，但由于其特異度不高，故亟待探索其他有助于肝癌早期有效診斷的生物標(biāo)志物。近年來，外泌體在腫瘤疾病中的作用已成為研究熱點之一。外泌體中含大量核酸、蛋白、脂質(zhì)等物質(zhì)，參與了細胞之間或細胞與組織間的通訊，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。環(huán)狀RNA(circRNA)作為外泌體內(nèi)含物中的一種核酸，隨著RNA測序技術(shù)的迅速發(fā)展，大量circRNA被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生存在潛在的關(guān)聯(lián)，發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，具有巨大潛力，因此，其有可能成為肝癌早期篩查的一種新型生物標(biāo)志物[2]。本研究通過對肝癌HepG2細胞外泌體與正常肝細胞LO2共同培養(yǎng)后circRNA表達進行比較，篩選驗證了具有差異表達的circRNA，并預(yù)測分析了其在肝癌發(fā)展的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

外泌體提取試劑盒(美國Thermo公司)、總RNA提取試劑盒(美國Qiagen公司)、Trizol試劑(美國Invitrogen公司)、Arraystar Super RNA Labeling Kit(美國Arraystar公司)、Arraystar Human circRNA Arrays V2(美國Arraystar公司)、SYBRGreen 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒(美國Thermo公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司)、AB7500熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)、低溫冷凍離心機(美國Sigma公司)、Agilent Hybridization Oven、Agilent Scanner G2505C、Nanodrop ND-1000等。實時熒光定量 PCR所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR反應(yīng)引物

1.2 方法

1.2.1外泌體提取與鑒定

收集生長良好的HepG2細胞培養(yǎng)液至離心管中，4 ℃、3 000 r/min離心30 min后收集上清液至新的離心管加入外泌體提取試劑，4 ℃過夜孵育后再4 ℃、3 000 r/min離心60 min，棄上清液，所得沉淀即為外泌體。用無菌1×磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)重懸外泌體，儲存于-80 ℃?zhèn)溆?。通過透射電鏡掃描和納米顆粒跟蹤分析儀對所提取的外泌體進行鑒定。

1.2.2標(biāo)本收集與處理

分為對照組(正常肝細胞LO2)和實驗組[正常肝細胞LO2+HepG2細胞外泌體(100 μg/mL)]。按照分組對LO2細胞進行處理，HepG2細胞外泌體與LO2細胞共培養(yǎng)48 h后收集細胞，加上Trizol裂解液，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，進行circRNA芯片分析。

1.2.3外泌體處理LO2細胞后差異表達circRNA篩選

選取實驗組和對照組標(biāo)本各2份總RNA，使用美國Arraystar公司的8x15K的Arraystar Human circRNA Arrays V2芯片在Agilent Hybridization Oven 儀器上進行circRNA雜交檢測，用Agilent Scanner G2505C儀器進行掃描獲取circRNA芯片檢測數(shù)據(jù)。利用R software limma package，以P<0.05且差異表達倍數(shù)(fold change)>2的條件篩選差異表達的circRNA。在篩選差異表達circRNA中選擇上調(diào)和下調(diào)差異表達倍數(shù)排在前5位的circRNA進行進一步驗證。

1.2.4差異表達的circRNA生物信息學(xué)分析

通過生物信息學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫對差異表達的circRNA進行基因本體論(gene ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路分析，預(yù)測差異表達的circRNA相關(guān)的生物學(xué)功能。

1.2.5實時熒光定量PCR 驗證circRNA的表達

使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBRGreen PCR試劑盒說明書進行實時熒光定量 PCR檢測篩選得到的上調(diào)和下調(diào)差異表達前5位的 circRNA相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 外泌體的提取和鑒定

經(jīng)透射電鏡觀察，從HepG2細胞培養(yǎng)液中提取到的沉淀物其形態(tài)為有圓形或橢圓形脂膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，見圖1A；顆粒大小為50～150 nm，見圖1B。成功從HepG2細胞培養(yǎng)液中分離提取到外泌體。

2.2 CircRNA芯片原始數(shù)據(jù)均一化

CircRNA芯片原始圖像資料采用Agilent Feature Extraction軟件進行數(shù)據(jù)提取，利用R語言limma軟件包依據(jù)Quantile算法規(guī)則對circRNA芯片數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化和均一化處理。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化和均一化處理后消除了染色偏差和點樣針頭帶來空間差異引起基因表達量的不同，對照組和實驗組標(biāo)本circRNA表達經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后熒光信號強度基本一致，可進一步進行circRNA基因差異表達分析。

2.3 芯片數(shù)據(jù)差異表達基因篩選分析

CircRNA基因芯片在對照組和實驗組共培養(yǎng)后共檢測出10 017個circRNA，為篩選出正常LO2細胞和外泌體處理后細胞中差異表達的基因，以FC>2且P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出235個差異表達的circRNA，其中50個circRNA上調(diào)表達，185個circRNA下調(diào)表達；其中前10位明顯上調(diào)和明顯下調(diào)的circRNA見表2。根據(jù)FC>2且P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)繪制火山圖，見圖2。經(jīng)HepG2細胞外泌體處理LO2細胞后，circRNA低表達數(shù)量多于高表達數(shù)量。

