黃金羽，韓小瑩，閆 駿，蔣 媛，雷 蕾，林榮團(tuán)△

(1.Lady Davis Institute,McGill University,Montreal,Canada,H3T 1E2；.天津市第一中心醫(yī)院病理科 300192；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)護(hù)理學(xué)院，重慶 400038)

眾所周知，原發(fā)性肝癌是全球第六常見的癌癥類型[1]，但其惡性程度較高，易早期轉(zhuǎn)移，病死率高居第2位，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。原發(fā)性肝癌最常見的類型為肝細(xì)胞癌，有資料顯示約占總病例數(shù)的80%[2]。細(xì)胞凋亡是機(jī)體為維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主死亡的主動(dòng)調(diào)控方式，是機(jī)體抑制細(xì)胞癌變的重要機(jī)制之一。在癌細(xì)胞中細(xì)胞凋亡機(jī)制多被破壞，其生長不再受限制，從而形成腫瘤。前期研究已證實(shí)，內(nèi)源性途徑是細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制，其關(guān)鍵步驟之一是由B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因調(diào)節(jié)的線粒體外膜通透性增加導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，從而激活下游含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)，該通路在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中至關(guān)重要[3]。酪氨酸激酶非受體1(tyrosine kinase non-receptor 1，TNK1)是目前已被發(fā)現(xiàn)的首個(gè)具有抑制腫瘤特性的酪氨酸激酶，TNK1能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并在人胚胎腎細(xì)胞HEK293中獲得初步證實(shí)，在人胰腺癌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)具有致癌作用，TNK1在不同細(xì)胞類型中的功能和作用尚需進(jìn)行個(gè)體化精準(zhǔn)研究[4-7]。目前，對(duì)TNK1在肝癌細(xì)胞中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚少見文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)該領(lǐng)域的深入研究必要而迫切。但由于前期研究已發(fā)現(xiàn)，人肝癌細(xì)胞中TNK1的表達(dá)受到明顯抑制，極可能導(dǎo)致其引發(fā)的細(xì)胞凋亡途徑無法激活，故本研究選擇同一種屬、同一器官的正常細(xì)胞系——人永生化肝細(xì)胞作為研究對(duì)象進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人永生化肝細(xì)胞系IHH購于美國AcceGen Biotechnology公司；人胚胎腎細(xì)胞系HEK293、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2、Huh7、Huh7.5均購于美國菌種保藏中心。鹽酸多西環(huán)素粉末(#D9891)購于美國Sigma-Aldrich公司；依托泊苷粉末(#E1383)購于美國Sigma-Aldrich公司；線粒體蛋白分離試劑盒 (#89874)購于美國Thermo Fisher Scientific公司；人體組織標(biāo)本由天津第一中心醫(yī)院病理科閆駿博士提供，免疫組織化學(xué)法試劑盒購于美國Cell Signaling Technology公司，使用的抗體和染色包括anti-Glypican-3 (#ab216606;Abcam)、anti-TNK1 (#PA5-14795;Thermo Fisher Scientific)、H&E Staining Kit (#ab245880;Abcam)等；一抗[anti-TNK1(#4507)、anti-cleaved-PARP(Asp214;#5626S)、anti-caspase-3(#9662)、anti-cleaved-caspase-3(Asp175;#9661S)、anti-caspase-9(#9502)、anti-cleaved-caspase-9(Asp315;#20750S)、anti-Cytochrome c(#11940S)、anti-Bax(#5023S)、anti-Bak(#12105S)、anti-Bcl-2(#15071S)、anti-Bcl-xL(#2764S)、anti-Mcl-1(#94296S)]均購于美國Cell Signaling Technology公司；anti-微管蛋白(sc-5286)購于美國Santa Cruz Biotechnology公司；anti-β-actin (ABT264)購于美國Millipore公司；Annexin V APC、SYTOXTMGreen試劑盒(#V35113)購于美國Thermo Fisher Scientific公司，BD Fortessa流式細(xì)胞分析儀購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1建立IHH rtTA-TNK1細(xì)胞模型

