楊 筱,陳 穎,喬志遠(yuǎn),張艷榮

(1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，鄭州 451100;2.商洛學(xué)院，商洛 726000;3.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院，開封 475000)

宮頸癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，長鏈非編碼RNA(LncRNA)在宮頸癌中表達(dá)上調(diào)/下調(diào)，其序列上存在多種微小RNA(miRNA)的結(jié)合位點，其可調(diào)控miRNA的表達(dá)而間接調(diào)節(jié)其靶基因表達(dá)，LncRNA MALAT1通過激活PI3K/Akt途徑促進(jìn)宮頸癌的順鉑耐藥性[1-2]。沉默LncRNA ZFAS1可抑制宮頸癌增殖、遷移和侵襲進(jìn)而增強(qiáng)順鉑敏感性[3]。LncRNA UCA1還可能作為宮頸癌治療的潛在靶標(biāo)[4]。LncRNA MLK7-AS1在卵巢癌中表達(dá)水平升高，并可通過調(diào)節(jié)miR-375/YAP1軸促進(jìn)卵巢癌的發(fā)展[5]。但MLK7-AS1對宮頸癌順鉑耐藥的影響及其可能作用機(jī)制尚未闡明。靶基因預(yù)測顯示微小RNA-143(miR-143)與MLK7-AS1存在結(jié)合位點，研究表明，miR-143通過抑制MYO6而抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[6]。但MLK7-AS1與miR-143可否介導(dǎo)宮頸癌順鉑耐藥過程尚未可知。本研究采用低濃度加量持續(xù)誘導(dǎo)法建立宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞，探討MLK7-AS1與miR-143在宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞中的表達(dá)及其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人宮頸癌細(xì)胞SiHa、正常宮頸細(xì)胞ECT1/E6E7購自美國ATCC細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自上海玉博生物；Lipofectamine2000、凋亡檢測試劑盒、MTT試劑、Trizol試劑購自北京索萊寶；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR檢測試劑購自北京天根；順鉑(cDDP)購自上海懋康生物；si-NC、si-MLK7-AS1、miR-NC、miR-143 mimics、miR-143 inhibitor及其陰性對照(NC)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 采用低濃度加量持續(xù)誘導(dǎo)法建立宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞SiHa/cDDP[7]：用0.1μg/mL順鉑處理宮頸癌細(xì)胞SiHa 14d，用0.5μg/mL順鉑處理SiHa細(xì)胞6周，用1μg/mL順鉑處理SiHa細(xì)胞12周，后續(xù)分別使用2μg/mL、4μg/mL順鉑處理SiHa細(xì)胞8周、12周，通過40周的誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞可在含順鉑的培養(yǎng)液(4μg/mL)中穩(wěn)定生長，并可正常傳代，成功建立宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞SiHa/cDDP。

ECT1/E6E7細(xì)胞、SiHa細(xì)胞、SiHa/cDDP細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素與100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，其中SiHa/cDDP細(xì)胞加終濃度為4μg/mL的順鉑維持其耐藥性。取對數(shù)生長期SiHa/cDDP細(xì)胞接種于6孔板(5×104細(xì)胞/孔)，待細(xì)胞生長融合度達(dá)70%時，分別取si-NC、si-MLK7-AS1、si-MLK7-AS1+NC、si-MLK7-AS1+miR-143 inhibitor(各100pmol)與脂質(zhì)體充分混勻，室溫孵育30min，使用不含血清的培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞及脂質(zhì)體，分別將細(xì)胞加至脂質(zhì)體中，轉(zhuǎn)染6h，將培養(yǎng)液更換為DMEM新鮮培養(yǎng)液，加含順鉑的培養(yǎng)液(4μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)48h，分別記為si-NC組、si-MLK7-AS1組、si-MLK7-AS1+NC組、si-MLK7-AS1+miR-143 inhibitor組。

1.2.2 MTT法檢測不同濃度順鉑處理細(xì)胞后細(xì)胞存活率 SiHa細(xì)胞、SiHa/cDDP細(xì)胞接種于96孔板(3×104細(xì)胞/孔)，分別使用不同劑量的順鉑處理細(xì)胞，分別記為cDDP 0μg/mL組、cDDP 0.5μg/mL組、cDDP 1.0μg/mL組、cDDP 1.5μg/mL組、cDDP 2.0 μg/mL組，繼續(xù)培養(yǎng)24h，加MTT溶液(20μL/孔)，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4h，棄上清，加DMSO(150μL/孔)，室溫避光孵育5min，檢測各孔光密度值(OD490nm)，細(xì)胞存活率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.3 qRT-PCR檢測細(xì)胞中MLK7-AS1、miR-143表達(dá)水平 采用Trizol法提取細(xì)胞中總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑將總RNA合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，按試劑盒說明書操作，采用2-ΔΔCt法計算MLK7-AS1、miR-143相對表達(dá)量。