A：外泌體形態(tài)鑒定；B：外泌體顆粒大小檢測。

兩側(cè)紅點和藍點：兩組間存在差異表達的circRNA；右側(cè)藍點：經(jīng)外泌體處理后LO2細胞中上調(diào)表達的circRNA；左側(cè)紅點：外泌體處理后LO2細胞中下調(diào)表達的circRNA。

2.4 外泌體處理后LO2細胞相關(guān)circRNA的聚類分析

對照組和實驗組經(jīng)篩選獲得的circRNA表達水平進行聚類分析結(jié)果見圖2。差異表達的circRNA中LO2細胞經(jīng)外泌體處理后低表達的circRNA多于高表達的circRNA，見圖3。與火山圖分析結(jié)果一致。

2.5 在LO2細胞中驗證差異表達的circRNA

根根前面篩選結(jié)果挑選出其中表達倍數(shù)差異較大的前5個表達上調(diào)或下調(diào)的circRNA，見表2。上調(diào)表達的hsa_circRNA_0010044、hsa_circRNA_009012、hsa_circRNA_101016、hsa_circRNA_100917、hsa_circRNA_007918和下調(diào)表達的hsa_circRNA_002082、hsa_circRNA_103128、hsa_circRNA_092388、hsa_circRNA_007343、hsa_circRNA_071935等circRNA在HepG2細胞外泌體處理后的LO2細胞表達與之前分析結(jié)果一致，見圖4。hsa_circRNA_0010044、hsa_circRNA_009012、hsa_circRNA_101016、hsa_circRNA_100917、hsa_circRNA_007918等circRNA確實在經(jīng)外泌體處理后的LO2細胞中的表達水平明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；hsa_circRNA_002082、hsa_circRNA_103128、hsa_circRNA_092388、hsa_circRNA_007343、hsa_circRNA_071935等circRNA確實在經(jīng)外泌體處理后的LO2細胞中的表達水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與之前生物信息學(xué)預(yù)測分析結(jié)果一致。

縱軸：基因聚類；橫軸：標(biāo)本聚類；綠色：該基因在經(jīng)外泌體處理后的LO2細胞中低表達；紅色：基因在經(jīng)外泌體處理后的LO2細胞中高表達；黑色：該基因在二者中無明顯差異。

表2 正常LO2細胞經(jīng)HepG2細胞外泌體處理后表達上調(diào)和下調(diào)的circRNA(倍數(shù)改變排列在前10的circRNA)

圖4 正常LO2細胞經(jīng)HepG2細胞外泌體處理后差異表達上調(diào)和下調(diào)的circRNA聚類分析熱圖

2.6 差異表達circRNA的GO、KEGG分析結(jié)果

GO富集分析經(jīng)HepG2外泌體處理后LO2細胞中表達上調(diào)或下調(diào)前5個的circRNA宿主基因可能參與的生物過程主要富集在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控，RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，Rac蛋白信號傳導(dǎo)的調(diào)控，血管內(nèi)皮生長因子受體信號通路等；可能參與的細胞成分主要富集在核仁、細胞質(zhì)、核質(zhì)、細胞膜等；可能參與的分子功能主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子激活結(jié)合、N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性等。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)HepG2外泌體處理后LO2細胞中表達上調(diào)或下調(diào)前5的circRNA的宿主基因與細胞周期、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路、腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)。

3 討 論

外泌體是一種具有雙層脂膜結(jié)構(gòu)的細胞外小泡，由JOHNSTONE等[3]在1989年研究成熟的綿羊網(wǎng)織紅細胞時發(fā)現(xiàn)報道。外泌體經(jīng)細胞“內(nèi)吞-融合-外排”等過程形成直徑為50～140 nm圓形或橢圓形囊泡，廣泛分布于血漿、腦脊液、乳汁、胸腹腔積液、尿液等物質(zhì)中，甚至存在于細胞培養(yǎng)上清液中[4]，其內(nèi)含豐富的核酸[(微小RNA(micro RNA，miRNA)、長非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、circRNA等]、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)可在細胞間進行信號傳遞[5]。 外泌體參與了細胞之間或細胞與組織之間重要信息和物質(zhì)的交換，在人類細胞生長、發(fā)育、分化、衰老等生理過程中發(fā)揮著重要作用。越來越多的研究表明，外泌體參與了細胞間通訊和微環(huán)境調(diào)節(jié)，可促進病毒擴散及炎癥的發(fā)生，誘導(dǎo)腫瘤細胞之間交換致癌因子并維持相鄰基質(zhì)細胞的腫瘤生長，在腫瘤轉(zhuǎn)移、發(fā)生中具有重要作用；通過傳遞非編碼RNA觸發(fā)化學(xué)耐藥性誘導(dǎo)肝臟疾病的惡性轉(zhuǎn)化， 刺激免疫激活及免疫逃逸，可作為生物標(biāo)志物用于腫瘤的預(yù)測和診治[6-8]。

circRNA是由5′和3′末端首尾環(huán)化形成一個特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過套索驅(qū)動環(huán)化和內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化形成的circRNA[9-10]，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定在體內(nèi)不易被核酸酶降解。近年來，隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，circRNA廣泛存在于不同生物的細胞質(zhì)中，具有多樣性、高度穩(wěn)定性、時空特異性等[11-12]。在胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可與miRNA結(jié)合，競爭性抑制miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進而影響腫瘤的生長、發(fā)育[13-15]。此外，在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)，腫瘤分泌的外泌體中存在大量差異表達的circRNA，研究其影響腫瘤生長、發(fā)育的生物功能，可作為一種生物標(biāo)志物在腫瘤診斷、預(yù)后評估等方面具有極大的潛力[16]。