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由pTight-TNK1、pMLV-gag-pol、pVSV-G質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞中包裝完成；IHH rtTA-TNK1細(xì)胞模型由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染IHH細(xì)胞制成。具體步驟：在100 mm細(xì)胞盤中鋪入2×106HEK293細(xì)胞并培養(yǎng)24 h后用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑(#L3000015；Invitrogen)轉(zhuǎn)染6 μg pTight-TNK1、6 μg pMLV-gag-pol、2 μg pVSV-G質(zhì)粒并培養(yǎng)48 h后過濾并收集上清液。在6孔細(xì)胞板中鋪入3×105IHH細(xì)胞后培養(yǎng)24 h，加入上清液和10 μg/mL Polybrene(#638133；Millipore)并培養(yǎng) 24 h。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至100 mm細(xì)胞盤中并用 2 μg/mL Puromycin (#A1113803;Thermo Fisher)篩選2周。收集儲(chǔ)存被檢驗(yàn)多西環(huán)素激活TNK1表達(dá)陽性后的存活細(xì)胞。

1.2.2多西環(huán)素處理

將多西環(huán)素粉末溶于水中制成多西環(huán)素溶液(1 mg/mL)。將多西環(huán)素溶液加入新鮮培養(yǎng)基至100 ng/mL(或其他指定質(zhì)量濃度)后加入細(xì)胞板中，37 ℃處理24 h。

1.2.3依托泊苷處理

將依托泊苷粉末溶于二甲基亞砜(DMSO)中制成依托泊苷溶液(50 mmol/L)。將依托泊苷溶液加入新鮮培養(yǎng)基至100 μmol/L(或其他指定濃度)后加入細(xì)胞板中，37 ℃處理24 h。

1.2.4線粒體分離

收集2×107細(xì)胞并在常溫3 000 r/min離心2 min后移除上清液，加入800 μL 試劑A并以中速振蕩5 s后置于冰上處理2 min，加入10 μL 試劑B并以高速振蕩5 s后置于冰上處理5 min且高速振蕩1次，加入800 μL 試劑C來回晃動(dòng)混勻后4 ℃、2 500 r/min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中于4 ℃、10 000 r/min離心15 min后分離并保存上清液(細(xì)胞質(zhì)部分)，用500 μL 試劑C洗滌沉淀(線粒體部分)后10 000 r/min離心5 min移除上清液。分離后樣品加入2×十二烷基硫酸鈉(twelve alkyl sodium sulfate,SDS)上樣緩沖液并進(jìn)行免疫印跡法處理。

1.2.5免疫組織化學(xué)法

對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理，以3%過氧化氫去離子水孵育10 min，用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)沖洗；滴加一抗，室溫孵育1 h，PBS浸泡沖洗3 min，重復(fù)5次；滴加enhancer增強(qiáng)劑，37 ℃處理30 min后PBS浸泡沖洗3 min，重復(fù)5次；滴加通用型免疫球蛋白G抗體，室溫孵育1 h，PBS沖洗3 min，重復(fù)5次；使用二氨基聯(lián)苯胺溶液顯色；蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明后封片，拍照。

