蘇 堯,陳 莉,徐先明

(上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200080)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期常見(jiàn)并發(fā)癥之一，被美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)定義為“妊娠前無(wú)糖尿病，在妊娠中晚期診斷為糖尿病的人”[1]。隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活環(huán)境的改變，GDM發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，我國(guó)GDM發(fā)病率約為14.8%[2]。積極干預(yù)GDM的發(fā)生有利于減少圍產(chǎn)期的不良妊娠結(jié)局，包括流產(chǎn)、巨大胎兒和新生兒窒息[3]等。GDM病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未明確。目前研究證明，胰島素抵抗及胰腺β細(xì)胞分泌缺陷[4]，以及革蘭氏陰性菌的脂多糖介導(dǎo)的代謝性內(nèi)毒素血癥[5]等可能對(duì)GDM的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。腸道菌群作為人體的第十大系統(tǒng)——微生態(tài)系統(tǒng)，近年來(lái)成為代謝內(nèi)分泌領(lǐng)域的關(guān)注熱點(diǎn)。研究表明，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)作為腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌種[6]，所占比例約90%，其結(jié)構(gòu)比例的失調(diào)是肥胖和2型糖尿病的高危因素。Crusell等[7]通過(guò)16SrRNA基因測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)GDM孕婦的腸道菌群與2型糖尿病患者的菌群結(jié)構(gòu)改變相似。因此GDM與腸道菌群的關(guān)系也成為研究的熱點(diǎn)。本文旨在研究超重和肥胖人群在妊娠中期的腸道菌群構(gòu)成特征及其與GDM的關(guān)系，探討GDM的發(fā)生機(jī)制，以期為超重、肥胖孕婦的健康管理提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)選取2019年11月至2020年6月在上海市第一人民醫(yī)院產(chǎn)科門(mén)診規(guī)律產(chǎn)檢的88例孕婦作為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)本市常駐居民，上海松江地區(qū)普通飲食；(2)孕前未患糖尿病或糖耐量異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)多胎；(2)妊娠前患有糖尿病、高血壓、甲狀腺疾病、胃腸道或心血管疾病等內(nèi)外科疾??；(3)使用輔助生殖技術(shù)；(4)入組前2個(gè)月服用抗生素者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床信息收集 通過(guò)查閱門(mén)診電子病歷系統(tǒng)收集孕婦的相關(guān)臨床資料，包括身高、孕前體重、年齡、孕產(chǎn)次、血壓等。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)和分組 孕前BMI=孕前體重/身高2(kg/m2)。依據(jù)《中國(guó)成人超重和肥胖癥預(yù)防與控制指南》推薦標(biāo)準(zhǔn)，BMI≥24.0kg/m2和≥28.0kg/m2分別診斷成人超重(24.0kg/m2≤BMI<28.0kg/m2)和肥胖(BMI≥28.0kg/m2)[8]。GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2015年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)發(fā)布更新的糖尿病醫(yī)學(xué)診治標(biāo)準(zhǔn)[9]：空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)≥5.1mmol/L(92mg/dL),1h血糖(1-hour postprandial blood glucose,1h PBG)≥10.0mmol/L(180mg/dL),2h血糖(2-hour postprandial blood glucose,2h PBG)≥8.5mmol/L(153mg/dL)，出現(xiàn)以上任一血糖值即診斷為GDM。按孕前是否超重或肥胖及是否患GDM分為四組:組1(43例)：未超重(孕前BMI<24.0kg/m2)未患GDM組；組2(22例)：未超重患GDM組；組3(16例)：超重或肥胖(孕前BMI≥24.0kg/m2)未患GDM組；組4(n=7)：超重或肥胖(孕前BMI≥24.0kg/m2)患GDM組。

1.2.3 胰島功能評(píng)估 (1)胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment insulin resistance，HOMA-IR):HOMA-IR=空腹血糖水平(FPG，mmol/L)*空腹胰島素水平(FINS，U/mL)/22.5。(2)胰島素分泌指數(shù)(homeostasis model assessment insulin secretion,HOMA-IS):HOMA-IS=1/HOMA-IR。(3)胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(homeostasis model assessment beta cell function,HOMA-β):HOMA-β=20×空腹胰島素水平(FINS，mIU/L)/[空腹血糖水平(FBG，mmol/L)-3.5](%)。