肝癌分泌的外泌體中含豐富的核酸(miRNA、lncRNA、circRNA等)，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，其生物功能也成為研究熱點之一。肝癌細胞分泌的外泌體miRNA-21能使肝星狀細胞向腫瘤相關(guān)的成纖維細胞轉(zhuǎn)化促進腫瘤的發(fā)生[17]。肝癌高轉(zhuǎn)移的肝癌細胞分泌的外泌體miRNA-1247-3p可直接作用靶向B4GALT3基因促使肝細胞癌(HCC)向肺癌轉(zhuǎn)移[18]。轉(zhuǎn)化生長因子β選擇性使lincRNA-ROR在肝癌細胞分泌的外泌體中表達增加，使HCC細胞對索拉菲尼敏感性降低，對其產(chǎn)生耐藥性而降低療效[19]。在肝癌HepG2、97L、LM3等細胞系分泌的外泌體中發(fā)現(xiàn)，circPTGR1與間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(MET)競爭性靶向miRNA449a促進肝癌的發(fā)生、發(fā)展[20]。肝癌細胞分泌的外泌體circ-100338可通過作用人臍靜脈內(nèi)皮細胞促進血管生成，使肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移[21]。Circ-0061395在肝癌分泌的外泌體中表達增加，可通過miR-877-5p/PIK3R3軸影響細胞增殖、侵襲、遷移等能力促進肝癌的發(fā)生、發(fā)展[22]。肝癌細胞分泌的外泌體中circUHRF1表達增加造成自然殺傷細胞功能紊亂，circUHRF1可通過降解miR-449c-5p上調(diào)TIM-3的機制誘導(dǎo)自然殺傷細胞的功能障礙，參與免疫抑制導(dǎo)致肝癌預(yù)后較差[23]。因此，肝癌分泌的外泌體中含有大量核酸物質(zhì)在肝癌轉(zhuǎn)移、發(fā)生、發(fā)展及治療中均發(fā)揮了重要的作用，在肝癌的診斷和預(yù)后治療方面具有巨大潛力，外泌體中更多的核酸其生物功能需進一步研究發(fā)現(xiàn)。

本研究通過HepG2細胞外泌體與正常LO2細胞共同培養(yǎng)后對其circRNA表達譜進行了全面測序，按FC>2且P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出235個差異表達的circRNA，其中50個circRNA上調(diào)表達，185個circRNA下調(diào)表達。通過火山圖、聚類熱圖等分析，在HepG2細胞外泌體與正常LO2細胞共同培養(yǎng)后篩選出差異表達明顯上調(diào)或下調(diào)的前5個circRNA，并通過實時熒光定量PCR驗證hsa_circRNA_0010044、hsa_circRNA_009012、hsa_circRNA_101016、hsa_circRNA_100917、hsa_circRNA_007918等circRNA經(jīng)外泌體處理后表達水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；hsa_circRNA_002082、hsa_circRNA_103128、hsa_circRNA_092388、hsa_circRNA_007343、hsa_circRNA_071935等circRNA經(jīng)外泌體處理后表達水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。通過GO、KEGG富集分析，經(jīng)HepG2外泌體處理后LO2細胞中表達上調(diào)或下調(diào)前5個的circRNA的宿主基因可能參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子受體信號通路、蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子激活結(jié)合、細胞周期、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路等生物過程。細胞周期是細胞分裂和復(fù)制的過程，與細胞增殖、分化密切相關(guān)，而細胞增殖失控正是癌癥發(fā)生、發(fā)展的特征之一[24]。

綜上所述，hsa_circRNA_0010044、hsa_circRNA_009012、hsa_circRNA_101016、hsa_circRNA_100917、hsa_circRNA_007918等5個表達上調(diào)和hsa_circRNA_002082、hsa_circRNA_103128、hsa_circRNA_092388、hsa_circRNA_007343、hsa_circRNA_071935等5個表達下調(diào)的circRNA可能影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展，有可能成為潛在的生物標(biāo)志物，為今后研究肝癌的發(fā)生機制提供了理論依據(jù)。同時，本研究尚存在一些不足，由于實驗條件和時間的限制對差異表達的circRNA只在細胞上進行了初步的驗證其表達，并未進行后續(xù)實驗驗證。因此，今后仍需增加后續(xù)相關(guān)驗證實驗，逐步驗證其生物功能，進一步研究circRNA在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制。