1.2.6免疫印跡法

(1)細(xì)胞蛋白制備，收集細(xì)胞后以PBS洗滌1次，加入RIPA裂解液50 μL 后置于冰上30 min，并且每10分鐘振蕩破碎1次。4 ℃、13 200 r/min離心15 min后吸取上清液，轉(zhuǎn)入滅菌離心管，測定蛋白濃度并標(biāo)記，計(jì)算上樣量與上樣濃度后用PBS將樣品稀釋至統(tǒng)一濃度并置于-80 ℃保存待用。(2)SDS-聚丙稀酰胺(polyacrylamide，PAGE)電泳，解凍樣品后按已計(jì)算出的各樣品1/2體積加入2×SDS上樣緩沖液，充分混勻，在金屬加熱混樣器上將蛋白樣品進(jìn)行99 ℃加熱處理10 min。按測定的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小制備10%的SDS-PAGE膠，沖洗上樣孔2次后上樣，80 V恒壓電泳，待樣品中溴酚藍(lán)條帶遷移到凝膠底部時(shí)，終止電泳。(3)電泳轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)，預(yù)先制備電泳轉(zhuǎn)移緩沖液，將其放置于4 ℃預(yù)冷，將已完成電泳后的蛋白膠根據(jù)Marker指示按需要切取適當(dāng)大小貼于硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)上，以三明治法兩面覆蓋3層濾紙、趕盡氣泡后使用半干轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)進(jìn)行半干印跡轉(zhuǎn)移。(4)抗原抗體反應(yīng)，將NC膜浸泡于封閉液[含5%脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBST)液]中，于垂直搖床上室溫封閉1 h后用PBST洗滌5 min，將待檢測蛋白的一抗以1∶1 000比例稀釋于封閉液中并覆蓋在NC膜上，搖床4 ℃過夜孵育。將已完成一抗孵育處理的NC膜用PBST在水平搖床上洗滌3次，每次10 min。將相應(yīng)二抗以1∶3 000(鼠抗)或1∶5 000(兔抗)比例稀釋于封閉液中，覆蓋在NC膜上并置于垂直搖床上室溫孵育1 h后洗膜3次，進(jìn)行蛋白顯影檢測。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)

收集細(xì)胞后用PBS洗滌1次，加入1×Annexin V結(jié)合緩沖液后于常溫以4 200 r/min離心3 min并吸走上清液，向底部細(xì)胞加入1×Annexin V結(jié)合緩沖液重懸浮并將濃度調(diào)至1×106/mL。取1 mL樣品加入5 μL APC-Annexin V和1 μL SYTOX?Green染色劑，于37 ℃處理15 min，并采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定。

2 結(jié) 果

2.1 TNK1在人肝細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)均明顯下降

3例患者肝細(xì)胞癌組織免疫組織化學(xué)法檢測顯示，蘇木精-伊紅染色標(biāo)記的細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞外基質(zhì)呈粉色，顯示了組織切片中細(xì)胞的分布趨勢(shì)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC-3) 抗體染色標(biāo)記的肝細(xì)胞癌細(xì)胞呈黃褐色，從而區(qū)分了組織切片中的癌組織和正常組織；TNK1抗體染色標(biāo)記的TNK1蛋白呈淺紅色，癌組織區(qū)域中TNK1表達(dá)明顯低于周邊正常組織，見圖1A。免疫印跡法檢測結(jié)果也同樣證實(shí)，TNK1在人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系Huh7、Huh7.5、HepG2中的表達(dá)程度均明顯低于人肝細(xì)胞系IHH對(duì)照組，見圖1B。

2.2 多西環(huán)素誘導(dǎo)IHH rtTA-TNK1細(xì)胞模型中的細(xì)胞凋亡和TNK1表達(dá)升高

IHH rtTA-TNK1細(xì)胞以0、25、50、100 ng/mL多西環(huán)素處理48 h后行流式細(xì)胞測試顯示，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(Annexin-V信號(hào)陽性)的細(xì)胞比例分別為6.4%、24.2%、52.7%、74.7%，見圖2。IHH rtTA-TNK1細(xì)胞由100 ng/mL多西環(huán)素處理24 h后經(jīng)細(xì)胞裂解處理并進(jìn)行免疫印跡法檢測TNK1和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(c-PARP、caspase-3、c-caspase-3、caspase-9、c-caspase-9)表達(dá)水平；IHH細(xì)胞由100 μmol/L依托泊苷予以相同處理作為陽性對(duì)照。結(jié)果顯示，在IHH rtTA-TNK1細(xì)胞模型中多西環(huán)素能誘導(dǎo)TNK1表達(dá)升高；同時(shí)，多西環(huán)素誘導(dǎo)還引起了細(xì)胞凋亡相關(guān)c-PARP、c-caspase-3、c-caspase-9蛋白表達(dá)水平提高，見圖3。