1.2.4 平板克隆形成實驗 取各組SiHa/cDDP細(xì)胞接種于6孔板(5×104細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)14d，棄培養(yǎng)液，采用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，加甲醇(500μL/孔)孵育20min，棄甲醇，加400μL結(jié)晶紫染色液(1%)孵育15min，晾干后觀察克隆形成細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 MTT檢測細(xì)胞增殖 取si-NC組、si-MLK7-AS1組、si-MLK7-AS1+NC組、si-MLK7-AS1+miR-143 inhibitor組SiHa/cDDP細(xì)胞接種于96孔板(3×104細(xì)胞/孔)，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，加MTT溶液(20μL/孔)，培養(yǎng)4h，棄上清，將DMSO加至96孔板(150μL/孔)，室溫避光孵育5min，檢測各孔OD值并計算細(xì)胞存活率。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取si-NC組、si-MLK7-AS1組、si-MLK7-AS1+NC組、si-MLK7-AS1+miR-143 inhibitor組SiHa/cDDP細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌，棄上清，按凋亡檢測試劑盒說明書檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測MLK7-AS1與miR-143的靶向關(guān)系 用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點進(jìn)行突變，構(gòu)建含有結(jié)合位點的突變型載體WT-MLK7-AS1與含有突變位點的突變型載體MUT-MLK7-AS1，分別將miR-NC、miR-143 mimics與WT-MLK7-AS1、MUT-MLK7-AS1共轉(zhuǎn)染入SiHa/cDDP細(xì)胞，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞并檢測熒光素酶活性。

1.2.8 Western blot法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 取si-NC組、si-MLK7-AS1組、si-MLK7-AS1+NC組、si-MLK7-AS1+miR-143 inhibitor組SiHa/cDDP細(xì)胞，加400μL RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，取蛋白樣品(50μg)進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育一抗稀釋液(Bax稀釋比1∶1000，Bcl-2稀釋比1∶1000，內(nèi)參GAPDH稀釋比1∶1000)24h(美國CST)，TBST洗滌，孵育二抗稀釋液(1∶5000)1h(美國Abcam)，滴加ECL，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度cDDP對SiHa和SiHa/cDDP的影響 用不同濃度順鉑處理后，SiHa細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)，且隨著濃度的增加而明顯降低(P<0.05)；用不同濃度順鉑處理后，SiHa/cDDP細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)，但順鉑不同濃度組間細(xì)胞存活率下降幅度低于SiHa細(xì)胞，見表1。

表1 不同濃度cDDP對SiHa和SiHa/cDDP細(xì)胞存活率的影響

2.2 MLK7-AS1和miR-143在SiHa/cDDP細(xì)胞中的表達(dá) 與ECT1/E6E7細(xì)胞比較，SiHa細(xì)胞、SiHa/cDDP細(xì)胞中MLK7-AS1表達(dá)水平升高(P<0.05)，miR-143表達(dá)水平降低(P<0.05)；與SiHa細(xì)胞比較，SiHa/cDDP細(xì)胞中MLK7-AS1表達(dá)水平升高(P<0.05)，miR-143表達(dá)水平降低(P<0.05)，見表2。

表2 MLK7-AS1和miR-143在SiHa/cDDP和SiHa和正常宮頸細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 干擾MLK7-AS1對SiHa/cDDP增殖的影響 與si-NC組比較，si-MLK7-AS1組細(xì)胞中miR-143表達(dá)水平升高(P<0.05)，細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，克隆形成數(shù)減少(P<0.05)，見表3。

表3 干擾MLK7-AS1對SiHa/cDDP增殖的影響

2.4 干擾MLK7-AS1對SiHa/cDDP凋亡的影響 干擾MLK7-AS1表達(dá)可明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡及Bax蛋白表達(dá)，而抑制Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.05)，見圖1和表4。

圖1 干擾MLK7-AS1對SiHa/cDDP凋亡蛋白表達(dá)的影響

表4 干擾MLK7-AS1對SiHa/cDDP凋亡的影響

2.5 MLK7-AS1靶向miR-143 LncBase v.2預(yù)測顯示，MLK7-AS1與miR-143存在結(jié)合位點，見圖2。miR-143過表達(dá)可明顯降低WT-MLK7-AS1的熒光素酶活性(P<0.05)，而未能抑制MUT-MLK7-AS1的熒光素酶活性，見表5。