1.2.4 糞便標(biāo)本采集及糞便DNA提取、擴(kuò)增、建庫(kù)及生物信息學(xué)分析 行OGTT當(dāng)天采集新鮮糞便，用采樣器采取2～3g或4樣品勺與保存液充分混勻，置-80℃保存。

采用Magnetic Fecal DNA Extraction Kit提取糞便標(biāo)本中總的菌群DNA量，使用ExKubit dsDNA HS分析試劑盒對(duì)提取出的DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，剔除不符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的樣本，利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)特異性擴(kuò)增16S rRNA的V3-V4可變區(qū)。使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。利用Illumina Hiseq2500平臺(tái)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序建庫(kù)，將獲得的序列通過(guò)Trimmomatic軟件，采用RDP classifer貝葉斯算法統(tǒng)計(jì)樣本的群落組成，并聚類(lèi)為操作分類(lèi)單位(operational taxonomic unit，OTU)，再與SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)物種分類(lèi)信息進(jìn)行注釋。使用Usearch軟件平臺(tái)對(duì)樣本進(jìn)行生物信息學(xué)分析包括物種的相對(duì)豐度、OTUs(物種豐富度)和α多樣性(Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù))。

2 結(jié) 果

2.1 四組孕婦的臨床資料比較 四組孕婦的年齡、采樣孕周、孕次、產(chǎn)次、收縮壓及舒張壓比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 四組孕婦腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)變化

2.2.1 四組孕婦腸道菌群門(mén)和屬水平相對(duì)豐度比較 在門(mén)水平上，88例孕婦孕中期腸道菌群標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)22個(gè)菌門(mén)，平均豐度前五位的菌門(mén)為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)。在屬水平上，88例孕婦腸道菌群標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)315個(gè)菌屬，平均豐度前八位的菌屬為擬桿菌屬(Bacteroides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、巨單胞菌屬(Megamonas)、瘤胃菌屬(Ruminococcaceae_UCG002)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、其他菌屬-A(Other_A)、Lachnoclostridiu、EscherichiaShigella。其中組4(孕前BMI≥24kg/m2且患GDM)孕婦厚壁菌門(mén)占比36%，明顯低于其他3組(54%、58%、56%)；擬桿菌門(mén)占比約50%，明顯高于其他3組(30%、28%、30%)；擬桿菌屬占比為48%，明顯高于其他三組(22%、20%、16%)。

2.2.2 各組之間的腸道菌群構(gòu)成比差異 (1)組3與組4比較：孕前BMI≥24kg/m2的孕婦中，孕中期發(fā)展為GDM的孕婦相較于血糖正常的孕婦厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)相對(duì)豐度明顯減少(P2=0.018和P2=0.047)，擬桿菌門(mén)和屬相對(duì)豐度均明顯增加(P2=0.030和P2=0.018),厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)=3/5。(2)組1與組2比較：孕前BMI<24kg/m2的孕婦中，孕中期發(fā)展為GDM的孕婦相較于血糖正常的孕婦巨單胞菌屬明顯降低(P1=0.044),厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)構(gòu)成無(wú)差異，其中厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)=5/3。(3)組1和組3比較：OGTT正常的孕婦，無(wú)論孕前BMI正常還是超重，孕婦的腸道菌群構(gòu)成在門(mén)和屬水平均無(wú)差異。見(jiàn)表2。

表1 88例孕婦的基本特征

表2 在門(mén)、屬水平四組研究對(duì)象菌群相對(duì)豐度比較

2.2.3 腸道菌群的多樣性及OTUs比較 無(wú)論孕前BMI大小和血糖水平差異，四組孕婦腸道菌群的多樣性和OTUs組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