A：人肝細(xì)胞癌組織免疫組織化學(xué)法檢測；B：免疫印跡法檢測IHH、Huh7、Huh7.5、HepG2細(xì)胞系中TNK1和β-actin表達(dá)水平。

圖2 多西環(huán)素誘導(dǎo)IHH rtTA-TNK1細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象

圖3 在IHH rtTA-TNK1細(xì)胞中多西環(huán)素激活生產(chǎn)的TNK1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白

2.3 IHH rtTA-TNK1細(xì)胞模型中多西環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)的TNK1導(dǎo)致Cytochrome C轉(zhuǎn)移

IHH rtTA-TNK1細(xì)胞被多西環(huán)素處理后分別通過全細(xì)胞溶解和線粒體分離處理，免疫印跡法檢測顯示，在全細(xì)胞溶解標(biāo)本中多西環(huán)素促進(jìn)TNK1表達(dá)而不影響微管蛋白和Cytochrome C的表達(dá)。經(jīng)線粒體分離處理后微管蛋白集中在細(xì)胞質(zhì)部分而多西環(huán)素處理不影響微管蛋白的分布；多西環(huán)素使TNK1大量出現(xiàn)于線粒體部分，少量出現(xiàn)于細(xì)胞質(zhì)部分；未經(jīng)多西環(huán)素處理時(shí)Cytochrome C集中在線粒體部分，而多西環(huán)素處理使線粒體和細(xì)胞質(zhì)中均檢測到Cytochrome C，見圖4。在IHH rtTA-TNK1細(xì)胞模型中多西環(huán)素處理誘導(dǎo)TNK1表達(dá)，并使部分Cytochrome C從線粒體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中。

wcl：全細(xì)胞裂解產(chǎn)物;m：線粒體分離產(chǎn)物;c：細(xì)胞質(zhì)分離產(chǎn)物。

2.4 IHH rtTA-TNK1細(xì)胞模型中多西環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)的TNK1能介導(dǎo)Bcl-2家族蛋白水平變化

IHH rtTA-TNK1細(xì)胞由100 ng/mL多西環(huán)素處理0、24、48 h后經(jīng)細(xì)胞裂解處理并用免疫印跡法檢測Bcl-2家族蛋白(Bax、Bak、Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1)表達(dá)水平；IHH細(xì)胞由100 μmol/L依托泊苷予以相同處理作為陽性對(duì)照。結(jié)果顯示，在IHH rtTA-TNK1細(xì)胞模型中多西環(huán)素誘導(dǎo)的TNK1在促進(jìn)Bak蛋白表達(dá)的同時(shí)降低了Bcl-xL和Mcl-1蛋白水平，而對(duì)Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平無顯著影響，見圖5。

圖5 在IHH rtTA-TNK1細(xì)胞中多西環(huán)素激活生產(chǎn)的TNK1調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白表達(dá)

3 討 論

TNK1是被發(fā)現(xiàn)的首個(gè)具有抑癌作用的酪氨酸激酶，通過同源重組生產(chǎn)的TNK1+/-和TNK1-/-小鼠均會(huì)自發(fā)地形成腫瘤，另外在患有彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的小鼠中TNK1表達(dá)水平顯著下降[4]。然而，TNK1也可幫助腫瘤形成。LIERMAN等[6]使用逆轉(zhuǎn)錄病毒插入突變掃描鑒定TNK1為致癌基因。另外也有研究證明，TNK1對(duì)霍奇金淋巴瘤細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞的生存和生長至關(guān)重要[7-8]。因此，確認(rèn)TNK1在人肝細(xì)胞癌細(xì)胞中具有抑癌或致癌作用是必要的。本研究免疫組織化學(xué)法和免疫印跡法檢測均證明了TNK1在人肝細(xì)胞癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)水平明顯低于正常細(xì)胞組織(圖1)，證實(shí)TNK1在人肝組織中應(yīng)扮演著抑癌角色，另外TNK1也據(jù)此可能作為未來診斷早期人肝細(xì)胞癌的重要生物標(biāo)志物。