圖2 MLK7-AS1靶向miR-143

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.6 抑制miR-143可逆轉(zhuǎn)干擾MLK7-AS1對SiHa/cDDP增殖凋亡的影響 共轉(zhuǎn)染si-MLK7-AS1與miR-143 inhibitor后可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖及Bcl-2蛋白表達(dá)，并可增強(qiáng)細(xì)胞克隆形成能力，抑制細(xì)胞凋亡及Bax蛋白表達(dá)(P<0.05)，見圖3、表6。

圖3 抑制miR-143可逆轉(zhuǎn)干擾MLK7-AS1對SiHa/cDDP凋亡蛋白表達(dá)的影響1:si-MLK7-AS1+NC;2:si-MLK7-AS1+miR-143 inhibitor

表6 抑制miR-143可逆轉(zhuǎn)干擾MLK7-AS1對SiHa/cDDP增殖凋亡的影響

3 討 論

宮頸癌的發(fā)病率與死亡率逐年上升，手術(shù)或化療可明顯提高治療效果，而患者生活質(zhì)量降低及順鉑耐藥的發(fā)生成為亟待解決的問題，因而如何逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性成為改善患者預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制LncRNA NCK1-AS1可提高宮頸癌對順鉑的敏感性[8]。LncRNA GAS5通過miR-21而充當(dāng)腫瘤抑制因子，可降低宮頸癌順鉑耐藥性[9]。LncRNA HOXD-AS1在宮頸癌順鉑耐藥性細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，沉默其表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞對順鉑的敏感性[10]。

抑制MLK7-AS1通過表觀遺傳調(diào)控miR-375抑制胃癌的生長[11]。MLK7-AS1通過下調(diào)p21表達(dá)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖[12]。MLK7-AS1在胃癌中呈高表達(dá)[13]。但MLK7-AS1在宮頸癌中的表達(dá)及其可能作用機(jī)制尚未闡明。本研究結(jié)果顯示，MLK7-AS1在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平高于正常宮頸細(xì)胞，且MLK7-AS1在宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞中的表達(dá)水平高于宮頸癌細(xì)胞，提示MLK7-AS1可能作為逆轉(zhuǎn)宮頸癌順鉑耐藥性的潛在靶標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，干擾MLK7-AS1表達(dá)可明顯降低細(xì)胞存活率，還可減少克隆形成細(xì)胞數(shù)，提示干擾MLK7-AS1表達(dá)可抑制宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞增殖。細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，Bcl-2在腫瘤中表達(dá)上調(diào)，其可抑制細(xì)胞凋亡，Bax的作用與之相反[14]。本研究結(jié)果顯示，干擾MLK7-AS1表達(dá)可明顯提高宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞凋亡率，促進(jìn)Bax的表達(dá)及抑制Bcl-2的表達(dá)，提示干擾MLK7-AS1表達(dá)可促進(jìn)宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞凋亡。

本研究通過雙熒光素酶報告實驗證實MLK7-AS1與miR-143存在靶向關(guān)系，MLK7-AS1可充當(dāng)miR-143競爭性內(nèi)源RNA分子，并可負(fù)向調(diào)控miR-143表達(dá)。LncRNA HOTAIR通過靶向miR-143-3p調(diào)節(jié)Bcl-2而促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展[15]。miR-143/145表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)肺癌發(fā)展[16]。LncRNA PVT1通過調(diào)節(jié)miR-143/HK2軸促進(jìn)膽囊癌進(jìn)展[17]。本研究結(jié)果顯示，miR-143在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平低于正常宮頸細(xì)胞，且miR-143在宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞中的表達(dá)水平低于宮頸癌細(xì)胞，而si-MLK7-AS1與miR-143 inhibitor聯(lián)合處理宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞后，細(xì)胞存活率升高，克隆形成能力增強(qiáng)，而凋亡率降低，提示抑制miR-143表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)干擾MLK7-AS1對宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞增殖及凋亡的作用。

綜上所述，宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞中MLK7-AS1表達(dá)上調(diào)，而miR-143表達(dá)下調(diào)，MLK7-AS1可靶向結(jié)合miR-143，并可負(fù)向調(diào)控miR-143的表達(dá)。體外細(xì)胞實驗證實，干擾MLK7-AS1表達(dá)可抑制宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞對順鉑的敏感性，其作用機(jī)制與靶向調(diào)控miR-143有關(guān)。MLK7-AS1/miR-143可能為逆轉(zhuǎn)宮頸癌順鉑耐藥的潛在靶標(biāo)，但關(guān)于MLK7-AS1/miR-143如何調(diào)控下游靶基因表達(dá)及其可能作用機(jī)制仍需深入探究。