2.3 四組孕婦胰島素水平及胰島素敏感指數(shù)比較 超重的兩組(組3、組4)孕婦的HOMA-IR、HOMA-IS和HOMA-β均高于孕前BMI正常的兩組(組1、組2)孕婦，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0<0.001，P0<0.001和P0=0.0010)。分別比較四組人群HOMA-IR：孕前BMI<24kg/m2時(shí)，GDM孕婦與非GDM孕婦的HOMA-IR、HOMA-IS和HOMA-β差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);孕前BMI≥24kg/m2時(shí)，GDM孕婦與非GDM孕婦的HOMA-IR、HOMA-IS和HOMA-β差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);非GDM孕婦，孕前BMI≥24kg/m2組HOMA-IR和HOMA-β明顯高于孕前BMI<24kg/m2組(P3=0.002和P3=0.022)，而HOMA-IS明顯降低(P3=0.002)；GDM孕婦，孕前BMI≥24kg/m2組較孕前BMI<24kg/m2組的HOMA-β明顯升高(P4=0.008)，HOMA-IR和HOMA-IS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表3 四組研究對(duì)象菌群α多樣性比較

表4 四組研究對(duì)象胰島素抵抗指數(shù)比較

2.4 四組孕婦菌群相對(duì)豐度與生化代謝指標(biāo)的關(guān)系 在門(mén)水平，厚壁菌門(mén)與1h PIN呈負(fù)相關(guān)(P<0.05,r=-0.219)，擬桿菌門(mén)與1h PIN和HOMA-β呈正相關(guān)(均P<0.05,r=0.260和r=0.246),變形菌門(mén)與2h PBG呈正相關(guān)(P<0.05,r=0.245)，瘤胃菌門(mén)與2h PIN和HOMA-β呈正相關(guān)(均P<0.05,r=0.229和r=0.248)。在屬水平上，擬桿菌屬與1h PIN和HOMA-β呈正相關(guān)(均P<0.01,r=0.305和r=0.284)，而與HOMA-IS呈負(fù)相關(guān)(P<0.05,r=-0.227)，糞桿菌屬與1h PIN呈負(fù)相關(guān)(P<0.05,r=-0.221)，其他菌屬-A與HOMA-IS呈正相關(guān)(P<0.05,r=0.257)，Lachnoclostridiu與高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05,r=-0.237)，而與甘油三酯(triglyceride,TG)呈正相關(guān)(P<0.05,r=0.243),見(jiàn)圖1。