多西環(huán)素屬常見四環(huán)素類抗菌藥物，具有抗感染、抗腫瘤等作用，其機(jī)制主要為抑制磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素(phosphorylated mammalian target of rapamycin，P-mTOR)水平[9]。本研究構(gòu)建了IHH rtTA-TNK1細(xì)胞系，多西環(huán)素可激活其tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)，從而使細(xì)胞表達(dá)TNK1。依托泊苷可與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ結(jié)合，使DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生的瞬間鏈的斷裂難以修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生依托泊苷劑量依賴性DNA損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。因此，本研究將依托泊苷作為誘導(dǎo)劑，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象，從而作為陽性對(duì)照。本研究流式細(xì)胞法和免疫印跡法檢測均證明，在人肝細(xì)胞中TNK1過表達(dá)能使Annexin V信號(hào)呈陽性并誘導(dǎo)產(chǎn)生c-caspase-3和c-PARP，因此，TNK1可激活人肝細(xì)胞的凋亡程序(圖2、3)，鑒于細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤產(chǎn)生和治療癌癥的重要機(jī)制之一，結(jié)合免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果，作者認(rèn)為TNK1在人肝組織中具有抑癌作用的結(jié)論成立，未來可通過過表達(dá)TNK1激活細(xì)胞凋亡程序抑制肝癌細(xì)胞增殖。但本研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)含IHH基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的正常IHH肝細(xì)胞TNK1表達(dá)無法通過蛋白印跡法被檢測出來(圖3)，同樣未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的正常肝細(xì)胞TNK1表達(dá)也未能順利被檢出來(圖5)，作者認(rèn)為這是由于激活TNK1后IHH細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，導(dǎo)致收樣細(xì)胞的總量大幅下降、樣品蛋白濃度較低，為保持上樣量的統(tǒng)一，圖3、5的對(duì)照組上樣蛋白總量相對(duì)圖1組織蛋白總量較低所致。

內(nèi)源性通路和外源性通路是激活細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制[3,11]，其中內(nèi)源性通路的核心機(jī)制是由Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)的線粒體外膜通透性提高導(dǎo)致線粒體中促凋亡酶被釋放進(jìn)細(xì)胞質(zhì)，最終激活caspase-9并形成c-caspase-9[3,12-13]。本研究為確認(rèn)TNK1是否通過內(nèi)源性通路激活細(xì)胞凋亡，檢測了TNK1對(duì)內(nèi)源性通路內(nèi)重要蛋白的影響：(1)TNK1表達(dá)激活并切割了caspase-9從而產(chǎn)生了內(nèi)源性通路的重要終產(chǎn)物——c-caspase-9(圖3)；(2)TNK1促使線粒體中Cytochrome C被釋放到細(xì)胞質(zhì)中(圖4)；(3)TNK1上調(diào)了Bak并下調(diào)了Bcl-xL和Mcl-1蛋白水平，而不影響B(tài)ax和Bcl-2的表達(dá)(圖5)。在Bcl-2家族蛋白中促凋亡的Bax和Bak與抗凋亡的Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1相互平衡，進(jìn)而調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性[14]。

綜上所述，在人肝細(xì)胞中TNK1通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白中Bak、Bcl-xL和Mcl-1的平衡，提高了線粒體外膜通透性，進(jìn)而使Cytochrome C轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)并激活caspase-9，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。2015年常虹等[15]研究表明，三氧化二砷聯(lián)合丹參酮膠囊能通過明顯抑制細(xì)胞增殖、提高凋亡率、顯著下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2等表達(dá)、上調(diào)c-caspase-9等促凋亡蛋白表達(dá)等機(jī)制影響肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡，TNK1在人肝細(xì)胞中通過內(nèi)源性通路激活細(xì)胞凋亡上述機(jī)制研究也或可為新型抗肝癌藥物的開發(fā)提供一種新思路。