圖1 88例孕婦腸道菌群與糖代謝及脂代謝指標(biāo)相關(guān)性的熱圖

3 討 論

腸道菌群作為人類(lèi)機(jī)體復(fù)雜的共生系統(tǒng)，其基因組的數(shù)量龐大，比人類(lèi)基因組大150倍[10]，與宿主共同進(jìn)化。繼Sanger測(cè)序的誕生，Sanger等[11]發(fā)明了16S rRNA測(cè)序，基于高變區(qū)(V1-V9)的保守序列來(lái)研究細(xì)菌類(lèi)群及其系統(tǒng)發(fā)育，揭開(kāi)了腸道菌群神秘的面紗。人類(lèi)腸道微生物由細(xì)菌、古細(xì)菌、真核生物、病毒和寄生蟲(chóng)五類(lèi)構(gòu)成[12]，但是腸道微環(huán)境主要有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，包括厚壁菌、擬桿菌、放線菌、梭菌、變形桿菌、疣微菌和藍(lán)細(xì)菌[13]，其中厚壁菌和擬桿菌占90%以上。腸道菌群主要通過(guò)四個(gè)方面發(fā)揮功能：新陳代謝、屏障保護(hù)、組織結(jié)構(gòu)和神經(jīng)系統(tǒng)[14]。腸道菌群具有多種酶，在結(jié)腸中，可消化掉攝入食物的10%～30%的能量[15]。研究發(fā)現(xiàn)，孕前超重孕婦在孕中期之前腸道中擬桿菌門(mén)和屬豐度較高，厚壁菌門(mén)豐度較低且血糖水平較高。Al-Attas等[16]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠的腸道菌群中，厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的比例出現(xiàn)了明顯的改變，前者相對(duì)豐度降低了50%，而擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度增加了50%,這與本研究結(jié)論一致。高脂飲食[17](high-fat diet，HFD)是肥胖發(fā)生的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，HFD導(dǎo)致小鼠腸道中的擬桿菌減少，而變形桿菌增加，其潛在機(jī)制可能與能量的收集和儲(chǔ)存以及增加了腸道的通透性和炎癥反應(yīng)有關(guān)。同樣，一項(xiàng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)[18]通過(guò)評(píng)估0～13歲兒童的腸道菌群和BMI，提出擬桿菌的減少和厚壁菌門(mén)的增加可能是肥胖兒童的重要觀察指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是相對(duì)豐度最高的兩大優(yōu)勢(shì)菌群，與上述文獻(xiàn)結(jié)果一致。在孕前超重的孕婦中，孕中期發(fā)展為GDM的孕婦相較于血糖正常的孕婦擬桿菌門(mén)和屬豐度增加，厚壁菌門(mén)/擬桿菌=3/5；在孕前BMI正常的孕婦中，孕中期發(fā)展為GDM的孕婦相較于血糖正常的孕婦巨單胞菌屬豐度降低，其中厚壁菌門(mén)/擬桿菌=5/3；OGTT正常的孕婦，無(wú)論孕前BMI正常還是超重，菌群構(gòu)成相似，其中厚壁菌門(mén)/擬桿菌=5/3。孕中期診斷為GDM的孕婦中，孕前超重的孕婦厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)比例倒置，孕前BMI正常孕婦厚壁菌門(mén)與擬桿菌比例正常，巨單胞菌屬豐度降低，因此，推斷不同體質(zhì)量指數(shù)孕婦導(dǎo)致GDM的菌群變化具有異質(zhì)性，擬桿菌與血糖水平關(guān)系更密切，尤其是擬桿菌的增加和厚壁菌門(mén)的減少，對(duì)機(jī)體血糖代謝水平的影響可能大于單純肥胖或超重的孕婦。通過(guò)分析GDM與非GDM孕婦的腸道菌群[19]發(fā)現(xiàn)，擬桿菌的相對(duì)豐度與OGTT結(jié)果呈明顯正相關(guān)。擬桿菌[20](革蘭氏陰性菌)的細(xì)胞壁含有復(fù)雜的脂多糖成分(LPS)，其脂類(lèi)部分作為內(nèi)毒素，可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的宿主免疫反應(yīng)，即代謝性內(nèi)毒素血癥。適度的炎癥反應(yīng)有利于機(jī)體抵抗外界的感染，過(guò)度的炎癥反應(yīng)則可能導(dǎo)致機(jī)體的代謝紊亂，引起胰島素抵抗、糖尿病和肥胖等疾病。Brugman等[21]利用抗生素治療BB-DP大鼠(1型糖尿病大鼠模型)，觀察最終的糖尿病發(fā)生率和胰島素水平以及腸道菌群的情況，發(fā)現(xiàn)未患糖尿病的大鼠表現(xiàn)出較低的擬桿菌水平。而在肥胖或超重的人群中，厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比率(F/B)升高[22]，有學(xué)者提出，厚壁菌門(mén)能更有效地促進(jìn)熱量的儲(chǔ)存，而擬桿菌主要參與多糖的酵解作用。

目前研究認(rèn)為，腸道菌群主要通過(guò)以下3方面參與機(jī)體的糖代謝和血脂代謝的調(diào)控：(1)胰島素抵抗：腸道菌群失調(diào)，革蘭氏陰性菌增加時(shí)，LPS大量釋放進(jìn)入外周循環(huán)系統(tǒng)，通過(guò)介導(dǎo)TLR4和MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)機(jī)體胰島素抵抗。(2)短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid butyrate，SCFAs)：SCFAs是腸道菌群對(duì)膳食纖維的發(fā)酵產(chǎn)物，GPRs家族中受體GPR41和GPR43是SCFAs參與糖脂代謝調(diào)節(jié)的兩個(gè)關(guān)鍵受體。GPR41通過(guò)調(diào)節(jié)腸道L細(xì)胞PYY的分泌，調(diào)節(jié)宿主的能量攝入；GPR43則通過(guò)調(diào)節(jié)腸道L細(xì)胞胞漿中Ca2+的釋放，增加胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的分泌。當(dāng)產(chǎn)SCFAs的細(xì)菌減少時(shí)，上述途徑出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致糖尿病和肥胖的發(fā)生。(3)次級(jí)膽汁酸：膽汁酸的轉(zhuǎn)化主要由擬桿菌、真細(xì)菌和梭菌屬的厭氧細(xì)菌進(jìn)行。腸道菌群利用膽酸鹽水解酶和膽固醇7α-羥化酶，將肝臟產(chǎn)生的原膽汁酸轉(zhuǎn)化為脫氧膽酸、熊脫氧膽酸等次級(jí)膽汁酸[23]，通過(guò)活化FXR和TGR5，從而調(diào)節(jié)能量代謝和胰島素敏感性[24]。

既往研究表明，肥胖和糖尿病人群容易發(fā)生胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，與本研究結(jié)果一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論血糖水平，超重孕婦的HOMI-IR較體重正常孕婦高，β細(xì)胞功能指數(shù)也較高，胰島素分泌指數(shù)較低；無(wú)論BMI大小的情況下，孕中期OGTT正常的孕婦中超重者存在胰島素抵抗現(xiàn)象。因此推測(cè)超重孕婦普遍存在胰島素抵抗現(xiàn)象，胰島分泌的胰島素更多。本研究顯示，孕前超重孕婦較BMI正常孕婦的HOMI-IR和HOMA-β指數(shù)顯著升高，雖然超重的GDM或非GDM孕婦的腸道菌群差異顯著，但是兩者之間的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)無(wú)差異。在孕前BMI正常的人群，GDM組較非GDM組的HOMI-IR和HOMA-β指數(shù)升高，HOMA-IS指數(shù)降低，表明GDM孕婦的胰島素抵抗水平明顯高于未患GDM的孕婦，但兩者腸道菌群構(gòu)成無(wú)差異。因此推測(cè)，在孕前體重正?；蚱莸脑袐D中，胰島素抵抗可能是導(dǎo)致其血糖升高的重要原因，但對(duì)于孕前超重或肥胖的孕婦，腸道菌群失調(diào)及代謝改變可能是影響GDM發(fā)生的重要機(jī)制。

本研究回顧性探究了不同BMI孕婦易患GDM的腸道菌群構(gòu)成，不同BMI的孕婦導(dǎo)致GDM的菌群變化具有異質(zhì)性，擬桿菌與血糖水平關(guān)系更密切，因此對(duì)于不同BMI的孕婦可進(jìn)行個(gè)性化的管理。但本研究仍存在不足之處:首先,研究時(shí)間只包含孕中期之前，沒(méi)有涵蓋整個(gè)孕期，無(wú)法得知整個(gè)孕期孕婦動(dòng)態(tài)的腸道菌群構(gòu)成，后續(xù)研究應(yīng)增加對(duì)孕早期、孕晚期及新生兒菌群構(gòu)成的研究；其次,本研究只局限于單一院區(qū)，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)行多中心研究使研究結(jié)論更具有科學(xué)性。

綜上所述，本研究中超重或肥胖且患GDM孕婦的腸道菌群構(gòu)成明顯改變、HOMA-IR較高，厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)的比例(F/B)顯著降低，其中擬桿菌門(mén)的增加和厚壁菌門(mén)的降低可能是孕前BMI偏高孕婦發(fā)生GDM的關(guān)鍵因素之一；而在孕前體重正?；蚱莸脑袐D中，擬桿菌和厚壁菌門(mén)比例和胰島功能正常，巨單胞菌屬豐度降低。因此，臨床上對(duì)于孕前超重或肥胖的孕婦在飲食上可注意補(bǔ)充膳食纖維或益生菌和益生元等，以利于菌群平衡尤其是厚壁菌門(mén)和擬桿菌們的平衡和正常的血糖水平，對(duì)于孕前體重正常或偏瘦的孕婦也應(yīng)注意飲食均衡和保持平衡的腸道微生態(tài)，以期降低人群患GDM的風(fēng)險(xiǎn)。